發(fā)酵豆渣中低聚糖對(duì)益生菌增殖的研究

傅宇翔,范亞葦,*,陶 林,鄧澤元,穆松牛,曾云霞(.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047; .南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)中心,江西南昌 330006)

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發(fā)酵豆渣中低聚糖對(duì)益生菌增殖的研究

傅宇翔1,范亞葦1,*,陶 林1,鄧澤元1,穆松牛2,曾云霞1
(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047; 2.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)中心,江西南昌 330006)

目的:研究粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆渣中低聚糖對(duì)植物乳桿菌NCU116和青春雙歧桿菌CICC 6178增殖的影響。方法:將植物乳桿菌NCU116和青春雙歧桿菌CICC 6178分別培養(yǎng)48 h,測(cè)定生長(zhǎng)曲線、最大比生長(zhǎng)速率、延遲期、發(fā)酵液pH曲線和基質(zhì)消耗率。結(jié)果:2 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖組的植物乳桿菌NCU116發(fā)酵液最大吸光度、pH減小值、基質(zhì)消耗率(p<0.05)均小于2 g/L菊糖組(陽(yáng)性對(duì)照組),2 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖組的青春雙歧桿菌CICC 6178最大吸光度、pH減小值、基質(zhì)消耗率(p<0.05)均大于2 g/L菊糖組,所有發(fā)酵豆渣低聚糖組對(duì)兩種益生菌的最大比生長(zhǎng)速率均大于2 g/L菊糖組,2、6 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖組的植物乳桿菌NCU116延遲期小于2 g/L菊糖組,各發(fā)酵豆渣低聚糖組的青春雙歧桿菌CICC 6178延遲期大于2 g/L菊糖組。結(jié)論:粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆渣中低聚糖對(duì)植物乳桿菌NCU116的增殖作用不如菊糖,對(duì)青春雙歧桿菌CICC 6178的增殖作用優(yōu)于菊糖。

粗壯脈紋孢菌,發(fā)酵豆渣,低聚糖,植物乳桿菌,青春雙歧桿菌

粗壯脈紋孢菌是一種有較強(qiáng)發(fā)酵能力且能產(chǎn)生纖維素酶的真菌,劉沛毅[1]優(yōu)化粗壯脈紋孢菌固態(tài)發(fā)酵豆渣中纖維素酶的提取條件,得到最高總酶活為1.702×10-2IU/mL。粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆渣后產(chǎn)生低聚糖,葉俊[2]通過(guò)優(yōu)化低聚糖提取工藝,得到發(fā)酵豆渣中低聚糖的最大得率為11.91%。低聚糖具有多種生理功能,其中,促進(jìn)益生菌增殖和改善腸道菌群是重要的生理功能之一。張立峰等[3]用不同濃度的低聚糖給小鼠灌胃,發(fā)現(xiàn)中、高劑量組能顯著增加小鼠腸道中乳酸桿菌的數(shù)量,且低、中、高三個(gè)劑量組能顯著增加小鼠腸道中乳酸桿菌的數(shù)量;通過(guò)人體實(shí)驗(yàn)表明,大豆低聚糖能顯著提高人體腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量。張延坤[4]研究表明,健康成人每日攝入10 g大豆低聚糖,可顯著提高腸道內(nèi)雙歧桿菌的數(shù)量。文獻(xiàn)表明,目前國(guó)內(nèi)外沒(méi)有關(guān)于粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆渣低聚糖的研究,只有本課題組發(fā)表的相關(guān)論文[2],本論文是該研究的延續(xù)。本研究通過(guò)植物乳桿菌NCU116和青春雙歧桿菌CICC 6178兩種益生菌的增殖效果,來(lái)評(píng)估粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆渣中低聚糖對(duì)益生菌的影響,為粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆渣中低聚糖的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌NCU116 由南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏;青春雙歧桿菌CICC 6178 購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;發(fā)酵豆渣低聚糖(含量為72.25%±2.07%) 從粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆渣中提取的混合物,低聚糖通過(guò)HPLC測(cè)定[2];實(shí)驗(yàn)所用試劑 均為分析純;梭菌增菌培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;MRS培養(yǎng)基、BSM培養(yǎng)基 參照文獻(xiàn)[5-6]進(jìn)行配制。

DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;溫控?fù)u床 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;HD-650桌上型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;恒溫水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠;YQX-II厭氧培養(yǎng)箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司;TDL-5-A飛鴿牌臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;精密pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;722E型可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;電子天平 奧豪斯儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵豆渣低聚糖的提取工藝流程 發(fā)酵豆渣→45 ℃烘干→粉碎機(jī)粉碎→90 ℃熱水浸提→4200 r/min離心10 min→上清液→60 ℃濃縮→4倍乙醇醇沉過(guò)夜→4200 r/min離心10 min→上清液→60 ℃濃縮→冷凍干燥→粗發(fā)酵豆渣低聚糖。

粗發(fā)酵豆渣低聚糖用Sevag法脫蛋白和AB-8大孔樹脂脫色[2]后,得到精制發(fā)酵豆渣低聚糖。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制 參照文獻(xiàn)[5-6]配制MRS培養(yǎng)基、BSM培養(yǎng)基。

1.2.3 菌種活化 將含20%(v/v)甘油的植物乳桿菌NCU116和青春雙歧桿菌CICC 6178以1%的接種量分別接種于MRS液體培養(yǎng)基和BSM液體培養(yǎng)基中,pH調(diào)至7.2和6.25[7],分別置于振蕩速度為120 r/min的恒溫?fù)u床和厭氧培養(yǎng)箱中(90% N2,5% CO2,5% H2),37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.4 分組 共分為5組,分別為2、6、10 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖組,2 g/L菊糖組(陽(yáng)性對(duì)照組)以及空白對(duì)照組(CK),各添加量按發(fā)酵豆渣中低聚糖含量(72.25%)換算得出。

1.2.5 植物乳桿菌NCU116和青春雙歧桿菌CICC 6178生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將植物乳桿菌NCU116和青春雙歧桿菌CICC 6178分別以3%[8]和10%[9]的接種量接種于不含碳源(未加入葡萄糖和牛肉膏)的MRS液體培養(yǎng)基和BSM液體培養(yǎng)基中,兩種培養(yǎng)基中都以2、6、10 g/L的發(fā)酵豆渣低聚糖或2 g/L菊糖作為唯一碳源?？瞻讓?duì)照組未添加任何碳源。將加入不同碳源的MRS液體培養(yǎng)基和BSM液體培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至7.2和6.25,每管裝液量為6 mL,分別置于振蕩速度為120 r/min的恒溫?fù)u床和厭氧培養(yǎng)箱中,37 ℃培養(yǎng)48 h。0～48 h中,每2 h取發(fā)酵液,以各處理組未接種的培養(yǎng)基為空白,在600 nm下測(cè)定吸光度,繪制生長(zhǎng)曲線。每個(gè)樣品平行測(cè)定三次。

1.2.6 植物乳桿菌NCU116和青春雙歧桿菌CICC 6178最大比生長(zhǎng)速率和延遲期的測(cè)定 最大比生長(zhǎng)速率(μmax)為每小時(shí)單位質(zhì)量的菌體所增加的最大菌體量,延遲期(lag)為體外發(fā)酵生長(zhǎng)的延遲時(shí)間。最大比生長(zhǎng)速率和延遲期均由Microsoft Excel add-in DMfit v.2.1軟件擬合的S形曲線模型中計(jì)算得到[10]。

1.2.7 植物乳桿菌NCU116和青春雙歧桿菌CICC 6178發(fā)酵液pH曲線的測(cè)定 0～48 h內(nèi),每4 h取發(fā)酵液,用pH計(jì)測(cè)定pH,繪制pH變化曲線。每個(gè)樣品平行測(cè)定三次。

1.2.8 植物乳桿菌NCU116和青春雙歧桿菌CICC 6178發(fā)酵液中基質(zhì)消耗率的測(cè)定 分別在6、12、24、48 h取發(fā)酵液,參照苯酚-硫酸比色法和間羥基聯(lián)苯比色法[11-12]測(cè)定中性糖和糖醛酸,二者之和即為發(fā)酵液中糖的總質(zhì)量。

其中:M0為0 h時(shí)發(fā)酵液中糖的總質(zhì)量,Mt為培養(yǎng)t h時(shí)發(fā)酵液中糖的總質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)三次。應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析,Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌NCU116和青春雙歧桿菌CICC 6178生長(zhǎng)曲線

由圖1可以看出,各組在0～4 h內(nèi)處于延遲期,植物乳桿菌NCU116生長(zhǎng)緩慢,各處理組在4～12 h內(nèi)進(jìn)入對(duì)數(shù)期,增殖迅速,之后進(jìn)入穩(wěn)定期,生長(zhǎng)逐漸減緩,吸光度趨于穩(wěn)定,后期吸光度略有下降,空白組在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中吸光度變化很小。不同添加量的發(fā)酵豆渣低聚糖組對(duì)植物乳桿菌NCU116均有一定的增殖作用,在各時(shí)間段的吸光度都高于空白對(duì)照組,且發(fā)酵豆渣低聚糖組在相同時(shí)間的吸光度均隨著添加量的增加而增加,10 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖的吸光度最高,在20 h時(shí)達(dá)到最大值1.334。6、10 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖組的最大吸光度大于2 g/L菊糖組,說(shuō)明同等添加量的菊糖比發(fā)酵豆渣低聚糖對(duì)植物乳桿菌NCU116的增殖作用更強(qiáng)。

圖1 植物乳桿菌NCU116生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of Lactobacillus plantarum NCU116

由圖2可知,各組在0～6 h青春雙歧桿菌CICC 6178生長(zhǎng)遲緩,吸光度變化很小,之后生長(zhǎng)速率逐漸加快,發(fā)酵豆渣低聚糖組生長(zhǎng)曲線較為陡峭,各組在36 h內(nèi)吸光度均達(dá)到最大值。不同添加量的發(fā)酵豆渣低聚糖均能一定程度上促進(jìn)青春雙歧桿菌CICC 6178的增殖,在所有時(shí)間段的吸光度都高于空白對(duì)照組。但2 g/L菊糖對(duì)青春雙歧桿菌CICC 6178幾乎沒(méi)有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用,與白文[13]研究結(jié)果相似。發(fā)酵豆渣低聚糖的吸光度均隨著添加量增加而增高。10 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖在所有組別中有最大吸光度,為0.478。添加量同為2 g/L時(shí),發(fā)酵豆渣低聚糖和菊糖的最大吸光度分別為0.192、0.099,故相同添加量下,發(fā)酵豆渣低聚糖對(duì)促進(jìn)青春雙歧桿菌CICC 6178生長(zhǎng)的作用優(yōu)于菊糖。相較于植物乳桿菌NCU116,各處理組中青春雙歧桿菌CICC 6178發(fā)酵液的吸光度明顯減小,其原因可能是植物乳桿菌NCU116是兼性厭氧菌,而青春雙歧桿菌CICC 6178是厭氧菌,生長(zhǎng)條件更為苛刻,其主要生長(zhǎng)于試管底部,中上層很少生長(zhǎng),故發(fā)酵液濃度較低,吸光度較小。

圖2 青春雙歧桿菌CICC 6178生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of Bifidobacterium adolescentis CICC 6178

2.2 植物乳桿菌NCU116和青春雙歧桿菌CICC 6178最大比生長(zhǎng)速率和延遲期的測(cè)定

由表1可知,不同添加量的發(fā)酵豆渣低聚糖的植物乳桿菌NCU116最大比生長(zhǎng)速率均比空白對(duì)照組大,發(fā)酵豆渣低聚糖組的最大比生長(zhǎng)速率隨添加量的增加而增大。添加量為2 g/L時(shí),發(fā)酵豆渣低聚糖的最大比生長(zhǎng)速率比菊糖大,說(shuō)明植物乳桿菌NCU116對(duì)發(fā)酵豆渣低聚糖的利用速率大于菊糖,可能和發(fā)酵豆渣低聚糖的聚合度比菊糖小有關(guān)。

不同添加量的發(fā)酵豆渣低聚糖組的植物乳桿菌NCU116延遲期都比空白對(duì)照組短。發(fā)酵豆渣低聚糖組的植物乳桿菌NCU116延遲期隨添加量的增大呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì),說(shuō)明10 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖可能會(huì)短暫抑制植物乳桿菌NCU116的生長(zhǎng)。2、6 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖的延遲期小于菊糖,而10 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖的延遲期大于菊糖。

表1 植物乳桿菌NCU116的最大比生長(zhǎng)速率和延遲期Table 1 Maximum growth rates(μmax,h-1) and lag parameters(lag,h)of Lactobacillus plantarum NCU116

由表2可見,不同添加量的發(fā)酵豆渣低聚糖組的青春雙歧桿菌CICC 6178最大比生長(zhǎng)速率均比菊糖組和空白對(duì)照組大。添加量越大,發(fā)酵豆渣低聚糖組的最大比生長(zhǎng)速率也越大。添加量同為2 g/L時(shí),菊糖的最大比生長(zhǎng)速率小于發(fā)酵豆渣低聚糖,故青春雙歧桿菌CICC 6178對(duì)發(fā)酵豆渣低聚糖的利用速率大于菊糖。

表2 青春雙歧桿菌CICC 6178的最大比生長(zhǎng)速率和延遲期Table 2 Maximum growth rates(μmax,h-1)and lag parameters(lag,h)of Bifidobacterium adolescentis CICC 6178

注:ND表示未得出結(jié)果。

隨著添加量的增大,發(fā)酵豆渣低聚糖組的青春雙歧桿菌CICC 6178延遲期表現(xiàn)出先減小后增大的趨勢(shì),說(shuō)明10 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖會(huì)延長(zhǎng)青春雙歧桿菌CICC 6178的延遲期。添加量相同時(shí),菊糖的延遲期短于發(fā)酵豆渣低聚糖,其原因可能是菊糖組吸光度不大,生長(zhǎng)曲線較平緩,軟件擬合得出的延遲期較短。

2.3 植物乳桿菌NCU116和青春雙歧桿菌CICC 6178發(fā)酵液pH曲線的測(cè)定

由圖3可以看出,2、6、10 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖組pH下降幅度均比空白對(duì)照組大,pH減小值隨添加量的增加而加大。各組中10 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖pH減小值最大,為1.74。6、10 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖比2 g/L菊糖pH減小值大。2 g/L菊糖組pH減小值大于2 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖組,故添加量相同時(shí),菊糖對(duì)植物乳桿菌NCU116發(fā)酵液pH的影響大于發(fā)酵豆渣低聚糖。

圖3 植物乳桿菌NCU116發(fā)酵液pH曲線Fig.3 The pH curve of fermentation broth of Lactobacillus NCU116

由圖4可見,2、6、10 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖組的pH減小值比2 g/L菊糖和空白對(duì)照組都更大,且發(fā)酵豆渣低聚糖組隨添加量越多,pH減小值越大,所有組別中10 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖pH減小值最大,為0.69。相同添加量時(shí),發(fā)酵豆渣低聚糖對(duì)青春雙歧桿菌CICC 6178發(fā)酵液pH影響比菊糖大。

圖4 青春雙歧桿菌CICC 6178發(fā)酵液pH曲線Fig.4 The pH curve of fermentation broth of Bifidobacterium adolescentis CICC 6178

2.4 植物乳桿菌NCU116和青春雙歧桿菌CICC 6178發(fā)酵液中基質(zhì)消耗率的測(cè)定

由圖5可見,2、6、10 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖在各時(shí)段植物乳桿菌NCU116發(fā)酵液基質(zhì)消耗率均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈增大趨勢(shì)。發(fā)酵豆渣低聚糖組6 h時(shí)基質(zhì)消耗率隨添加量的增加而減小,且有顯著差異(p<0.05),而其他時(shí)間段2 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖比6、10 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖基質(zhì)消耗率大(p>0.05)。6 h時(shí)各添加量發(fā)酵豆渣低聚糖基質(zhì)消耗率均顯著大于2 g/L菊糖,而24、48 h時(shí),發(fā)酵豆渣低聚糖各組的基質(zhì)消耗率均小于2 g/L菊糖(p<0.05)。

圖5 植物乳桿菌NCU116發(fā)酵液基質(zhì)消耗率Fig.5 Rate of substrate consumption in fermentation broth of Lactobacillus NCU116

由圖6可以看出,各添加量的發(fā)酵豆渣低聚糖組在6、12、24、48 h時(shí),青春雙歧桿菌CICC 6178發(fā)酵液基質(zhì)消耗率均隨時(shí)間的增加而呈現(xiàn)增大趨勢(shì)。6 h時(shí),2、6 g/L發(fā)酵豆渣低聚糖組的基質(zhì)消耗率無(wú)顯著差異(p>0.05),但在其他時(shí)段,發(fā)酵豆渣低聚糖組隨添加量的增加,基質(zhì)消耗率顯著減小(p<0.05)。所有時(shí)段各添加量發(fā)酵豆渣低聚糖組基質(zhì)消耗率均顯著大于(p<0.05)2 g/L菊糖的基質(zhì)消耗率。

圖6 青春雙歧桿菌CICC 6178發(fā)酵液基質(zhì)消耗率Fig.6 Rate of substrate consumption in fermentation broth of Bifidobacterium adolescentis CICC 6178

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)植物乳桿菌NCU116和青春雙歧桿菌CICC 6178的增殖實(shí)驗(yàn)得出,與對(duì)照組相比,各添加量發(fā)酵豆渣低聚糖組均能不同程度增加植物乳桿菌NCU116和青春雙歧桿菌CICC 6178發(fā)酵液的吸光度,增大最大比生長(zhǎng)速率,縮短延遲期,降低發(fā)酵液的pH。相同添加量下,菊糖對(duì)植物乳桿菌NCU116的增殖效果優(yōu)于發(fā)酵豆渣低聚糖,而發(fā)酵豆渣低聚糖對(duì)青春雙歧桿菌CICC 6178的增殖效果優(yōu)于菊糖。

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Study on proliferation of oligosaccharides in fermented soybean residue

FU Yu-xiang1,FAN Ya-wei1,*,TAO Lin1,DENG Ze-yuan1,MU Song-niu2,ZENG Yun-xia1

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology of Nanchang University,Nanchang 330047,China; 2.The Center of Laboratory Animal Sciences,Medical College of Nanchang University,Nanchang 330006,China)

Objective:To investigate the effects of oligosaccharides on the proliferation ofLactobacillusplantarumNCU116 andBifidobacteriumadolescentisCICC 6178 in soybean residue fermented byNeurosporacrassa. Methods:The growth curve,maximum growth rates,lag parameters,pH value of fermentation broth and substrate consumption rate were determined by incubatingLactobacillusplantarumNCU116 andBifidobacteriumadolescentisCICC 6178 for 48 h.Results:The maximal absorbance,pH reduction value and substrate consumption rate of the fermentation broth ofLactobacillusplantarumNCU116 of 2 g/L fermented soybean residue oligosaccharides group were lower than those of 2 g/L inulin group(positive control group). The maximal absorbance,pH reduction value and substrate consumption rate of the fermentation broth ofBifidobacteriumadolescentisCICC 6178 of 2 g/L fermented soybean residue oligosaccharides group were higher than those of 2 g/L inulin group. The maximum growth rates of all fermented soybean residue oligosaccharides groups to the two probiotics were greater than those of 2 g/L inulin group,the lag parameters ofLactobacillusplantarumNCU116 of 2,6 g/L fermented soybean residue oligosaccharides groups were less than those of 2 g/L inulin group. The lag parameters ofBifidobacteriumadolescentisCICC 6178 of all fermented soybean residue oligosaccharides groups were more than 2 g/L inulin group.Conclusion:The proliferation effect ofLactobacillusplantarumNCU116 of oligosaccharides in soybean residue fermented byNeurosporacrassawas worse than that of inulin,the proliferation effect ofBifidobacteriumadolescentisCICC 6178 of oligosaccharides in soybean residue fermented byNeurosporacrassawas better than that of inulin.

Neurosporacrassa;fermented soybean residue;oligosaccharide;Lactobacillusplantarum;Bifidobacteriumadolescentis

2016-12-12

傅宇翔(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)，E-mail:marcofu2012@163.com。

*通訊作者:范亞葦(1969-)，女，博士，副教授，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)與化學(xué)方面的研究，E-mail:fanyw6601@sina.com。

TS201.3

A

1002-0306(2017)14-0137-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.027