亞硝酸還原酶基因克隆、表達(dá)與純化

魏計(jì)東,張慶芳,竇少華,于 爽,遲乃玉,王曉輝,* (1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116622; 2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心,遼寧大連 116622)

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亞硝酸還原酶基因克隆、表達(dá)與純化

魏計(jì)東1,2,張慶芳1,2,竇少華1,2,于 爽1,2,遲乃玉1,2,王曉輝1,2,*
(1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116622; 2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心,遼寧大連 116622)

該研究通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法從木糖氧化產(chǎn)堿菌(AchromobacterxylosoxidansDL-1)基因組DNA中成功克隆含銅亞硝酸還原酶基因。PCR測(cè)序表明該基因全長1083個(gè)核苷酸,編碼360個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)其理論分子質(zhì)量約38.924 kDa,等電點(diǎn)(pI)4.83,命名為CuNiR(Genbank登錄號(hào)KX674378)。結(jié)構(gòu)域分析該蛋白編碼區(qū)包含信號(hào)肽,1個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn),1個(gè)氧化還原酶催化域。將CuNiR基因構(gòu)建到pET22b載體,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá),十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)顯示目的蛋白可溶表達(dá)。利用鎳柱親和層析純化重組蛋白,酶活檢測(cè)顯示比活力為123.82 U/mg,為后期含銅亞硝酸還原酶(CuNiR)的生化性質(zhì)表征奠定理論基礎(chǔ)。

木糖氧化產(chǎn)堿菌DL-1,含銅亞硝酸還原酶(CuNiR),克隆,表達(dá),純化

自然界中氮素循環(huán)是各個(gè)元素循環(huán)的中心,幾乎所有有機(jī)體都需要有機(jī)氮作為細(xì)胞的必需成分,氮元素成為地球表面生物量增長的限制性因素[1]。在氮素循環(huán)中,固氮作用與脫氮作用是兩個(gè)十分重要的環(huán)節(jié),生物圈中氮素的引入主要是通過固氮作用,而最終實(shí)現(xiàn)對(duì)大氣中蘊(yùn)藏豐富的氮素的利用。與此同時(shí),生物圈中氮素的釋放則離不開脫氮作用。脫氮作用是指通過一系列的厭氧電子傳遞反應(yīng)把硝酸經(jīng)由亞硝酸、一氧化氮、氧化亞氮等中間體還原為氮?dú)饣虬钡倪^程[2]。反硝化作用主要由反硝化細(xì)菌[3]在微氧或厭氧條件下完成。

亞硝酸還原酶是催化亞硝酸鹽還原為一氧化氮(NO)的酶。反硝化途徑[4]由一系列的還原反應(yīng)組成,每一步都有特定的酶來催化完成。而亞硝酸還原酶最終實(shí)現(xiàn)了將溶液態(tài)的亞硝酸向氣態(tài)NO的相變,直接導(dǎo)致了氮素從陸表環(huán)境中的流失,可以認(rèn)為是反硝化途徑中最為關(guān)鍵的一步[5];其次,利用亞硝酸還原酶降解發(fā)酵食品中的亞硝酸鹽是應(yīng)對(duì)亞硝酸鹽污染的根本對(duì)策。對(duì)許多細(xì)菌中的亞硝酸還原酶分析表明它有兩種類型:以細(xì)胞色素cd1(cd1NiR)和金屬Cu(CuNiR)為輔基,其中細(xì)胞色素cd1NiR更為經(jīng)常的發(fā)生[6]。兩種類型的亞硝酸還原酶在結(jié)構(gòu)和氧化還原中心的差異很大,但催化相同的單電子亞硝酸還原反應(yīng)。第一個(gè)含銅亞硝酸還原酶是在1955年,由Iwasaki[7]等人于自名古屋大學(xué)的土壤中分離的Alcaligenes(現(xiàn)在稱為Achromobacter)xylosoxidans NCIB11015菌株中發(fā)現(xiàn)的。亞硝酸還原酶中CuNiR含量相對(duì)較少,但是表現(xiàn)了更廣泛的環(huán)境、地域、種群等分布上的多樣性。迄今為止,已在十幾種具有反硝化作用的微生物中明確鑒定出CuNiR的存在[8]。最新研究熱點(diǎn)主要集中于亞硝酸還原酶催化作用的分子機(jī)理,具體涉及電子在兩個(gè)類銅位點(diǎn)之間的傳遞,以及CuNiR結(jié)合于類型2銅位點(diǎn)(T2Cu)的亞硝酸還原反應(yīng)發(fā)生情況[9];而關(guān)于該酶的基因水平研究較少[10]。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

本文在分子水平上實(shí)現(xiàn)編碼含銅亞硝酸還原酶基因的克隆、表達(dá)及純化。含銅亞硝酸還原酶基因CuNiR的克隆、表達(dá)以及酶的純化是重組基因工程菌生產(chǎn)亞硝酸還原酶(NiR)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的重要研究基礎(chǔ)。通過對(duì)CuNiR基因克隆和表達(dá)的研究,有助于我們了解亞硝酸還原酶(NiR)基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)產(chǎn)物之間的關(guān)系,并為根據(jù)不同應(yīng)用目的進(jìn)行亞硝酸還原酶(NiR)分子工程化的改造奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木糖氧化產(chǎn)堿菌(AchromobacterxylosoxidansDL-1) 由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存;大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)JM109和BL21(DE3) 為本實(shí)驗(yàn)室保存,分別為基因克隆和表達(dá)宿主菌;表達(dá)載體pET-22b(+) 購自Novagen公司;引物合成和基因測(cè)序 由寶生物工程(大連)有限公司完成;十二烷基硫酸鈉(SDS)、瓊脂糖、Tris Promega公司;LA Taq DNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒、低分子量蛋白Marker 寶生物(大連)工程有限公司;蛋白濃度測(cè)定試劑盒 碧云天公司;LB培養(yǎng)基(1000 mL):胰蛋白胨10 g,酵母提取物 5 g,NaCl 10 g,pH7.0;LB固體培養(yǎng)基需向液體培養(yǎng)基內(nèi)加入2%(w/v)瓊脂;LA培養(yǎng)基:LB液體或固體培養(yǎng)基中加入終濃度100 μg/mL氨芐青霉素。

PCR擴(kuò)增儀 TaKaRa公司;GS-158低溫臺(tái)式離心機(jī) BECKMAN公司;J21-M高速冷凍離心機(jī) BECKMAN公司;臺(tái)式冷凍離心機(jī) Eppendorf公司;CH1015超級(jí)恒溫水浴槽 上海恒平儀器廠;Inazge MlasterRVDS電泳成像系統(tǒng) Parmacia Biotech公司;DYY-III形電泳槽 北京六一儀器廠;Milli-Q Academic超純水器;pH計(jì) BECKMAN公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1CuNiR基因的克隆與序列分析 從平板上挑取菌株AchromobacterxylosoxidansDL-1單菌落,接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基,37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,12000 r/min離心10 min收集菌體,按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取基因組DNA。

以基因組DNA為模板,根據(jù)Kataoka K等[11]的方法設(shè)計(jì)含銅亞硝酸還原酶基因序列(AB013078)的兩對(duì)引物,見表1。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 2 min,1個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,68 ℃ 7 min,30個(gè)循環(huán);68 ℃ 15 min,1個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%(w/v)瓊脂糖電泳檢測(cè),將PCR產(chǎn)物大小正確的克隆送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序。采用Vector NTI Suite軟件進(jìn)行開放閱讀框(open reading frames,ORF)分析。通過NCBI上的本地序列基本搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)分析序列同源性。采用在線的簡(jiǎn)單模塊構(gòu)架搜索工具(simple modular architecture research tool,SMART)進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)域分析。

1.2.2CuNiR基因的表達(dá)與純化 按實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建CuNiR基因的表達(dá)載體,熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetent Cell JM109中,涂布平板培養(yǎng)菌體。隨機(jī)挑取的12個(gè)單菌落進(jìn)行PCR鑒定,鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為CuNiR-P-1和CuNiR-P-2,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。CuNiR基因(去除信號(hào)肽)和原核表達(dá)載體pET22b(+)的PCR產(chǎn)物經(jīng)NdeI/HindⅢ雙酶切后用T4 DNA 連接酶連接,構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET22b-CuNiR,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中。雙酶切鑒定正確的陽性克隆接入含氨芐的LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h。按1%的接種量接種到含氨芐的LB培養(yǎng)基中。當(dāng)OD600 nm達(dá)到0.6～0.8左右,加入1.0 mmol/L的IPTG,37 ℃,100 r/min誘導(dǎo)2 h。4 ℃,6000×g離心10 min,收集菌體,用適量PBS緩沖液(pH7.0)洗滌菌體并重懸。離心管置于冰上超聲(400 W)破碎三次,每次10 s,間隔1 min,直至菌體透明。4 ℃,8000×g離心20 min,收集上清液,即為粗蛋白。粗蛋白用Ni2+-NTA柱(Novagen)進(jìn)行親和層析純化[12],洗脫的蛋白液4 ℃保存。蛋白樣品經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè),其中濃縮膠濃度5%,分離膠濃度12%,用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。低分子量蛋白Marker用于SDS-PAGE。

1.2.3 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 蛋白濃度通過Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Bradford Protein Assay Kit)測(cè)定。

1.2.4CuNiR酶活性的測(cè)定CuNiR活性測(cè)定采用Na2S2O4-MV法[13]。測(cè)定酶活反應(yīng)體系250 μL:0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5)125 μL,0.1 mol/L NaNO212.5 μL,0.1 mol/L MV 7.5 μL,0.1 mol/L Na2S2O440 μL,酶液50 μL。30 ℃水浴中反應(yīng)10 min,劇烈振蕩終止反應(yīng)(以磷酸緩沖液為空白)。取10 μL加格利斯試劑顯色,在波長540 nm處比色法測(cè)定亞硝酸鹽的變化。

硝酸還原酶活力單位通過在25 ℃下,每分鐘還原1 μmol亞硝酸鹽所消耗的酶量來表示。比活力用1 mg蛋白質(zhì)中酶的活力單位數(shù)來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1CuNiR基因的擴(kuò)增與序列分析

以AchromobacterxylosoxidansDL-1基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增得到一條長度約1083 bp的DNA片段(圖1)。DNA測(cè)序結(jié)果表明:該基因包含1083個(gè)核苷酸構(gòu)成的開放閱讀框架,命名為CuNiR,該基因編碼360個(gè)氨基酸,理論分子量38.924 kDa,等電點(diǎn)為4.83。本文首次報(bào)道從AchromobacterxylosoxidansDL-1中克隆亞硝酸還原酶基因。Blast比對(duì)分析該序列同已發(fā)表的A.xylosoxidansAU1011亞硝酸還原酶(GeneBank No. AB013078)氨基酸同源性達(dá)96%。但未見比對(duì)菌株中該蛋白表達(dá)純化研究。結(jié)構(gòu)域分析該基因包含一段24個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號(hào)肽,1個(gè)銅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域和1個(gè)氧化還原酶催化域。

圖1 含銅亞硝酸還原酶基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the CuNiR gene through PCR注:M:DNA Marker DL2000;1:CuNiR gene。

2.2CuNiR基因測(cè)序載體的鑒定

將以CuNiR-F2/R2為引物PCR擴(kuò)增得到的目的片斷CuNiR基因克隆至pMD19-T simple載體中,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD19-T simple/CuNiR,通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。由圖2可見在約3.7 kbp處得到4條明亮清晰DNA條帶,其中去除信號(hào)肽CuNiR基因片段大小約1011 bp,pMD19-T simple載體大小為2692 bp,結(jié)果顯示目的片斷已經(jīng)成功克隆至質(zhì)粒載體中,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T simple/CuNiR,進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證正確的目的基因進(jìn)行后續(xù)分析。

圖2 重組質(zhì)粒pMD19-T simple/CuNiR的PCR電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmid pMD19-T simple/CuNiR注:M:Lambda DNA/Hind III Marker; 1～4:重組質(zhì)粒pMD19-T simple/CuNiR。

圖3 重組質(zhì)粒pET-22b-CuNiR瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of pET-22b/CuNiR plasmid注:M:λ-Hind Ⅲ DNA Marker;1:CuNiR-P-1;2:CuNiR-P-2。

2.3CuNiR基因表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

提取重組表達(dá)質(zhì)粒CuNiR-P-1和CuNiR-P-2進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示,重組表達(dá)質(zhì)粒與預(yù)期大小一致。

將質(zhì)粒CuNiR-P-1和CuNiR-P-2分別用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ/HindⅢ進(jìn)行雙酶切,取20 μL酶解產(chǎn)物上樣進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，兩個(gè)重組質(zhì)粒酶解產(chǎn)物片段大小分別約為1 kbp和5.3 kbp左右,說明目的CuNiR基因已成功的亞克隆至表達(dá)載體pET-22b(+)中。

圖4 質(zhì)粒CuNiR-P-1和CuNiR-P-2酶切產(chǎn)物回收Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of recombinant expression plasmid pET-22b(+)/CuNiR digested with restriction enzyme注:M1:λ-Hind Ⅲ DNA Marker; 1:CuNiR-P-1 Nde I/HindⅢ酶切; 2:CuNiR-P-2 Nde I/HindⅢ酶切; M2:DNA Marker DL2000。

2.4CuNiR目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)

將經(jīng)鑒定正確的原核重組表達(dá)質(zhì)粒載體pET-22b(+)/CuNiR(CuNiR-P-1)轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coliBL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。菌體裂解物進(jìn)行SDS-PAGE電泳,由圖5可知,泳道1～3空表達(dá)載體pET-22b(+)宿主菌BL21(DE3)未見目的蛋白,而泳道4和5約36 kDa位置處出現(xiàn)特異條帶,與預(yù)期表達(dá)的相對(duì)分子質(zhì)量相符,說明目的蛋白CuNiR在宿主菌E.coliBL21(DE3)中成功表達(dá),且在全細(xì)胞和細(xì)胞漿的可溶性蛋白中檢測(cè)到目的蛋白。由此可知，目的蛋白CuNiR在大腸桿菌中可溶表達(dá)。

圖5 目的蛋白CuNiR的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE analysis of CuNiR protein注:1:pET-22b(+)全細(xì)胞;2:pET-22b(+)上清; 3:pET-22b(+)沉淀;4:pET-22b(+)/CuNiR全細(xì)胞; 5:pET-22b(+)/CuNiR上清;6:pET-22b(+)/CuNiR沉淀; M:TakaRa Protein Marker(Low)。

2.5CuNiR的純化與酶活檢測(cè)

在搖瓶水平,1 L發(fā)酵液經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)2 h離心收集菌體,超聲破碎后得到CuNiR上清液蛋白。破碎上清液經(jīng)Ni-NTA純化重組蛋白,SDS-PAGE檢測(cè)洗脫收集液,如圖6所示。目標(biāo)蛋白被120、300 mmol/L咪唑溶液洗下收集,獲取純度較高且濃度較大的目標(biāo)蛋白。純化后CuNiR總蛋白含量為96 mg,比活力為123.82 U/mg,總活力為11887.08 U。

圖6 重組含銅亞硝酸還原酶CuNiR的分離純化Fig.6 Purification of the recomninant CuNiR注:M:低分子量蛋白Marker; 1:E.coli BL21(DE3)/pET22b-CuNiR細(xì)胞裂解液; 2:Ni-NTA純化后CuNiR過柱后洗脫液; 3:磷酸緩沖液(pH7.5)洗脫液;4:20 mmol/L咪唑洗脫液; 5:120 mmol/L咪唑洗脫液;6:300 mmol/L咪唑洗脫液。

3 結(jié)論

亞硝酸還原酶大多數(shù)為胞內(nèi)酶,受分離純化技術(shù)的影響,該酶的應(yīng)用受到了極大限制[14]。本研究所用的pET系列表達(dá)載體是有史以來在E.coli中克隆表達(dá)重組蛋白功能最強(qiáng)大的系統(tǒng),保證外源目的基因成功表達(dá)與純化。本實(shí)驗(yàn)中我們選擇了帶有NdeⅠ酶切位點(diǎn)的表達(dá)載體pET-22b(+),該表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)C端有一個(gè)能編碼6個(gè)組氨酸的融合標(biāo)簽His-Tag,6×His通常不影響表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性,因而不必通過酶水解獲得目的蛋白,使表達(dá)的整個(gè)過程更為簡(jiǎn)單,同時(shí)該融合標(biāo)簽可用于目的蛋白的檢測(cè)和純化。在融合標(biāo)簽His-Tag后還相連一個(gè)終止密碼子TGA,它保證了目的蛋白和His-Tag的完整表達(dá)[15-16]。截至目前文獻(xiàn)報(bào)道亞硝酸還原酶主要集中于甜菜、小麥、菠菜等植物中[17-18],而微生物亞硝酸還原酶報(bào)道較少[19-20]。本研究將含銅亞硝酸還原酶基因成功克隆并構(gòu)建表達(dá)載體pET22b,再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá),目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)顯示為可溶表達(dá),隨后利用鎳柱親和層析純化蛋白,酶比活可達(dá)123.82 U/mg,為下一步酶學(xué)性質(zhì)研究及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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Cloning,expression and purification of copper nitrite reductase

WEI Ji-dong1,2,ZHANG Qing-fang1,2,DOU Shao-hua1,2,YU Shuang1,2,CHI Nai-yu1,2,WANG Xiao-hui1,2,*

(1.School of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian 116622,China; 2.Liaoning Technology of Marine Microbiological Engineering Research Center,Dalian 116622,China)

In this study,a novel copper nitrite reductase gene was cloned fromAchromobacterxylosoxidansDL-1 by using a PCR protocol. The gene contained a 1083 bp open reading frame encoding a 360 amino acid protein with an estimated molecular mass of 38.924 kDa and isoelectronic point(pI)of 4.83,namedCuNiR(Genebank no. KX674378). Based on domains analysis,CuNiRhad a signal peptide,a copper binding site classified as Cu-oxidase-3,and one nitrite reductase catalytic domain(Cu-oxidase). A recombinant plasmid,pET22b-CuNiRwas constructed and transformed intoE.coliBL21(DE3). The cells were induced by addition of IPTG.CuNiRhad been successfully expressed by the analysis of sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE). The recombinant protein was purified by Ni-NTA resin,and the specific activity was 123.82 U/mg,which lay the theoretical basis for biochemical characterization of the copper nitrite reductase.

AlcaligenesxylosoxidansDL-1;copper nitrite reductase;cloning;expression;purification

2016-12-14

魏計(jì)東(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：微生物與酶工程，E-mail：weijidongsk@163.com。

*通訊作者:王曉輝(1981-)，女，博士，副教授，研究方向：微生物與酶工程，E-mail：wangxiaohui@dlu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31500039)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)14-0101-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.020