基于LCQTOFMS/MS技術分析不同產地杜仲的差異化學成分

嚴穎　趙慧　鄒立思　劉訓紅　柴川　王勝男　華愉教

[摘要]為了探討生態(tài)環(huán)境對杜仲代謝物合成積累的影響，本文采用液相色譜串聯(lián)三重四級桿飛行時間高分辨質譜（LCQTOF MS/MS）結合多元統(tǒng)計分析技術對不同產地杜仲中化學成分差異性進行研究。通過二級串聯(lián)質譜分析，對其質譜數據進行峰匹配、峰對齊、濾噪處理等，并進行特征峰提取；用主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLSDA）進行數據處理；根據一級質譜精確質荷比和二級質譜碎片信息，結合軟件數據庫搜索、標準品比對及相關文獻進行成分鑒定。結果顯示，3個不同產地杜仲樣品間的化學組成得到有效區(qū)分；初步鑒定出23個差異化學成分，其中14種共有差異化學成分呈現不同的變化規(guī)律。該結果為揭示生態(tài)環(huán)境對杜仲代謝物合成積累的影響規(guī)律提供基礎資料。

[關鍵詞]杜仲； 液相色譜串聯(lián)三重四極桿飛行時間高分辨質譜； 產地； 化學成分

[Abstract]In order to study the influence of ecological environment regarding the synthesis and accumulation of metabolites in Eucommiae Cortex， LCQTOF MS/MS method combined with multivariate statistical analysis was used to analyze the differences of chemical constituents in Eucommiae Cortex from different habitats Through the analysis of the multistage tandem mass spectrometry， the characteristic peaks were extracted with mass spectrometry data peak matching， peak alignment， and noise filtering Principal component analysis （PCA） and partial leastsquares discriminant analysis （PLSDA） were used for data processing The chemical constituents were identified or tentative presumed according to MS accurate mass and MS/MS spectrometry fragmentation information， combined with the software of database search， comparison with reference standards and literature The results show the differences among samples of Eucommiae Cortex from different habitats are distinguishable A total of 23 chemical constituents in Eucommiae Cortex were identified or tentative presumed Among of them， 14 kinds of common differential chemical constituents （aucubin， geniposidic acid， neochlorogenic acid， syringin， olivil4′，4′diOβDglucopyranoside， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， 1hydroxypinoresinol 4′，4′diOβDglucopyranoside， caffeic acid， pinoresinoldiOβDglucopyranoside， syringaresionldiOβDglucopyranoside， pinoresinol4′OβDglucopyranoside， eucommiol， isochlorogenic acid C and asiatic acid） presented different changing laws This study provides basic information for revealing the influence law of ecological environment on the biosynthesis of metabolites in Eucommiae Cortex

[Key words]Eucommiae Cortex； LCQTOF MS/MS； habitats； chemical constituents

杜仲為我國特有的名貴藥材，藥用歷史悠久，始載于《神農本草經》，列為上品，來源于杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oilv的干燥樹皮，具有補肝腎、強筋骨、安胎之功效，用于肝腎不足，腰膝酸痛，筋骨無力，頭暈目眩，妊娠漏血，胎動不安等癥[1]?，F代研究表明，杜仲含有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、多糖等多類藥效活性成分，具有降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗菌抗病毒、保肝護腎、抗骨質疏松等多方面藥理作用[23]。杜仲屬落葉喬木，在我國主要分布在秦嶺以南華中地區(qū)的四川、貴州、湖南、湖北、陜西等省。近年來我國杜仲引種栽培，資源不斷擴大，市售杜仲藥材主要為栽培品。由于杜仲植物地理分布廣，形體變化大，藥材品質差異大，藥材質量參差不齊，難以實現商品藥材標準化[4]。目前對杜仲藥材的研究主要集中于化學成分、藥理作用和品質評價方面，對于不同產地杜仲藥材的研究主要集中于主要成分含量變化，亦有指紋圖譜研究，紫外譜線組鑒別等[57]，運用植物代謝組學技術分析不同產地杜仲中化學成分差異的研究還很少。

植物代謝組學技術是對植物提取物中代謝組進行高通量、無偏差全面分析的技術，特別適合于中藥中多組分復雜體系的分析[8]，使中藥研究更符合祖國醫(yī)學的整體觀念。本實驗借鑒植物代謝組學的研究思路和方法，采用液相色譜串聯(lián)三重四極桿飛行時間高分辨質譜（LCQTOF MS/MS）技術分析不同產地杜仲化學成分的差異性，并通過多元統(tǒng)計分析找出差異顯著的化學成分及其變化規(guī)律，為揭示生態(tài)環(huán)境對杜仲代謝產物合成積累的影響規(guī)律及探討杜仲藥材的品質形成機制提供基礎資料。

1材料

QTOFTM 5600 SystemMS/MS電噴霧飛行時間高分辨質譜儀（配備Peakview 12數據處理工作站，美國Sciex公司）；SIL20A XR超快速液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Anke TGL16B離心機（上海安亭科學儀器有限公司）；BSA224S 電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ500B型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；MilliQ超純水制備儀（美國Millipore公司）。

乙腈、甲酸（色譜純，德國Merck公司）；甲醇（批號143135，色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；實驗用水由MilliQ純水器制備的超純水。

杜仲樣品分別于2016年5月實地采集于貴州湄潭、湖北利川和陜西寧強，每個產地5份樣品，經南京中醫(yī)藥大學藥學院劉訓紅教授鑒定為杜仲科植物杜仲E ulmoides的干燥樹皮。留樣憑證保存于南京中醫(yī)藥大學中藥鑒定實驗室。

2方法與結果

21供試品溶液的制備

精密稱取樣品粉末06 g，精密加入50%甲醇30 mL，密閉，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率30 kHz）20 min，放置冷卻，再次稱定質量，用50%甲醇補足質量損失，過濾，濾液以12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，過022 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

22實驗條件

221色譜條件色譜柱Agilent ZORBAX SBC18柱（46 mm ×250 mm，5 μm）；流動相A為01%甲酸水溶液，B為乙腈， 梯度洗脫， 洗脫程序為 0～10 min， 5%～10% B，10～12 min， 10%～15% B，12～22 min， 15%～20% B，22～35 min， 20%～30% B，35～42 min，30%～60% B，42～55 min，60%～85% B，55～57 min，85%～5% B，57～60 min，5%B；柱溫30 ℃；流速10 mL·min-1；進樣量10 μL。

222質譜條件電噴霧離子源（ESI）負離子模式；質量掃描范圍m/z 50 ～ 1 500；氣簾氣壓力（CUR）為2758 kPa；霧化氣壓力（GS1）為3792 kPa；輔助氣壓力（GS2）為3792 kPa；離子源溫度（TEM）為550 ℃；噴霧電壓（IS）為-4 500 V；脫簇電壓（DP）為-100 V。

23樣品處理方法的選擇

供試品溶液的制備中分別考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇3種溶劑，結果表明50%甲醇為溶劑的色譜峰峰形優(yōu)于其他2種溶劑。又考察超聲提取10，20，40，60 min，結果表明超聲提取20 min相對峰面積較大。

24色譜條件的優(yōu)選

流動相的選擇分別考察了甲醇水、乙腈水、甲醇01%甲酸水、乙腈01%甲酸水及梯度洗脫條件下對樣品中各峰分離度的影響，結果發(fā)現，采用乙腈01%甲酸水溶液梯度洗脫時，峰型較好且有良好的分離效果。最終確定了最佳的色譜條件。

25樣品分析

根據設定的液相色譜質譜條件，取供試品溶液進樣分析。不同產地杜仲樣品在負離子模式下的LCQTOF MS/MS基峰強度離子流（BPI）色譜圖，見圖1。

26多元統(tǒng)計分析

將原始質譜數據和色譜圖導入Peakview 12進行峰匹配、峰對齊、濾噪處理等，結果導入SIMCAP 130進行分析。采用主成分分析（PCA），通過初步觀察各樣品的聚集情況，直觀地表達不同產地杜仲的化學組成差異；隨后以偏最小二乘辨別分析（PLSDA）分別對各樣品進行分類，其中R2X，R2Y越接近1表示模型越穩(wěn)定，Q2 >05表示預測率高。根據PLSDA模型得到的變量權重值（VIP >1）找到潛在的差異化學成分。采用t檢驗，驗證多維統(tǒng)計中找到的差異化學成分是否在單維統(tǒng)計中具有顯著性差異，其中P<005有顯著性差異。

261PCA分析主成分分析也稱為主分量分析，旨在利用降維的思路將原來變量重新組合成一組新的互相無關的幾個綜合變量，同時根據實際情況從中選取幾個較少的綜合變量，盡可能多的反映原來變量信息的統(tǒng)計方法。采用PCA多變量模式識別方法對3個產地杜仲樣品進行降維分析。3個產地杜仲PCA分析的散點圖（t[1]：680%；t[2]：239%），見圖2，可以看出，3個產地杜仲樣品分布在不同區(qū)域，分類結果較為理想，說明3個產地的杜仲樣品的化學成分存在明顯差異。

262PLSDA分析PLSDA分析是一種有監(jiān)督的模式識別方法，本文中用于確定不同產地杜仲之間的差異變量，即差異化學成分。常用變量載荷評價參數（VIP）值用于描述變量的貢獻程度，一般認為當VIP >1時，該變量是重要的。首先對貴州湄潭和湖北利川2個產地的杜仲樣品進行PLSDA分析，在散點圖中2個產地的樣品可以明顯的分開，見圖3a。模型驗證結果（R2Y=0999，Q2=0999）顯示其有效可靠。與無監(jiān)督模式的主成分分析（PCA）相比較，2個產地的杜仲樣品得到更大程度的分離，且有助于尋找差異的化學成分。VIP的得分圖見圖3b顯示，對2組分類貢獻較大的差異性成分（VIP>1）的共有114個特征峰。

對貴州湄潭和陜西寧強2個產地的杜仲樣品進行PLSDA分析，2個產地的樣品區(qū)分明顯，見圖4a。模型驗證結果（R2Y=0999，Q2=0999）證明其可靠程度較高。根據VIP得分圖，見圖4b，所示對2組分類貢獻較大的差異性成分（VIP>1），得到99個特征峰。

對湖北利川和陜西寧強的杜仲樣品進行PLSDA分析，在其散點圖中兩者可以明顯得到區(qū)分，見圖5a。模型驗證顯示其有效可靠（R2Y=0999，Q2=0998），同樣對VIP得分圖，見圖5b，進行考察，得到119個特征峰。

27差異化學成分的鑒定

通過一級質譜確定精確相對分子質量，二級質譜獲得裂解信息，結合HMDB（http： //www hmdb ca/）和METLIN（http： //metlin Scripps edu /）數據庫搜索、對照品比對及已報道文獻[922]對VIP>1且P<005的差異化學成分進行結構鑒定，初步鑒定出23個化學成分，結果見表1。

28共有差異化學成分的相對含量變化

所分析的3個不同產地杜仲樣品中共有14個為共有差異化學成分，提取各共有差異成分在各組樣品間對應的峰面積代表其相對含量，對不同產地杜仲樣品間同一物質峰面積的平均值標準差進行計算，得到共有差異成分在不同產地杜仲間的相對含量變化，見圖6。其中除咖啡酸和松脂醇單葡萄糖苷含量以陜西寧強產的較高，積雪草酸以湖北利川產較高外，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、新綠原酸、橄欖素二葡萄糖苷、綠原酸、隱綠原酸、1羥基松脂素二葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香素二葡萄糖苷、杜仲醇和異綠原酸C均以貴州湄潭產的含量較高。

3討論

建立了基于LCQTOF MS/MS結合多元統(tǒng)計分析技術的不同產地杜仲化學成分差異的分析方法，并從樣品制備、色譜圖分析、數據處理等方面進行探討。PCA分析結果顯示不同產地杜仲樣品在PCA軸上呈逐步變化的趨勢，可以看出3個產地杜仲樣

品分布在不同區(qū)域，分類結果較為理想，說明3個產地的杜仲樣品的化學成分存在明顯差異。所鑒定的3個不同產地杜仲樣品中的23個差異化學成分中有14個為共有差異化學成分，分別為：桃葉珊瑚苷、

京尼平苷酸、新綠原酸、橄欖素二葡萄糖苷、綠原酸、隱綠原酸、1羥基松脂素二葡萄糖苷、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷、丁香素二葡萄糖苷、松脂素單葡萄糖苷、杜仲醇、異綠原酸C和積雪草酸。其中，松脂醇二葡萄糖苷為2015年版《中國藥典》中杜仲的含量測定質量評價指標，松脂醇二葡萄糖苷相對含量以貴州湄潭產的較高，其他共有差異化學成分，除咖啡酸和松脂素單葡萄糖苷含量以陜西寧強產的較高，積雪草酸以湖北利川產較高外，均以貴州湄潭產的含量較高。該實驗結果可為揭示生態(tài)環(huán)境對杜仲代謝產物合成積累的影響規(guī)律以及探討杜仲藥材的品質形成機制提供基礎資料。

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[責任編輯丁廣治]