黃芪丹參水煎液抑制ISO誘導的大鼠心肌重構(gòu)及其下調(diào)STIM1 TRPC1 CaN和NFATc3表達的機制

王新東　祁曉霞　卞勇　陳曉棟　張一炎　方祝元

[摘要]探討黃芪丹參水煎液（HDD）對異丙腎上腺素（ISO）誘導大鼠心肌重構(gòu)抑制作用和對STIM1，TRPC1，CaM，CaN，NFATc3表達的影響。 皮下注射 ISO（25 mg·kg-1·d-1，14 d）建立大鼠心肌重構(gòu)模型，隨機分為對照組、ISO模型組、HDD5（HDD 5 g·kg-1·d-1+ISO）組、HDD10（HDD 10 mg·kg-1·d-1+ISO）組。干預(yù)4周后，計算心臟質(zhì)量指數(shù)（HW/BW）和左心室質(zhì)量指數(shù)（LVW/BW）；超聲心動圖觀察心肌結(jié)構(gòu)；HE染色觀察心肌組織病理學結(jié)構(gòu)變化；ELISA檢測血清中 BNP，CaN和CaM kinases Ⅱ的水平；Western blot檢測左心室組織 STIM1，TRPC1，pCaN，pNFATc3和NFATc3蛋白的表達。結(jié)果顯示，ISO組大鼠HW/BW和LVW/BW均大于HDD5組和HDD10組（P<005）；超聲心動圖檢查結(jié)果顯示，HDD能夠抑制 ISO誘導的LVEDD，LVESD增加；ELISA檢測顯示，HDD能明顯抑制ISO致心肌重構(gòu)大鼠血清中BNP，CaN和CaM kinases Ⅱ含量的升高（P<001）。Western blot 檢測結(jié)果顯示，ISO組大鼠心肌組織STIM1，TRPC1，pCaN，pNFATc3和NFATc3表達升高，HDD給藥后心肌組織內(nèi)STIM1，TRPC1，pCaN，pNFATc3和NFATc3的表達均降低（P<005）。 結(jié)果表明，黃芪丹參水煎液具有抑制ISO致大鼠心肌重構(gòu)的作用，其機制與下調(diào)STIM1，TRPC1，CaM kinases Ⅱ，pCaN/CaN和pNFATc3/NFATc3表達有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]黃芪丹參水煎液； 心肌重構(gòu)； 基質(zhì)相互作用分子1； 瞬時受體電位通道1

[Abstract]To investigate the inhibitory effect of Huangqi Danshen decoction （HDD） on isoproterenol （ISO）induced myocardial remodeling and explore its effect on STIM1， TRPC1， CaN and NFATc3 expressions ISO （25 mg·kg-1·d-1×14 d） was given by subcutaneous injection to establish myocardial remodeling models in rats， and then were randomly divided into control group， ISO model group， HDD5 group （HDD 5 g·kg-1·d-1+ISO）， and HDD10 group （HDD 10 g·kg-1·d-1+ISO） After intervention for 4 weeks， the heart mass index （HW/BW） and the left ventricular mass index （LVW/BW） were calculated； the structure of myocardium was observed by echocardiography； the pathological changes of myocardium were observed by HE staining； levels of BNP， CaN and CaM kinases II in serum were detected by ELISA， and the protein expression levels of STIM1， TRPC1， pCaN， pNFATc3， and NFATc3 in left ventricular tissues were detected by Western blot The results showed that the HW/BW and LVW/BW in ISO group were greater than those in HDD5 group and HDD10 group （P<005）； Echocardiography showed that HDD inhibited ISOinduced increase in LVEDD and LVESD； ELISA results showed that HDD could significantly inhibit the increase of BNP， CaN and CaM kinases II levels in serum of rats with ISOinduced myocardial remodeling （P<001） Western blot results showed that STIM1， TRPC1， pCaN， pNFATc3 and NFATc3 expression levels were increased in the myocardial tissues of ISO group rats， and after HDD administration， the above expression levels were decreased in group ISO， HDD for myocardial tissue after administration of STIM1， TRPC1， pCaN， pNFATc3 and NFATc3 expression decreased （P<005） Our findings indicated that HDD can attenuate the myocardial remodeling induced by ISO， and its mechanism may be related to downregulating the expression levels of STIM1， TRPC1， CaM kinases II， pCaN/CaN and pNFATc3/NFATc3

[Key words]Huangqi Danshen decoction； myocardial remodeling； STIM1； TRPC1

隨著冠心病介入治療的發(fā)展，越來越多的冠心病患者可以從急、慢性心肌缺血事件中存活下來，但繼發(fā)于缺血所導致的缺血性心肌重構(gòu)進而進展為心力衰竭嚴重影響患者的晚期壽命和生活質(zhì)量，其治療仍然是尚未攻克的難題。目前臨床常規(guī)采用的抗心室重構(gòu)治療主要有應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）和長效β受體阻滯劑等，但在實際的臨床中常規(guī)抗心室重構(gòu)治療在改善左室重構(gòu)方面并不是很有效，根據(jù)REVE（Remodelage Ventriculaire）研究組的調(diào)查，常規(guī)抗心室重構(gòu)治療后仍有31%患者在心梗后1年內(nèi)發(fā)生明顯左室重構(gòu)[1]。大量的臨床研究顯示中藥益氣活血治法對缺血后的心室重構(gòu)有明確療效。中藥黃芪和丹參藥物組合是益氣活血治法的代表藥物，在中醫(yī)藥治療心力衰竭心室重構(gòu)中有著廣泛應(yīng)用。根據(jù)現(xiàn)代藥理學的研究結(jié)果，黃芪和丹參中的多種有效成分如黃芪皂苷Ⅳ和丹參酮ⅡA均有Ca2+拮抗的類似作用[23]。筆者前期應(yīng)用UFLCQTOF/MS法對黃芪丹參水煎液（Huangqi Danshen decoction，HDD）的主要成分做了分析顯示，HDD中含有以黃芪皂苷Ⅳ、丹參酮ⅡA為主的28種成分[4]。研究顯示鈣庫操控性鈣通道（store operate calcium channel，SOCC）與缺血性心肌重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，可能是防治缺血性心血管病的新靶點[5]。SOCC主要由基質(zhì)相互作用分子（stromal interaction molecule，STIM）、Orai 及經(jīng)典瞬時受體電位通道（transient receptor potential channel，TRPC）家族組成。本研究觀察了黃芪丹參水煎液對異丙腎上腺素（ISO）誘導的大鼠心肌重構(gòu)的抑制作用和對STIM1，TRPC1，鈣調(diào)蛋白激酶（calmodulindependent protein kinase，CaM kinases ）Ⅱ，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）/pCaN和活化T細胞核因子（nuclear factor of activated Tcells，NFATc）3/pNFATc3表達的影響，探討其抗重構(gòu)效應(yīng)的可靠性和作用機制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料

11動物雄性SpragueDawley大鼠40只，清潔級，體重180～210 g，南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，置于清潔、恒溫環(huán)境中，采用人工照明，每天白天與夜間各12 h分籠飼養(yǎng)，予以標準飼料，自由取食及取水。

12藥物與試劑精確稱取內(nèi)蒙古產(chǎn)道地黃芪飲片200 g、莒縣產(chǎn)丹參飲片100 g，置煎藥砂鍋內(nèi)，加800 mL蒸餾水浸泡2 h，武火煎煮至沸騰調(diào)至文火保持微沸l(wèi) h，16層紗布過濾，收集濾液，濾渣加800 mL蒸餾水，武火煎煮至沸騰調(diào)至文火保持微沸l(wèi) h，16層紗布過濾，收集濾液，合并2次濾液，濃縮藥液至300 mL，則生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1，置4 ℃保存。使用時根據(jù)需要稀釋至相應(yīng)濃度，給予大鼠灌胃。

鹽酸異丙腎上腺素（SigmaAldrich，USA）；大鼠BNP酶聯(lián)免疫試劑盒（PL Laboratories Inc，Canada）；大鼠CaN酶聯(lián)免疫試劑盒（PL Laboratories Inc，Canada）；大鼠CaM kinases Ⅱ酶聯(lián)免疫試劑盒（PL Laboratories Inc，Canada）；兔抗 STIM1多克隆抗體（Cell Signaling Technology，USA）；兔抗TRPC1多克隆抗體（Cell Signaling Technology，USA）；鼠抗 PanCalcineurin A單克隆抗體（Abcam，USA）；鼠抗NFATc3單克隆抗體（Santa Cruz，USA）；兔抗 pNFATc3多克隆抗體（Santa Cruz，USA）。

13儀器VIVIDQ型超聲心動儀及5～12 MHz高頻線控探頭（GE公司，USA）；全自動酶標儀（寶特，USA）；Mini protein3 電泳裝置（BioRad 公司，USA）。

2方法

21大鼠心肌重構(gòu)模型建立、分組與干預(yù)方法通過ISO皮下注射誘導建立缺血性心肌重構(gòu)模型。SD大鼠隨機分為4組：對照組（Control，n=10）、ISO模型組（ISO，n=10）、黃芪丹參水煎液5 g·kg-1·d-1組（HDD5，n=10）、黃芪丹參水煎液10 g·kg-1·d-1組（HDD10，n=10）。

Control組給予皮下緩慢注射生理鹽水03 mL·d-1，連續(xù)28 d。ISO組給予皮下緩慢注射ISO 25 mg·kg-1·d-1，連續(xù)14 d；同時灌服生理鹽水2 mL·d-1，每日1次，連續(xù)28 d。HDD5組給予皮下緩慢注射ISO 25 mg · kg-1· d-1，連續(xù)14 d；同時灌服黃芪丹參水煎液5 g · kg-1，每日1次，連續(xù)28 d。HDD10組給予皮下緩慢注射ISO 25 mg · kg-1· d-1，連續(xù)14 d，同時灌服黃芪丹參水煎液10 g · kg-1，每日1次，連續(xù)28 d。

22超聲心動圖檢測心肌結(jié)構(gòu)28 d末4組大鼠以03%戊巴比妥鈉腹腔注射誘導麻醉后備皮，使用超聲系統(tǒng)進行經(jīng)胸超聲心動圖。在乳頭肌水平的短軸切面中獲得二維引導的M模式圖像，M模式的掃描速度為200 mm·s-1。檢測左心室收縮末期直徑（left ventricular endsystolic diameter，LVESD），左心室舒張末期直徑（left ventricular enddiastolic diameter，LVEDD），左心室舒張末期容積（left ventricular enddiastolic volume，LVEDV），左心室后壁（left ventricular posterior wall，LVPW），室間隔厚度（IVS，interventricular septum）。然后，使用以下等式從M模式計算射血分數(shù)（ejection fraction，EF）和短軸收縮率（fractional shortening，F(xiàn)S）：EF= [（LVEDV-LVESV）/LVEDV]×100%，F(xiàn)S= [（LVEDD-LVESD）/LVEDD]×100%。

23左心室質(zhì)量指數(shù)和心臟質(zhì)量指數(shù)測定生理鹽水反復(fù)灌洗心臟后剝離心臟，剪去周圍結(jié)締組織和血管，濾紙吸干水后，電子天平秤量心臟濕質(zhì)量（HW），剪去心房和右心室游離壁，秤量左心室濕質(zhì)量（LVW），計算心臟質(zhì)量指數(shù)=心臟濕質(zhì)量/體重（HW/ BW）；左心室質(zhì)量指數(shù)=左心室濕質(zhì)量/體重（LVW/ BW）。

24ELISA檢測血清BNP，CaN，CaM kinases Ⅱ水平經(jīng)腹主動脈插管抽血 4 mL，4 ℃，3 000 r·min-1，離心10 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定B型尿鈉肽（B type urinary natriuretic peptide，BNP），CaN，CaM kinases Ⅱ含量，均按相關(guān)說明書操作。

25大鼠心尖組織病理學檢測大鼠心尖部組織取材后置于4%多聚甲醛固定液中浸泡固定24 h，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，制作4 μm切片，蘇木素伊紅（H&E）染色處理，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察并采集圖片。采用盲法，從心肌變性壞死、間質(zhì)纖維增生、心肌細胞空泡變性和間質(zhì)炎細胞浸潤4個方面對心肌損害程度進行觀察與等級分類，每張片子至少觀察5個視野，其分級標準：–，無異常發(fā)現(xiàn)；+，輕度損傷；，中度損傷；，重度損傷。

26Western blot檢測左室心肌組織STIM1，TRPC1，pCaN，NFATc3，pNFATc3蛋白的表達取左心室組織約100 mg，加RIPA裂解緩沖液1 mL 勻漿，離心取上清液進行蛋白定量。取40 μg 蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠分離，電轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。封閉、分別加STIM1，TRPC1，pCaN，NFATc3，pNFATc3一抗（1∶200稀釋）、辣根過氧化物酶標記二抗，二氨基聯(lián)苯胺顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析。

27統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 21 0 軟件進行分析，各組計量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較采用Oneway ANOVA分析，兩兩比較用LSDt 檢驗，P<005 為差異有統(tǒng)計學意義。

3結(jié)果

31HDD對ISO大鼠HW/BW和LVW/BW的影響接受ISO皮下注射的3組大鼠HW/BW和LVW/BW較對照組增大，ISO組大鼠HW/BW和LVW/BW均大于HDD5組和HDD10組，與ISO組相比HDD10組HW/BW和LVW/BW更低（P<005），提示HDD能夠抑制 ISO導致的心臟和心室增大，見表1。

32HDD對ISO大鼠心臟組織形態(tài)學影響心肌組織病理切片H&E染色結(jié)果顯示：Control組大鼠心肌組織無異常改變，心肌細胞結(jié)構(gòu)完整，心肌纖維橫紋清晰規(guī)整，間質(zhì)未見炎性細胞的浸潤；ISO組大鼠心肌結(jié)構(gòu)紊亂，間質(zhì)可見不同程度的局灶性或

大片狀細胞壞死，并可見較多炎性細胞浸潤及間質(zhì)性水腫；與ISO組比較，HDD5和HDD10呈現(xiàn)小范圍的心肌壞死、纖維化，伴少量炎性細胞浸潤和間質(zhì)水腫。提示HDD不同程度減輕了大鼠心肌壞死等組織形態(tài)學結(jié)構(gòu)的異常改變。病理等級分類結(jié)果更進一步證明了HDD對 ISO 致大鼠心肌重構(gòu)的心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)具有很好的保護作用，見圖1和表2。

33HDD對ISO大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響超聲心動圖顯示，與Control組相比，ISO組大鼠的EF和FS值顯著降低（P<001），LVEDD值增加（P<001）和LVESD值增加（P<005），表明左心室明顯增大、心功能下降。與ISO對照組相比，HDD10組LVEDD和LVESD值明顯降低（P<005），見表3。

35HDD對STIMI1，TRPC1，pCaN，pNFATc3和NFATc3蛋白表達的影響與Control組相比，ISO組STIM1表達水平升高；與ISO組相比，HDD5和HDD10組STIM1表達水平明顯下降（P<001）。與ISO組相比，HDD5和HDD10組TRPC1表達水平均下降，但HDD10組下降更明顯（P<001）。與Control組相比，ISO組pCaN，pNFATc3和NFATc3表達水平升高；與ISO組相比，HDD5和HDD10組pCaN，pNFATc3和NFATc3表達水平均下降，但HDD10組下降更明顯（P<005），見圖2。

4討論

心肌重構(gòu)是由于心肌缺血或血液動力學紊亂誘發(fā)心肌肥大基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的異常，導致心肌結(jié)構(gòu)和心臟功能發(fā)生變化，其病理表現(xiàn)以心肌細胞體積增大、間質(zhì)纖維化、間質(zhì)炎細胞浸潤水腫和肌小節(jié)重構(gòu)為主要特征，是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本機制。ISO可興奮心臟β1受體引起心率加快、心肌收縮力增加、心肌耗氧量增加。本研究結(jié)果顯示，25 mg·kg-1 ISO皮下注射引起了大鼠心肌肥大和重構(gòu)，表現(xiàn)為HB/WB和LVB/WB增加，光鏡下大范圍的心肌細胞肥大、彌漫性片狀壞死、間質(zhì)纖維化、炎細胞浸潤和間質(zhì)水腫為主要表現(xiàn)，超聲心動圖顯示心臟擴大、心肌肥厚、EF降低，而HDD能夠抑制抑制IOS 引起的大鼠心肌肥大。病理結(jié)果也顯示，HDD能夠減輕ISO致大鼠心肌組織病理學結(jié)構(gòu)的異常改變，且與劑量相關(guān)，此研究結(jié)果提示HDD對ISO致大鼠心肌肥厚的心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)具有保護作用，且高劑量HDD給藥組對心肌肥大和心肌壞死的抑制作用強于低劑量HDD給藥組，而病理等級分類結(jié)果進一步證明了HDD的抗重構(gòu)效應(yīng)。此研究結(jié)果為HDD對ISO所致慢性大鼠心肌重構(gòu)的抑制作用提供了形態(tài)學和功能學證據(jù)。

BNP是一種心血管肽類激素，參與了心衰發(fā)生、發(fā)展的病理過程，其反映心力衰竭程度的敏感性和特異性均較高。本研究結(jié)果顯示，接受ISO皮下注射后大鼠血清BNP均不同程度的升高，提示存在心力衰竭。而給予HDD干預(yù)后BNP升高的幅度明顯低于對照組，反映了HDD對心功能的改善作用，BNP的檢測結(jié)果從體內(nèi)激素水平的角度進一步印證了HDD可改善ISO導致的心肌重構(gòu)、心功能下降。

STIM1是SOCC的感受器，TRPC是SOCC開放的門戶，TRPC 1亞型在大鼠和人類心臟中均有表達[6]。研究顯示使用硝苯地平抑制電壓依賴性鈣通道（voltage dependent calcium channel，VDCC）通道后，心肌肥大并沒有得到改善，而采用SOCC阻斷劑SKF96365或敲除SOCC基因后，心肌肥大能得到明顯改善[7]，提示SOCC引起Ca2+內(nèi)流在心肌肥大過程中扮演了重要的角色。本研究結(jié)果顯示，單純接受ISO皮下注射后STIM1，TRPC1蛋白表達水平上調(diào)，而HDD能夠下調(diào)ISO導致的STIM1和TRPC1表達水平升高，此結(jié)果提示 HDD改善心肌重構(gòu)的作用可能與下調(diào)STIM1和TRPC1表達從而抑制Ca2+內(nèi)流相關(guān)。

CaM/CaN/NFATc3也參與心肌重構(gòu)的病理發(fā)展過程。不同來源的胞漿Ca2+與胞漿內(nèi)CaM結(jié)合后形成的Ca2+CaM復(fù)合物激活依耐賴鈣調(diào)素的蛋白激酶使底物磷酸化從而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，這種底物包括各種酶、骨架蛋白、離子通道及轉(zhuǎn)錄因子等。CaN在細胞信號傳遞過程中接受 Ca2+的調(diào)節(jié)，起去磷酸化作用，參與多種細胞功能調(diào)節(jié)[8]。NFATc是CaN最重要的底物，Ca2+CaM復(fù)合物通過激活CaN，影響著NFATc活性。胞漿中的 CaN活化后使胞漿的 NFATc 去磷酸化和核內(nèi)轉(zhuǎn)位，進入核內(nèi)的去磷酸化NFATc與心肌細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，活化多種心肌肥大的相關(guān)基因如心房利鈉肽等基因表達，使細胞內(nèi)的蛋白合成增多，細胞體積增大，誘導心肌肥大，最終導致病理性心肌肥厚[9]。本研究顯示，單純接受ISO皮下注射后心肌pCaN，pNFATc3/NFATc3和血清CaN，CaM kinases Ⅱ表達水平均上調(diào)，而 HDD能夠下調(diào)ISO 導致的pCaN/CaN，pNFATc3/NFATc3和CaM kinases Ⅱ表達升高，此結(jié)果提示 HDD改善心肌重構(gòu)的機制可能與下調(diào)pCaN/CaN，pNFATc3/NFATc3和CaM kinases Ⅱ相關(guān)。

已有的研究表明，TRPC基因本身就可以對CaN/NFAT信號通路進行正反饋調(diào)節(jié)，當TRPC基因表達下降時，就會下調(diào)CaN/NFATc信號通路的表達導致了進入核內(nèi)的去磷酸化NFATc減少，從而就抑制了心肌細胞多個肥大基因的表達，完成心肌肥厚的逆轉(zhuǎn)；另外，結(jié)構(gòu)上TRPC基因位于NFATc基因的下游，當NFAT基因表達下降時，也能抑制TRPC基因表達，這樣就完成TRPCCaN/NFATc正反饋循環(huán)的調(diào)節(jié)[10]。從本研究的結(jié)果可以推測HDD對TRPCCaN/NFATc正反饋循環(huán)也具有調(diào)節(jié)作用。綜合本研究結(jié)果，HDD 具有明確的改善心肌重構(gòu)的作用，其機制可能與下調(diào) STIM1，TRPC1，CaM kinases Ⅱ，CaN，NFATc3的表達有關(guān)。

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[責任編輯張寧寧]