半楓荷快速繁殖技術及改進研究

林文革，毛新，林琛

（地緣（廈門）生物科技有限公司，福建廈門361006）

半楓荷快速繁殖技術及改進研究

林文革，毛新，林琛

（地緣（廈門）生物科技有限公司，福建廈門361006）

本研究提供了一種新的半楓荷快速繁殖體系，以優(yōu)良種源的半楓荷的莖段為外植體，誘導叢生芽增殖、生根、組培苗馴化移栽而建立起半楓荷完整的快速繁殖體系。目的是提供一種簡單、誘導率高、成活率高的半楓荷的完整組培快繁方法。并且進一步通過組培組分的優(yōu)化，使增殖率達到理想程度的3～4倍，生根率穩(wěn)定在95%以上，移栽成活率達到95%以上。利用此方法可以簡單、高效地培育出大量的半楓荷組培苗，從而有效地保護和繁殖該物種，滿足市場對半楓荷的需求，同時解除半楓荷的瀕危狀態(tài)，為今后更進一步保護和利用該物種奠定良好的基礎。

半楓荷；組織培養(yǎng)；快速繁殖；瀕危植物

半楓荷(Semiliquidambar cathayensis)為金縷梅科半楓荷屬植物，為1962年發(fā)表的新屬半楓荷屬模式種，我國特有種[1]。該物種在學術研究、中醫(yī)藥用以及園林應用等很多方面都具有極高的價值。但是人為的不合理開發(fā)利用，導致其資源被破壞嚴重。半楓荷在1987年國家環(huán)境保護局等頒布的《中國珍稀瀕危保護植物名錄（第一冊）》中，被列為國家三級重點級保護植物；在1992年傅立國主編的《中國植物紅皮書—稀有瀕危植物》中被列為稀有種；在國務院1999年8月4日頒布的《國家重點保護野生植物名錄（第一批）》中被提升為國家II級保護植物。在2003年，汪松、解焱主編的《中國物種紅色名錄》中有關專家根據(jù)數(shù)據(jù)資料推測，半楓荷在過去3個世代內(nèi)致危因素沒有停止，種群至少減少了30%，因此將半楓荷列入易危等級，在未來一段時間內(nèi)其種群面臨絕滅的概率較高。

半楓荷是一種珍貴的藥用植物，根、枝、樹皮都可入藥，能活血通絡、祛風除濕，可以治療風濕性關節(jié)炎、腰肌勞損、半身不遂、跌打淤積、腫痛、產(chǎn)后風癱，外傷常用于止血，是產(chǎn)區(qū)群眾常用的中藥，具有很高的藥用價值[2-4]。目前，半楓荷作為重要的中藥已得到了廣泛的重視和開發(fā)。如半楓荷散、中藥巴布劑、半楓荷類注射液、苗嶺骨力膠囊等[5,6]。

由于半楓荷對生態(tài)環(huán)境的要求比較苛刻，其自然繁殖率較低，加上人們長期的過量采挖，野生資源已經(jīng)極度枯竭。面對這樣嚴峻的形勢，對半楓荷的人工繁殖問題的研究是極為重要的。植物組織無菌培養(yǎng)方法是尋求解決半楓荷資源枯竭、保護其優(yōu)良品種的有效途徑。近年來，人們對半楓荷的藥用成分及價值的研究日益增多[7-9]，目前對半楓荷進行完整過程的組培育苗研究還未見報道，組培無菌培養(yǎng)快速繁殖方面多以莖段和葉片為外植體誘導。

植物的組織培養(yǎng)指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細胞、原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他產(chǎn)品的技術。不同植物在離體培養(yǎng)過程中對基本培養(yǎng)基類型、激素配比、培養(yǎng)條件等要求不同。目前利用植物組織培養(yǎng)技術在開展植物種質(zhì)資源保護和生產(chǎn)經(jīng)濟苗木等方面技術已日趨完善?，F(xiàn)有技術大部分是以半楓荷葉片為外植體誘導愈傷，通過愈傷組織增殖，在誘導愈傷組織分化成芽，且未誘導出不定根。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料取自福建三明沙縣、福建漳州南靖、江西贛州新余、江西贛州全南縣4個不同種源的半楓荷。

1.2 培養(yǎng)條件

芽誘導培養(yǎng)基成分：改良MS培養(yǎng)基、6-BA 1.5～2.5 mg/L、NAA 0.2～0.4 mg/L、蔗糖30 g/L、卡拉膠6.7 g/L，pH值5.8～6.0；芽增殖培養(yǎng)基成分：改良MS培養(yǎng)基、6-BA 0.4～0.8 mg/L、NAA 0.05～0.15 mg/L、蔗糖30 g/L、卡拉膠6.7 g/L，pH值5.8～6.0；生根培養(yǎng)基成分：改良MS培養(yǎng)基、IBA 0.4～0.8 mg/L、NAA 0.1～0.3 mg/L、蔗糖30 g/L、卡拉膠6.7 g/L，pH值5.8～6.0；MS培養(yǎng)基、改良MS培養(yǎng)基、1/2改良MS培養(yǎng)基組成如表1、2、3所示。

1.3 實驗方法

1.3.1 半楓荷優(yōu)良種源確定

分別檢測取自福建三明沙縣、福建漳州南靖、江西贛州新余、江西贛州全南縣4個不同種源的半楓荷的齊墩果酸含量，獲得優(yōu)良種源——江西贛州全南縣半楓荷和福建三明沙縣半楓荷，以此優(yōu)良種源開展后續(xù)的組培研究，見圖1。

1.3.2 無菌材料的建立

取半楓荷的當年生枝條為外植體。在合適時間，一般最優(yōu)時間為連續(xù)晴天7 d后于12：00 AM～2∶00 PM取材，并將此優(yōu)良母株當年生枝條為外植體。對外植體進行消毒處理獲得無菌材料，首先將其用洗潔精清洗并浸泡10 min，再用流動水沖洗30 min后，置于無菌操作臺上，剪成帶有1～2個節(jié)間的莖段。將莖段用75%的乙醇處理25 s，再用0.1%升汞溶液浸泡處理10 min，期間不斷震蕩，最后用無菌水徹底清洗6遍，備用。

表1 MS組分

表2 改良MS組分

1.3.3 芽誘導培養(yǎng)

將無菌材料接種于芽誘導培養(yǎng)基上，在溫度為25～27℃、光照強度為3 000～5 000 lx、光照時間為8～12 h/d的條件下，誘導培養(yǎng)出不定芽觀察并記錄芽的長勢，14 d后測量腋芽的高度，計算芽的誘導率。觀察記錄完成后，進行下一步實驗操作。

表3 1/2改良MS組分

圖1 半楓荷優(yōu)良母株

1.3.4 半楓荷組織培養(yǎng)的芽增殖與生根

將誘導培養(yǎng)出的不定芽轉接至芽增殖培養(yǎng)基中，在溫度為25～27℃、光照強度為3 000～5 000 lx、光照時間為8～12 h/d的條件下，觀察記錄新芽的生長情況，統(tǒng)計其增殖系數(shù)。將生長狀況良好、長度為2～3 cm的不定芽轉接至生根培養(yǎng)基中，溫度為25～27℃、光照強度為3 000～5 000 lx、光照時間為8～12 h/d。觀察并記錄生根時間、根的長度，計算生根率。

1.3.5 移栽大田

將生根瓶苗轉至移栽大棚進行煉苗。7 d后將其從瓶中小心取出，洗凈根部培養(yǎng)基后，用0.1%代森錳鋅浸泡處理2～3 min后，在陰涼處干燥，待植株枝干上的水分陰干的差不多時，移栽入事先已用0.1%高錳酸鉀消毒的基質(zhì)（泥炭土∶草炭∶珍珠巖為9∶6∶1）中。移栽后做好田間濕度管理，最后觀察記錄并計算成活率。

1.3.6 優(yōu)化組培配方

在以莖段為外植體的組培快繁過程中，改良MS培養(yǎng)基中的大量元素NH4NO3、KNO3的濃度，具體變化見表2、表3。并且在芽誘導培養(yǎng)基、芽增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中調(diào)整激素濃度，添加稀土元素，增加Vc控制褐化，達到理想的增殖率、生根率。

1.3.7 計算方法

誘導率（%）=外植體起動個數(shù)/接種外植體總數(shù)× 100%；

增殖系數(shù)=現(xiàn)有不定芽數(shù)/接種不定芽數(shù)×100%；

生根率（%）=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%；

成活率（%）=（成活株數(shù)／接種株數(shù)）×100%。

2 結果與分析

2.1 半楓荷不定芽的誘導培養(yǎng)

將無菌材料接種于芽誘導培養(yǎng)基上，在合適的溫度、光照強度、光照時間條件下，培養(yǎng)14 d后誘導出了2～3 cm的不定芽，經(jīng)過計算得到誘導率為70%。

2.2 芽增殖與生根

將生長良好的愈傷組織轉接入增殖培養(yǎng)基中，進行增殖培養(yǎng)。約7 d后可見不定芽與培養(yǎng)基接觸的地方冒出新的芽點，28 d后統(tǒng)計其增殖系數(shù)為5.62%，葉片顏色正常，瓶苗生長狀況良好，如圖2和圖3所示。將不定芽轉接至生根培養(yǎng)基中，5 d后可見其莖段末端切口處冒出白色根原基，繼續(xù)培養(yǎng)14 d后長成2～3 cm的根，如圖4所示。計算得到此時的生根率達到98.7%。

2.3 生根瓶苗移栽大田研究

將生根瓶苗轉至移栽大棚，如圖2所示進行穴盤移栽，在合適的溫度、濕度等條件的控制下，最終移栽成活率達到94.2%，得到半楓荷移栽苗木，見圖3。

2.4 組織培養(yǎng)優(yōu)化

以當年生半楓荷莖段為外植體，通過調(diào)整培養(yǎng)基成分中的大量元素和激素濃度，添加稀土元素，增加Vc控制褐化，最終達到理想的增殖率3～4倍，生根率穩(wěn)定在95%以上，移栽成活率達到95%以上。

3 討論與結論

圖2 半楓荷穴盤移栽

圖3 半楓荷移栽苗木

圖4 半楓荷不定芽生根結果

利用優(yōu)良種源的當年生半楓荷的莖段作為外植體，能直接誘導出芽，芽再增殖生根，這是木本植物快繁的主要途徑，生物學特性比較穩(wěn)定[9,10]。而本研究在莖段為外植體，直接誘導不定叢生芽，避免了現(xiàn)有技術中用愈傷分化叢生芽易出現(xiàn)變異的情況，再通過不定叢生芽的增殖、生根培養(yǎng)、組培苗的馴化移栽、組培成分優(yōu)化，最后建立起半楓荷完整的快速繁殖體系，并能夠很好地保持原品種特征。并且通過改變MS培養(yǎng)基中的大量元素NH4NO3、KNO3的濃度，在培養(yǎng)基中調(diào)整激素濃度，添加稀土元素，增加Vc控制褐化，達到理想的增殖率，生根率。

本研究的誘導率是用莖段誘導不定芽的誘導率，全南縣來源的半楓荷的誘導率可以達到70%的水平，并且通過不定從芽的增殖，其增殖系數(shù)高達5.62，并且生根率和移栽成活率均較高，分別達到了98.7%和94.2%。對于沙縣來源的半楓荷進行了相同的操作流程，組培成分改進優(yōu)化后，其增殖系數(shù)超過預期目標的3～4倍，生根率和移栽成活率均超過了95%。因此，利用此方法可以簡單的、高效的培育出大量的半楓荷組培苗，從而有效地保護和繁殖該物種。

同時，本研究是依據(jù)供試材料取自福建三明沙縣、福建漳州南靖、江西贛州新余、江西贛州全南縣4個不同種源的半楓荷。重點對于江西贛州全南縣以及福建三明沙縣來源的半楓荷進行試驗觀測，實驗結果均表現(xiàn)出優(yōu)秀的增殖系數(shù)、生根率以及成活率，具一定的普適性，對生產(chǎn)有更強的指導意義。

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