馬櫻丹水提液抗全齒復(fù)活線蟲研究

陶紅麗，沈清清，李雪婷，李文強(qiáng)，陳文燕，胡艷瓊

（文山學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099）

馬櫻丹水提液抗全齒復(fù)活線蟲研究

陶紅麗，沈清清，李雪婷，李文強(qiáng)，陳文燕，胡艷瓊

（文山學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099）

通過研磨和熬煮的方法分別提取馬櫻丹莖、葉、花的水提液，并測定其對全齒復(fù)活線蟲的毒殺效果。結(jié)果表明：研磨方法提取的馬櫻丹葉、花、莖水提液原液處理線蟲72 h時(shí)，死亡率分別為100%、100%、80.52%；熬煮方法提取的馬櫻丹葉、花、莖水提液原液處理線蟲72 h時(shí)，死亡率分別為100%、91.76%、70.03%；其中葉的殺線蟲活性最強(qiáng)，花，莖次之；馬櫻丹水提液中毒殺線蟲的有效物質(zhì)具耐高溫性，隨著稀釋倍數(shù)的增大，水提液對線蟲的毒殺效果逐漸減小，當(dāng)稀釋倍數(shù)大于4倍時(shí)，殺線蟲活力顯著下降，表明馬櫻丹不同部位的水提液抗線蟲活性與其濃度呈正相關(guān)。

馬櫻丹；線蟲；毒殺活性；防治；死亡率

線蟲是一類比較低等和簡單的無脊椎軟體動(dòng)物，分布廣泛，種類繁多，是植物病害的主要病原之一，危害較大，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界范圍內(nèi)每年因線蟲給農(nóng)業(yè)和林業(yè)生產(chǎn)帶來的損失高達(dá)32%。[1]線蟲的防治方法眾多，其中化學(xué)防治法是最主要的、也是應(yīng)用最廣泛的防治措施，但是化學(xué)藥劑的長期使用帶來了一些不好的影響，例如土壤板結(jié)，環(huán)境嚴(yán)重受到污染等。當(dāng)務(wù)之急便是開發(fā)出能取而代之的既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保的新型高效殺線劑生物農(nóng)藥。因此利用植物天然活性物質(zhì)開發(fā)出成本低、對寄生線蟲有害、對人及其他非靶標(biāo)生物安全、可生物降解、且降解產(chǎn)物對環(huán)境無不良影響的天然的新型、環(huán)保型生物農(nóng)藥成為了新的研究熱點(diǎn)。[2-3]近年來，我國眾多科研人員如翁群芳[4]、邱雪柏[5]、蘇秀榮[6]、江春[7]等陸續(xù)開展了多種植物源殺線蟲活性物質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)夾竹桃、萬壽菊、馬錢、銀膠菊、駱駝蓬、黃文江魚藤、桃花心木、油椒、茵陳蒿等植物提取液對農(nóng)林病原線蟲均具有顯著毒殺效果。

馬櫻丹（Lantana camara）原產(chǎn)于美洲，在其產(chǎn)地侵占了大面積的牧場和耕地，現(xiàn)分布于近50個(gè)國家，被列為Ⅱ級危害程度的外來入侵植物，其治理是世界級難題。目前已從馬櫻丹植物組織中提取出了揮發(fā)油、酚酸類和黃酮類等化感物質(zhì)，馬櫻丹的葉與花中揮發(fā)出的氣味，具有很強(qiáng)的驅(qū)蚊效果，但對人體無害。如果將它作為資源和產(chǎn)品原材料加以轉(zhuǎn)化利用，開發(fā)成為綠色肥料和天然殺線蟲劑，一方面將帶來巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，另一方面帶來的是雙向性的環(huán)保價(jià)值。本文首次研究了馬櫻丹的水提液對線蟲的抑制效應(yīng)，以期為進(jìn)一步開發(fā)和利用馬櫻丹提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為研制和開發(fā)各種天然殺線劑、殺蟲劑、殺菌劑、生物農(nóng)藥等提供了新的研究思路和方法。

1 供試材料與方法

1.1 供試植物

供試植物：馬櫻丹 （莖、葉、花等三個(gè)部位），采自云南省文山市。

1.2 線蟲的培養(yǎng)

供試線蟲：全齒復(fù)活線蟲 （Panagrellus redivivus），由云南大學(xué)微生物資源開發(fā)和利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.1 供試線蟲的培養(yǎng)與分離

200 mL三角瓶中裝入30 g燕麥，加入無菌水混勻后121℃、0.1 MPa條件下滅菌15 min，冷卻后接入全齒復(fù)活線蟲原種，置于搖床培養(yǎng)箱中，28 ℃條件下培養(yǎng)6～8 d。之后參照貝曼氏漏斗法（Bearmen）[8]分離線蟲。

1.3 供試植物水提液的制備

植物材料分為2組，每組材料稱取新鮮馬櫻丹的莖、葉、花各1份樣品，每份樣品100 g。實(shí)驗(yàn)1組的材料經(jīng)過消毒處理后放入研缽中，加入少量石英砂和無菌水后研磨均勻呈漿狀，定容至50 mL，浸提24 h無菌濾紙過濾后用離心機(jī)在4 000 r/min 條件下離心10 min，除去殘?jiān)笥脽o菌水再次定容至100 mL，使水提液的質(zhì)量濃度為1.0 g/mL；實(shí)驗(yàn)2組的材料分別放入不銹鋼容器中，加入適量水熬煮30 min，無菌濾紙過濾后用離心機(jī)在4 000 r/min 條件下離心10 min，用無菌水定容到100 mL，質(zhì)量濃度為1.0 g/mL。

2 抗線蟲活性研究

將馬櫻丹的莖、葉、花經(jīng)過研磨處理和熬煮處理后獲得的水提液母液進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋，在無菌條件下用移液器分別取不同倍數(shù)的稀釋液3 mL置于小培養(yǎng)皿中（直徑2 cm），之后在每個(gè)小培養(yǎng)皿中加入100條全齒復(fù)活線蟲，另取3 mL無菌水加入培養(yǎng)皿后再放入100條線蟲（空白對照），每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，將所有樣品同時(shí)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，溫度設(shè)為28℃。當(dāng)處理時(shí)間達(dá)24 h、48 h和72 h時(shí)，分別將所有樣品取出在解剖鏡下用“針觸法”記錄全齒復(fù)活線蟲的死亡率。[9]死亡率的計(jì)算方法參照“式（1）”，校正死亡率的方法參照“式（2）”。線蟲死亡率計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)參見蔡秋錦1998年發(fā)表的方法。[10]

線蟲死亡率（%）=（死亡線蟲數(shù)/供試線蟲數(shù)）×100 % （ 1）

線蟲校正死亡率（%）=[（處理組線蟲死亡率－對照組線蟲死亡率）/（1－對照組線蟲死亡率）]×100%（2）

水提液的殺線蟲活性強(qiáng)弱按5個(gè)等級區(qū)分[11]：校正死亡率≤10%，表示無殺線蟲活性，用符號“－”標(biāo)注；校正死亡率為10%～30%，表示殺線蟲活性弱，用符號“＋”標(biāo)注；校正死亡率為30%～50%，表示殺線蟲活性中等，用符號“＋＋”標(biāo)注；校正死亡率為50%～80%，表示殺線蟲活性較強(qiáng)，用符號“＋＋＋”標(biāo)注；校正死亡率>80%，表示殺線蟲活性強(qiáng)，用符號“＋＋＋＋”標(biāo)注。

3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件和Microsoft Excel 2003對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為顯著差異。

4 結(jié)果與分析

4.1 馬櫻丹研磨水提液對線蟲的影響

由表1可見，葉的水提液稀釋2、4、8倍處理72 h后，對全齒復(fù)活線蟲的毒殺效果均較好，葉的水提液校正死亡率依次為95.88%、84.27%、63.29%；花的水提液校正死亡率依次為88.01%、71.91%、54.68%；莖的水提液稀釋成2、4、8倍處理72 h后，對全齒復(fù)活線蟲的毒殺效果也較好，校正死亡率分別為71.54%、57.68%、36.33%。因此，由表1分析可知，葉和花的水提液對線蟲的毒殺活性最大，即使將其稀釋至8倍，仍具有較強(qiáng)的活性，莖的水提液毒殺活性相對較弱。另外，馬櫻丹水提液的濃度對抗線蟲活性具有顯著的影響，隨著馬櫻丹水提液稀釋倍數(shù)的增加，抗線蟲活性逐漸降低。

表1 馬櫻丹研磨水提液不同濃度對全齒復(fù)活線蟲的毒殺活性

4.2 馬櫻丹熬煮水提液對線蟲的影響

由表2可見，葉和花的水提液稀釋2、4、8倍處理72 h后，對全齒復(fù)活線蟲的毒殺效果都較好，葉的水提液處理校正死亡率依次為85.39%、69.29%、46.07%；花的水提液處理校正死亡率為80.15%、65.54%、65.91%；莖的水提液稀釋成2、4、8倍處理72 h后，對全齒復(fù)活線蟲的毒殺效果稍弱，校正死亡率分別為60.05%、38.95%、14.23%；因此，由表2分析可知，葉和花的水提液對線蟲的毒殺活性最大，即使將其稀釋至4倍，仍具有較強(qiáng)的活性；馬櫻丹熬煮水提液的不同濃度對抗線蟲活性具有顯著的影響，隨著馬櫻丹水提液稀釋倍數(shù)的增加，抗線蟲活性逐漸降低；另外高溫處理?xiàng)l件下獲得的馬櫻丹水提液仍然具有很強(qiáng)的殺線蟲活性，表明其水提液中的有效殺線蟲物質(zhì)具有耐高溫的特性，不屬于生物酶類物質(zhì)。

表2 馬櫻丹熬煮水提液不同濃度對全齒復(fù)活線蟲的毒殺活性

4.3 采集部位對全齒復(fù)活線蟲毒殺活性的影響

4.3.1 研磨水提液

由圖1至圖4可知，同等濃度下馬櫻丹殺線蟲的活性最強(qiáng)的部位是葉，其水提液母液24 h后校正死亡率達(dá)98.96%，48 h為93.91%，72 h達(dá)到100%，其活性強(qiáng)度保持強(qiáng)（+ + + +），稀釋8倍后其水提液對線蟲的校正死亡率24 h時(shí)為31.25%，48 h時(shí)為59.14%，72 h時(shí)為63.29%，仍保持較高活性。

圖 1 不同部位研磨水提液稀釋1倍3個(gè)處理時(shí)間對線蟲的影響

圖 2 不同部位研磨水提液稀釋2倍3個(gè)處理時(shí)間對線蟲的影響

圖 3 不同部位研磨水提液稀釋4倍3個(gè)處理時(shí)間對線蟲的影響

圖 4 不同部位研磨水提液稀釋8倍3個(gè)處理時(shí)間對線蟲的影響

4.3.2 熬煮水提液

由圖5至圖8可知，同等濃度下馬櫻丹的殺線蟲的活性最強(qiáng)的部位仍然是葉，其水提液母液作用24 h后校正死亡率達(dá)82.69%，48 h為87.81%，72 h達(dá)到100%，其活性強(qiáng)度保持強(qiáng)（+ + + +），稀釋8倍后其水提液母液對線蟲的校正死亡率24 h時(shí)為21.18%，48 h時(shí)為32.97%，72 h時(shí)為46.07%，仍保持中等活性。

圖 5 不同部位熬煮水提液稀釋1倍3個(gè)處理時(shí)間對線蟲的影響

圖 6 不同部位熬煮水提液稀釋2倍3個(gè)處理時(shí)間對線蟲的影響

圖 7 不同部位熬煮水提液稀釋4倍3個(gè)處理時(shí)間對線蟲的影響

圖 8 不同部位熬煮水提液稀釋8倍3個(gè)處理時(shí)間對線蟲的影響

5 結(jié)論

1）馬櫻丹的水提液母液殺線蟲活性效果最顯著，將母液稀釋2、4、8倍后，隨著稀釋倍數(shù)的增大，對線蟲的毒殺效果逐漸減小，當(dāng)稀釋倍數(shù)大于4時(shí)，殺線蟲活力顯著下降，說明馬櫻丹不同部位的水提液抗線蟲活性與其濃度呈正相關(guān)。

2）馬櫻丹不同部位水提液抗全齒復(fù)活線蟲活性研究表明，葉、花、莖3個(gè)不同部位水提液對全齒復(fù)活線蟲均有不同程度的毒殺活性，其中葉的活性最強(qiáng)，不管是葉研磨水提液還是熬煮水提液稀釋4倍時(shí)殺線蟲率仍能達(dá)50%以上；而莖的活性相對較低，水提液對全齒復(fù)活線蟲的毒殺作用隨著時(shí)間的延長而有增強(qiáng)的趨勢。

3）馬櫻丹水提液中毒殺線蟲的有效成分具有耐高溫性，其活性物質(zhì)不屬于生物酶。

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（責(zé)任編輯 張 鐵）

A Research on Resistance of Lantana Camara Extracts to Panagrellus Redivivus

TAO Hongli, SHEN Qingqing, HU Yan, LI Xueting, LI Wenqiang, CHEN Wenyan, HU Yanqiong
(School of Resources and Environment, Wenshan University, Wenshan Yunnan 663099, China)

The aqueous extract solution of lantana camara stem, leaf and f l ower is extracted by the methods of grinding and boiling. In addition, the poison effect of it on panagrellus redivivus is measured. When the aqueous extract solution of lantana camara stem, leaf and f l ower extracted by the method of grinding is used to process nematode for 72h, the death rates are100%, 100% and 80.52% respectively. When the aqueous extract solution of lantana camara stem, leaf and f l ower extracted by the method of boiling is used to process for 72h, the death rates were 100%, 91.76%, and 70.03% respectively, which indicated that the nematocidal activity of leaf is the strongest, and then f l ower and stem are the secondary. in addition, it also indicates that the active substance poisoning nematode in aqueous extract solution has the property of high-temperature resistance. With the dilution ratio increasing, the poison effect of aqueous extract solution on nematode is declining. When the dilution ratio was greater than 4 times, the nematocidal activity declines signif i cantly, which indicates that the nematocidal activity on different parts of lantana camara is positively associated with its concentration.

Lantana camara; nematode; toxicity; resistance; mortality

S432

A

1674 - 9200（2017）03 - 0116 - 05

2016 - 09 - 19

陶紅麗，女，彝族，云南楚雄人，文山學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院2012級生物科學(xué)專業(yè)本科生；沈清清，女，云南文山人，文山學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院副教授，碩士，該文指導(dǎo)教師，主要從事微生物資源與生物信息學(xué)研究；李雪婷，女，云南昆明人，文山學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院2013級生物科學(xué)專業(yè)本科生。