噬菌體展示技術(shù)在食品安全分析中的應(yīng)用

趙巖巖,趙圣明,梁 穎,劉賢金,張 浩,李紅波,屠 康(.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003; .江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所,江蘇南京 004; 3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),江蘇省肉類(lèi)生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 0095)

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噬菌體展示技術(shù)在食品安全分析中的應(yīng)用

趙巖巖1,趙圣明1,梁 穎2,劉賢金2,張 浩1,李紅波1,屠 康3,*
(1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003; 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所,江蘇南京 210014; 3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),江蘇省肉類(lèi)生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210095)

隨著噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展,其在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用也越來(lái)越多,該技術(shù)可以作為一種高效的抗體制備技術(shù)應(yīng)用于食品中常見(jiàn)的抗生素、生物毒素、有害小分子的檢測(cè)及食源性致病菌控制,同時(shí)可以開(kāi)發(fā)有毒待檢物的替代品建立綠色檢測(cè)技術(shù)。此外,噬菌體展示技術(shù)在新型食品防腐劑開(kāi)發(fā)等方面也具有廣闊的應(yīng)用前景。本文在介紹噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上,對(duì)其在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

噬菌體展示技術(shù),高通量篩選,食品安全,檢測(cè)

噬菌體展示技術(shù)是上世紀(jì)80年代興起的一種生物學(xué)技術(shù),該技術(shù)以噬菌體或噬菌粒為載體,將外源多肽或蛋白基因整合到噬菌體基因組中,外源蛋白以融合形式表達(dá)并展示在噬菌體表面,可以實(shí)現(xiàn)表型和基因型的同步篩選[1-2]。隨著噬菌體技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,噬菌體展示技術(shù)迅速成為諸多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),其在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。本文在對(duì)噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行介紹的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)其在食品安全分析中的應(yīng)用進(jìn)行分類(lèi)綜述,并展望了該技術(shù)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用前景,以期為相關(guān)學(xué)者提供參考。

1 噬菌體展示技術(shù)

20世紀(jì)80年代,噬菌體展示技術(shù)逐步建立并發(fā)展起來(lái),該技術(shù)系統(tǒng)由改造后的噬菌體、輔助噬菌體和宿主細(xì)菌等構(gòu)成,可以對(duì)多基因進(jìn)行體外克隆、體內(nèi)克隆和重組表達(dá)[3]。噬菌體展示技術(shù)可以將抗體表達(dá)在重組噬菌體衣殼蛋白的表面,通過(guò)對(duì)抗原進(jìn)行多輪親和篩選,分離獲得目的抗體,為抗體的制備提供了新的方法[4-5]。

噬菌體展示技術(shù)所展示的片段,可以是天然抗體、免疫抗體、人工合成抗體或多肽,對(duì)應(yīng)的庫(kù)分別為天然抗體庫(kù)、免疫抗體庫(kù)、人工合成抗體庫(kù)和肽庫(kù)[6]。以未經(jīng)免疫動(dòng)物的mRNA為模板,克隆抗體可變區(qū)基因,連接到載體上,構(gòu)建獲得的抗體庫(kù)為天然抗體庫(kù)。由于天然抗體庫(kù)未經(jīng)免疫,相對(duì)免疫庫(kù)多樣性更好,不僅局限于對(duì)某一種或幾種抗原的識(shí)別,能夠?qū)Χ喾N抗原進(jìn)行識(shí)別,其應(yīng)用范圍相對(duì)更加廣泛。以免疫動(dòng)物的雜交瘤細(xì)胞或B細(xì)胞的mRNA為模板,克隆抗體可變區(qū)基因,并將其與載體連接,構(gòu)建的庫(kù)為免疫抗體庫(kù)。經(jīng)抗原免疫后,機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的特異性抗體,因此,免疫抗體庫(kù)含有大量的特異性抗體基因,可以針對(duì)抗原篩選高親和力的抗體。抗原與抗體的特異性結(jié)合主要取決于抗體重鏈、輕鏈可變區(qū),通過(guò)基因工程手段對(duì)抗體可變區(qū)基因進(jìn)行改造,利用這種方法獲得的抗體庫(kù)稱(chēng)為人工合成抗體庫(kù)。展示的抗體片段包括Fab、scFv、sDAB和DAB等抗體分子[7],其結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1。通過(guò)化學(xué)合成寡核苷酸片段,連接載體,構(gòu)建的展示庫(kù)稱(chēng)為肽庫(kù),肽庫(kù)編碼的肽段可以是從幾肽到數(shù)十肽的隨機(jī)肽段。

圖1 抗體分子結(jié)構(gòu)[7]Fig.1 Antibody molecule structures[7]

噬菌體展示技術(shù)為研究蛋白間的相互作用提供了有利工具,在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)檢測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[8]。為了滿(mǎn)足各種應(yīng)用環(huán)境的要求和挑戰(zhàn),噬菌體展示技術(shù)也在不斷地改良和更新,目前為止已經(jīng)構(gòu)建了M13[3]、λ[9]、T4[10]和T7[11]等噬菌體展示系統(tǒng)。噬菌體展示技術(shù)發(fā)展歷程如圖2所示。

圖2 噬菌體展示技術(shù)發(fā)展歷程[12]Fig.2 The development history of the phage display[12]

在抗體篩選上,與傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)相比,噬菌體展示技術(shù)的優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在:減少或避免實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用、抗體生產(chǎn)周期短、成本低、操作相對(duì)簡(jiǎn)便[13]。此外,篩選的高效率性使得目標(biāo)蛋白含量在非常低的情況下,通過(guò)感染得到富集,使獲得高親和力目標(biāo)蛋白成為可能;利用噬菌體展示技術(shù)篩選獲得的蛋白,可確定其基因型,因此更方便地對(duì)其進(jìn)行基因改造,以期獲得更為理想的蛋白。

噬菌體展示技術(shù)將不同DNA編碼的蛋白片段作為噬菌體衣殼蛋白的一部分展示在噬菌體表面,可以實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中表達(dá)數(shù)百萬(wàn)大庫(kù)容的文庫(kù),在對(duì)蛋白進(jìn)行篩選的過(guò)程中,同時(shí)實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因的篩選,即基因型與表型的統(tǒng)一[14]。展示特異結(jié)合位點(diǎn)的噬菌體可以通過(guò)多輪結(jié)合、洗滌、洗脫和擴(kuò)增的篩選過(guò)程得到富集。篩選示意圖如圖3所示。利用某一靶標(biāo)對(duì)展示庫(kù)進(jìn)行篩選,與該靶標(biāo)相關(guān)的配基會(huì)被結(jié)合,未結(jié)合的噬菌體在洗滌過(guò)程中被洗去,結(jié)合的噬菌體通過(guò)洗脫進(jìn)行回收,然后擴(kuò)增富集回收的噬菌粒,經(jīng)幾輪篩選后,獲得具有高結(jié)合活性的噬菌粒,再進(jìn)一步對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行分析,即可獲得目的配基[15]。

圖3 抗體庫(kù)篩選流程圖[16]Fig.3 Selection of antibody by phage display protocol[16]

2 噬菌體展示技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用

自從1985年Smith首次報(bào)道噬菌體展示技術(shù)以來(lái),噬菌體展示技術(shù)迅速的成為諸多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),其中包括食品安全領(lǐng)域。食品安全長(zhǎng)期以來(lái)一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。隨著噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展,利用噬菌體展示技術(shù)篩選食品中有害物質(zhì)抗體的研究也越來(lái)越多,包括在抗生素分析中的應(yīng)用,生物毒素分析中的應(yīng)用,農(nóng)藥小分子檢測(cè)中的應(yīng)用,及食源性致病菌防治中的應(yīng)用。下面主要對(duì)噬菌體展示技術(shù)在食品安全這幾個(gè)方面的應(yīng)用展開(kāi)詳細(xì)的介紹。

2.1 在抗生素分析中的應(yīng)用

由于抗生素的濫用導(dǎo)致食品中抗生素殘留超標(biāo)已經(jīng)成為食品安全領(lǐng)域人們愈發(fā)關(guān)注的焦點(diǎn)。噬菌體展示技術(shù)為抗生素免疫檢測(cè)中抗體的獲得提供了新思路,近年來(lái)已通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選獲得了多種抗生素的抗體。Burmester等[17]利用免疫小鼠構(gòu)建的單鏈抗體庫(kù),篩選獲得與氨芐西林具有良好識(shí)別活性的單鏈抗體,并對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)、結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了分析研究。Xiao等[18]利用構(gòu)建的免疫單鏈抗體庫(kù),篩選伊維菌素單鏈抗體,最終獲得10個(gè)與伊維菌素具有良好結(jié)合活性的克隆。Nejad[19]利用莫能菌素作為半抗原免疫小鼠構(gòu)建免疫單鏈抗體庫(kù),篩選獲得能夠識(shí)別莫能菌素的單鏈抗體,并建立了熒光偏振免疫分析方法。孟輝等[20]以免疫獲得的雜交瘤細(xì)胞株為基因來(lái)源構(gòu)建噬菌體展示單鏈抗體庫(kù),經(jīng)篩選后獲得9個(gè)與慶大霉素具有結(jié)合活性的單鏈抗體。上述噬菌體展示抗體的開(kāi)發(fā),使抗體的大量制備變得簡(jiǎn)單易行,所獲得的抗體在今后的改造過(guò)程當(dāng)中也更容易操作,為免疫檢測(cè)技術(shù)在抗生素檢測(cè)中的發(fā)展奠定了良好的基礎(chǔ)。

2.2 在生物毒素分析中的應(yīng)用

生物毒素包括細(xì)菌毒素、真菌毒素、植物毒素、動(dòng)物毒素、海洋生物毒素等,常常污染食品和飼料,對(duì)人畜造成了極大的危害。因此對(duì)食品和飼料中生物毒素進(jìn)行監(jiān)測(cè)非常必要?；谑删w展示技術(shù)發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)方法已有很多,同時(shí)噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展使毒素的無(wú)毒抗原制備成為可能。Nagumo等[21]利用磁珠篩選法對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行篩選,獲得識(shí)別魚(yú)肉毒素的抗體。Zhao等[22]利用噬菌體展示技術(shù)篩選獲得了能識(shí)別微囊藻毒素的多肽。Iain等[23]利用自己構(gòu)建的軟骨藻酸羊免疫抗體庫(kù),基于篩選獲得的抗體建立了檢測(cè)軟骨藻酸的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。Doyle等[24]利用免疫羊駝構(gòu)建的乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單域抗體庫(kù),篩選獲得其單域抗體,并建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)分析方法和熒光偏振免疫分析方法。Houwelingen等[25]利用噬菌體展示庫(kù)篩選獲得赭曲霉毒素的納米抗體,建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。Wang等[26]利用噬菌體展示隨機(jī)8肽庫(kù)篩選獲得能夠模擬黃曲霉毒素表位的多肽,并建立了綠色ELISA檢測(cè)方法。Xue等[27]制備黃曲霉細(xì)胞壁免疫雞,構(gòu)建雞源單鏈抗體庫(kù),從中篩選出高親和力的單鏈抗體,與堿性磷酸酶融合表達(dá)后建立高靈敏度的黃曲霉檢測(cè)方法。Qiu等[28]利用納米抗體庫(kù)和嘔吐毒素的單克隆抗體進(jìn)行篩選,獲得兩個(gè)與嘔吐毒素單克隆抗體具有結(jié)合活性的納米抗體,可以替代嘔吐毒素作為包被抗原應(yīng)用到免疫檢測(cè)中,同時(shí)對(duì)模擬抗原的分子機(jī)制進(jìn)行了研究。Hu等[29]對(duì)親和力成熟的單鏈抗體庫(kù)進(jìn)行篩選,獲得識(shí)別伏馬菌素的單鏈抗體,并用于伏馬菌素的免疫檢測(cè)。Xu等[30]利用噬菌體單域抗體庫(kù)篩選獲得桔霉素的抗獨(dú)特型抗體,并應(yīng)用于桔霉素的檢測(cè)中。Wang等[31]篩選獲得了玉米烯醇的抗獨(dú)特型抗體,并建立了免疫PCR檢測(cè)方法,用于谷物中玉米烯醇的檢測(cè)。同時(shí)一些毒素的抑制劑也被發(fā)現(xiàn),Gupta等[32]利用噬菌體展示技術(shù)篩選獲得能夠中和大腸桿菌內(nèi)毒素的單域抗體。上述抗體的制備為生物毒素的檢測(cè)提供了有效的檢測(cè)方法;一些抗獨(dú)特型抗體可以替代有毒抗原的使用,建立了綠色免疫檢測(cè)新技術(shù),降低了檢測(cè)過(guò)程中有毒抗原給檢測(cè)人員及環(huán)境造成的危害。

2.3 在食品中有害小分子檢測(cè)中的應(yīng)用

自噬菌體展示技術(shù)出現(xiàn)以來(lái),已篩選獲得多種農(nóng)藥小分子的抗體和抗獨(dú)特型抗體[33],為小分子的免疫檢測(cè)提供了新材料。與此同時(shí),建立食品中多殘留免疫檢測(cè)方法,用于農(nóng)藥的快速篩查已經(jīng)成為目前一個(gè)熱門(mén)研究方向,噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展為其提供了有力的工具。Tiejun等[34]通過(guò)免疫小鼠并構(gòu)建甲胺磷免疫噬菌體展示抗體庫(kù),從中篩選獲得與甲胺磷具有良好結(jié)合活性的抗體,并建立甲胺磷競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。Brichta等[35]采用固相篩選法利用2,4-二氯苯氧乙酸除草劑對(duì)未經(jīng)免疫的抗體庫(kù)進(jìn)行篩選,獲得具有結(jié)合活性的抗體,并建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。Yi等[36]利用丙酸、阿特拉津、西瑪津、異丙隆衍生物作為半抗原混合免疫家兔,構(gòu)建噬菌體單鏈抗體庫(kù),篩選出與半抗原具有結(jié)合活性的單鏈抗體。González-Techera等[37]利用噬菌體展示的免疫復(fù)合物多肽,構(gòu)建了檢測(cè)草脫凈電化學(xué)免疫傳感器。Liu等[38]利用7肽庫(kù)篩選獲得識(shí)別吡蟲(chóng)啉的多肽,建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法,并對(duì)水樣和土樣中吡蟲(chóng)啉進(jìn)行了檢測(cè)。Hua等[39]基于噬菌體展示肽庫(kù)篩選獲得的多肽,建立了有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法。小分子農(nóng)藥對(duì)人體和環(huán)境也存在著一定的毒性,其抗獨(dú)特型抗體在免疫檢測(cè)中可以替代抗原,開(kāi)發(fā)無(wú)毒免疫檢測(cè)技術(shù)。實(shí)踐生產(chǎn)環(huán)節(jié)中需要此類(lèi)快速篩查技術(shù)對(duì)果蔬中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行初步檢測(cè),保證人們能夠享受新鮮果蔬,同時(shí)也確保了食品的安全性。除了檢測(cè)農(nóng)藥小分子外,噬菌體展示技術(shù)還被用于食品添加劑的檢測(cè)。Lee等[40]研究對(duì)12肽庫(kù)進(jìn)行5輪篩選后,獲得能夠識(shí)別苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯的多肽,并有望應(yīng)用于檢測(cè)。

2.4 在食源性致病菌控制中的應(yīng)用

目前利用噬菌體展示技術(shù),篩選肽或蛋白用于食源性致病菌防治的研究已有報(bào)道。在實(shí)際應(yīng)用中這些多肽或蛋白可能出現(xiàn)穩(wěn)定性差、易降解等問(wèn)題,利用其易于改造的特點(diǎn),Pini等[41]利用十肽庫(kù)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行篩選,獲得具有抑菌活性的多肽,并將其改造成對(duì)肽酶和蛋白酶穩(wěn)定、抑菌活性顯著提高的抗菌肽。Bishop-Hurley等[42]利用噬菌體展示肽庫(kù)篩選獲得11個(gè)與空腸彎曲桿菌具有結(jié)合活性并能抑制其生長(zhǎng)的多肽。Sainath等[43]利用噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)篩選獲得識(shí)別大腸桿菌表面的多肽,獲得的多肽對(duì)革蘭氏陰性菌具有抑菌活性,對(duì)大腸桿菌和綠膿桿菌具有良好的抑菌活性。鑒于上述新型抗菌物質(zhì)的發(fā)現(xiàn),通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選獲得抑菌蛋白替代傳統(tǒng)的化學(xué)防腐劑在食品防腐保鮮領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。Agrawal等[44]篩選肽庫(kù)獲得可以用于鼠傷寒沙門(mén)氏菌檢測(cè)的多肽,可以用于檢測(cè)食品中鼠傷寒沙門(mén)氏菌污染的程度。在食品安全備受人們關(guān)注的大環(huán)境下,相信該技術(shù)也將能夠被更廣泛地應(yīng)用于食源性致病菌的預(yù)防和控制中。

3 前景與展望

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó),抗生素、農(nóng)藥的使用,食品中微生物及其毒素的污染,給食品安全帶來(lái)了潛在的威脅。食品中有害成分的檢測(cè)及致病微生物的控制已經(jīng)成為當(dāng)前食品安全領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),近年來(lái)基于噬菌體展示技術(shù)發(fā)展起來(lái)的高通量篩選技術(shù)在食品安全領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。在篩選特異性的噬菌體、抗體、多肽等時(shí),噬菌體展示篩選庫(kù)容量大、周期短、操作簡(jiǎn)單成本低等優(yōu)勢(shì)[45]。在對(duì)食品中有毒有害物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí),可以利用噬菌體展示技術(shù)篩選其模擬抗原,進(jìn)一步結(jié)合相關(guān)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù),建立綠色、安全的檢測(cè)方法,以期減少對(duì)人體和環(huán)境所造成的危害。利用噬菌體展示技術(shù)篩選獲得具有抑菌活性的多肽可以用于食品中微生物污染的控制。在食品安全領(lǐng)域快速發(fā)展的大背景下,噬菌體展示技術(shù)也會(huì)得到飛速發(fā)展,其優(yōu)勢(shì)也將得到更充分的應(yīng)用?？躬?dú)特型抗體具有模擬抗原活性的潛能,今后對(duì)噬菌體展示技術(shù)的研究,可以從篩選獲得農(nóng)藥的抗獨(dú)特型抗體開(kāi)展,篩選具有農(nóng)藥功效的綠色替代品,減少農(nóng)藥的使用,從根源上減少農(nóng)藥對(duì)食品造成的污染;還可以將噬菌體展示技術(shù)與其他先進(jìn)技術(shù)如膠體金技術(shù)結(jié)合使用,兩者的結(jié)合使其在應(yīng)用中更加快速、便捷;也可以將食源性致病菌的蛋白質(zhì)組以噬菌體展示的形式表達(dá),可以用于藥物靶標(biāo)的篩選,用于分析藥物與微生物的相互作用,為食源性致病菌的防治提供新思路。

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Application of phage display technology in food safety

ZHAO Yan-yan1,ZHAO Sheng-ming1,LIANG Ying2,LIU Xian-jin2,ZHANG Hao1,LI Hong-bo1,TU Kang3,*

(1.Department of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China; 2.Ministry of Agriculture Institute of Food Quality Safety and Detection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China; 3.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing, Quality and Safety Control,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

In this article,the phage display technology was described,and its application in food safety was summarized. With the development of the phage display technology,it is widely used in the food safety. It can be used as an efficient method of generation of antibody to detect antibiotic,bio-toxin and small molecule in food,used to screening mimic for developing green detection technology,and the control of foodborne pathogenic bacterial. In addition,this technology also showed broad application in the field of developing novel food preservatives.

phage display technology;high throughput screening;food safety;detection

2016-12-20

趙巖巖(1987-)，女，博士，講師，研究方向：微生物與生物技術(shù)，E-mail：zhaoyanyan@hist.edu.cn。

*通訊作者:屠康(1968-)，男，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品無(wú)損檢測(cè)、農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工，E-mail：kangtu@njau.edu.cn。

河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃(16IRTSTHN007)；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(162102110065，172102310240)；河南科技學(xué)院高層次人才科研項(xiàng)目(2016019)。

TS201

A

1002-0306(2017)14-0342-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.067