MICA基因多態(tài)性及單倍型多樣性與卵巢癌的易感關(guān)聯(lián)性研究

蔣麗琴，陳恩，王超

（1.南華大學(xué)附二醫(yī)院 湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附一醫(yī)院 湖南 衡陽(yáng) 430400）

MICA基因多態(tài)性及單倍型多樣性與卵巢癌的易感關(guān)聯(lián)性研究

蔣麗琴1，陳恩2，王超1

（1.南華大學(xué)附二醫(yī)院 湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附一醫(yī)院 湖南 衡陽(yáng) 430400）

目的探討中國(guó)南方漢族人群MICA等位基因多態(tài)性和卵巢癌發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)。方法采用PCRSSP及PCR-SBT方法對(duì)外周血標(biāo)本的目的基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果中國(guó)南方漢族卵巢癌組患者外周血標(biāo)本中檢測(cè)到11種MICA等位基因；和對(duì)照組相比較，MICA*010等位基因在卵巢癌組患者中分布頻率升高。卵巢癌患者組中檢測(cè)到5種MICA-STR等位基因，但其與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；卵巢癌患者組MICA*010/010純合子出現(xiàn)率增加，提示其對(duì)卵巢癌可能易感（＾OR=14.82，95%CI：1.89，115.94，P<0.05）。結(jié)論MICA等位基因多態(tài)性與中國(guó)南方漢族卵巢癌的發(fā)生有相關(guān)性。

MICA基因；基因多態(tài)性；卵巢癌

Abstract:ObjectiveTo study the association between theMICAgene polymorphism and haplotype diversity with the susceptibility of ovarian cancer.MethodsPCR-SSP and PCR-SBT were used to analyze the gene polymorphism and haplotype diversity of MICA in ovarian cancer patients and healthy individuals.ResultsEleven MICA allele genes were found in the south China ovarian cancer patients,and the frequency of MICA*010 was higher in south China ovarian cancer patients than in healthy controls,presenting genic susceptibility to ovarian cancer(O＾R=6.43,95%CI:3.51,11.76,P<0.05).Five MICA-STR alleles were detected,but there was no significant difference between the case and the control.Compared to the control group,the distribution frequency of MICA*010/010 was significantly high and it is probably a susceptibility genotype to ovarian cancer(O＾R=14.82,95%CI:1.89,115.94,P<0.05).ConclusionsMICAallele gene polymorphism and haplotype diversity may be associated with ovarian cancer.

Keywords:MICA alleles;gene polymorphism;ovarian cancer

卵巢癌（ovarian cancer，OC）患病率高，占婦科惡性腫瘤的23%，是導(dǎo)致成年女性死亡的常見疾病[1-2]。其預(yù)后差，目前沒有早期診斷的方法，據(jù)報(bào)道，在已經(jīng)確診的患者中，超過60%患者有腫瘤細(xì)胞的盆腔和（或）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，屬于Ⅲ期或Ⅳ期晚期病例，因此早期預(yù)防十分必要[3]。卵巢癌的發(fā)病機(jī)制與多種因素有關(guān)，以往的研究表明，遺傳背景也是其重要的發(fā)病原因之一。主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ類鏈相關(guān)基因A（MHC class I related chain A，MICA）與人體免疫及腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)，具有廣泛的多態(tài)性[4]。20世紀(jì)末，由美國(guó)SPIES教授首先報(bào)道[5]。以往的研究表明，MICA基因與多種疾病發(fā)生有關(guān)聯(lián)，尤其是腫瘤疾病，但暫無(wú)與中國(guó)南方人群卵巢癌患者易感性相關(guān)報(bào)道[6-8]。因此，本研究以卵巢癌患者作為研究對(duì)象，從MICA基因多態(tài)性這個(gè)角度觀察其與中國(guó)南方漢族卵巢癌之間是否具有關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2012年9月-2015年10月在南華大學(xué)附二醫(yī)院就診并通過病理學(xué)等檢查臨床明確診斷為卵巢癌的患者；對(duì)其TNM分期不做限制；患者除卵巢癌外不能合并其他有遺傳傾向的疾病。所有患者需在中國(guó)南方至少定居3代，且全部為漢族人群。招募到110例符合研究標(biāo)準(zhǔn)的患者，平均56.1歲（35～78歲）。招募124例健康志愿者，平均45.6歲（20～69歲），作為對(duì)照組。研究對(duì)象間無(wú)親屬關(guān)系。研究經(jīng)南華大學(xué)附二醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，符合相關(guān)要求。

1.2 基因的提取及分型

參考相關(guān)文獻(xiàn)，在外周血中提取DNA，對(duì)目標(biāo)基因分型[9]。本研究采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）與聚合酶鏈反應(yīng)-直接測(cè)序分型（polymerase chain reaction-sequence based typing，PCR-SBT）的方式[10-13]。PCR-SSP由設(shè)計(jì)的67個(gè)引物對(duì)組成。通過組合等方式，設(shè)計(jì)出不同基因型別所對(duì)應(yīng)的不同組合方式，繪制出格局表（引物序列和格局表同參考文獻(xiàn)[14]）；對(duì)每一標(biāo)本進(jìn)行68對(duì)PCR反應(yīng)（其中一孔為陰性對(duì)照），每次反應(yīng)都需加入內(nèi)參；內(nèi)參為人生長(zhǎng)激素基因，引物序列如下，正向引物：5'-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3'；反向引物：5'-GAGAAAGGCCTGGAGGATTC-3'。產(chǎn)物長(zhǎng)度 834 bp。

根據(jù)格局表可確立該標(biāo)本的MICA等位基因型；根據(jù)MICA分型格局表對(duì)MICA基因的等位基因型別進(jìn)行分析判斷。將獲得MICA等位基因的基因型別，采用Anthony Nolan Trust數(shù)據(jù)庫(kù)查詢獲得MICA-STR型別。部分如MICA*002：01與MICA*020等的基因型別無(wú)法用PCR-SSP方法檢出，也為驗(yàn)證PCR-SSP方法的可靠性，PCR-SBT方法對(duì)部分樣本的MICA等位基因進(jìn)行分型分析。擴(kuò)增引物和測(cè)序引物參見文獻(xiàn)[14]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

MICA等位基因頻率、MICA基因型頻率及遺傳平衡檢驗(yàn)（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）采用SHESIS軟件進(jìn)行計(jì)算獲得[11]；等關(guān)聯(lián)性分析用Logistic回歸分析；采用Fisher精確概率法對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)。P值采用Bonferroni校正后得到的Pc值在5%水平上進(jìn)行檢驗(yàn)[11]。

2 結(jié)果

2.1 兩組Hardy-Weinberg平衡吻合度情況

經(jīng)Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)分析表明，各等位基因的分布理論頻率與觀察頻率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明本實(shí)驗(yàn)所選樣本是符合Hardy-Weinberg平衡的隨機(jī)婚配群體。

2.2 MICA基因型確定

MICA基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖（見圖1），參照MICA分型格局表，判定該隨機(jī)研究對(duì)象。MICA基因型為MICA*010/010。

2.3 PCR-SBT方法檢測(cè)MICA基因

對(duì)研究對(duì)象基因組DNA擴(kuò)增MICA的PCR產(chǎn)物（2.2kb）（見圖2），每一泳道為1個(gè)個(gè)體的DNA樣本。對(duì)樣本經(jīng)基因測(cè)序所顯示的MICA基因（見圖3）。

圖1 MICA基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 隨機(jī)標(biāo)本MICA基因PCR結(jié)果

圖3 某研究對(duì)象MICA基因

2.4 MICA基因與中國(guó)南方漢族卵巢癌之間的相關(guān)性

中國(guó)南方漢族卵巢癌患者中共檢出11種MICA基因表型。其中，MICA*00201、MICA*010及MICA*019為最常見3種MICA表型，分別占20.90%、20.45%及19.55%。與健康對(duì)照組相比較，MICA*010等位基因在中國(guó)南方漢族卵巢癌組患者出現(xiàn)的頻率增高（20.45%vs 6.05%），可能對(duì)卵巢癌易感（=6.42，95%CI：3.51，11.76，P<0.05）。見表 1。

2.5 MICA-STR基因與中國(guó)南方漢族卵巢癌之間的相關(guān)性

MICA-STR等位基因中國(guó)南方漢族卵巢癌組觀測(cè)到5種，最高分布頻率的是MICA-A5，占40.0%，與健康組比較，中國(guó)南方漢族卵巢癌組的分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.6 中國(guó)南方漢族卵巢癌相關(guān)性同MICA單倍型多樣性的比較

對(duì)比結(jié)果顯示，MICA*010/010純合子基因型在中國(guó)南方漢族卵巢癌組中的出現(xiàn)頻率與健康組對(duì)比增高（10.91%vs 0.82%），提示其可能為易感基因型（=14.83，95%CI：1.89，115.94，P<0.05）。見表 3。

表1 MICA各等位基因型頻率比較

表2 MICA-STR各等位基因頻率比較

表3 MICA各等位基因型頻率比較

續(xù)表3

3 討論

目前，在全世界范圍內(nèi)已有許多學(xué)者研究不同基因類型與卵巢癌發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。黃娟等人[15]研究表明，卵巢癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與IL-6基因有一定關(guān)聯(lián)；陳平平等人[16]研究發(fā)現(xiàn)，XRCC3基因與卵巢癌的發(fā)生存在相關(guān)性；李琰等[17]報(bào)告，MMP-12、13啟動(dòng)子區(qū)A/G型為卵巢癌易感因素；本研究表明，遺傳條件對(duì)卵巢癌發(fā)病有明顯的影響。

MICA基因存在廣泛的多態(tài)性，許多疾病，如免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤均與其有關(guān)[12-13，18]。本研究檢測(cè)中國(guó)南方漢族人群卵巢癌患者及正常對(duì)照人群的MICA基因多態(tài)性，實(shí)驗(yàn)顯示，有11種MICA等位基因在卵巢癌患者組被檢測(cè)出，其中，MICA*00201、MICA*010和MICA*019是患者組中分布頻率最高的3種MICA等位基因；與健康對(duì)照組相比較，MICA*010等位基因在中國(guó)南方漢族卵巢癌患者中出現(xiàn)的頻率增高，MICA*010等位基因?yàn)橹袊?guó)南方漢族卵巢癌的可疑相關(guān)基因（=6.42，95%CI：3.51，11.76，P<0.05）。MICA-STR等位基因中國(guó)南方漢族卵巢癌組觀測(cè)到5種，最高分布頻率的是MICA-A5，占40.0%，與健康組比較，中國(guó)南方漢族卵巢癌組的分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。以上結(jié)果表明，MICA等位基因與卵巢癌的發(fā)病有一定關(guān)聯(lián)。由于MICA基因的產(chǎn)物能夠與多種免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜上的受體發(fā)生作用，從而是多種免疫細(xì)胞在抑制腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用，故在本研究中，筆者推測(cè)可能是某些MICA基因的類型的個(gè)體，其MICA基因的生物學(xué)活力下降、產(chǎn)物不能很好地促進(jìn)免疫細(xì)胞發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生的作用，從而導(dǎo)致最終卵巢癌的發(fā)生[11]。GAMBELUNGHE等發(fā)現(xiàn)，MICA-A5.1基因與SLE 的易感關(guān)系明顯[11，19]，邢永華研究組報(bào)告MICA-A5.1基因與胃癌的發(fā)生有關(guān)[11，20]，同時(shí)可以觀察到許多其他的病種也和MICAA5.1 基因相關(guān)[11，21-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，MICA-STR等位基因的分布頻率在兩組中無(wú)差異。引起該結(jié)果的原因可能有以下幾點(diǎn)：①不同腫瘤細(xì)胞具有不同的特性，雖然該基因與其他疾病密切相關(guān)，但確實(shí)與卵巢的發(fā)生相關(guān)性不高[11]。②標(biāo)本數(shù)量偏少，一種MICASTR型別包括多種等位基因，如MICA-A5.1包括MICA*008、MICA*23、MICA*28及MICA*054等位基因，需要更多的樣本來(lái)反映該等位基因的分布規(guī)律。③MICA在卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)過程中脫落[23-24]，產(chǎn)生所謂的腫瘤免疫逃逸現(xiàn)象[11]。

本研究選擇的研究對(duì)象為中國(guó)南方漢族人群，以往的研究已經(jīng)證實(shí)，MICA基因型會(huì)在各種人群表現(xiàn)出差異。因此，將來(lái)仍需選取其他不同人群作為研究對(duì)象，觀察其他人群中，卵巢癌的發(fā)生與MICA基因多態(tài)性之間的關(guān)系，為將來(lái)了解卵巢癌的發(fā)生與不同基因型之間的關(guān)系打下基礎(chǔ)。

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Association betweenMICAgene polymorphism and haplotype diversity with ovarian cancer

Li-qin Jiang1,En Chen2,Chao Wang1
(1.The Second Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China；2.The First Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 430400,China)

R392.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.010

1005-8982（2017）15-0047-06

2017-04-21

王超，E-mail：317249741@qq.com；Tel：13786404481