布倫口湖群濕地產(chǎn)蛋白酶耐低溫菌株的篩選及初步鑒定

王繼蓮，李明源，任 羽

(喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 喀什 844006)

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布倫口湖群濕地產(chǎn)蛋白酶耐低溫菌株的篩選及初步鑒定

王繼蓮，李明源，任 羽

(喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 喀什 844006)

【目的】從新疆東帕米爾高原布倫口湖群濕地分離產(chǎn)蛋白酶耐低溫細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行初步分類鑒定，為后續(xù)低溫酶制劑的研究應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)?！痉椒ā坷妹撝檫x擇培養(yǎng)基篩選產(chǎn)低溫蛋白酶菌株，并對(duì)其表型特征、生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酶性狀等進(jìn)行研究，結(jié)合16S rRNA 基因序列確定布倫口湖群濕地產(chǎn)低溫蛋白酶功能菌株的遺傳多樣性及分類地位?！窘Y(jié)果】共篩選出6株產(chǎn)蛋白酶菌株，其在15 ℃條件下均能生長(zhǎng)繁殖，屬耐冷菌，但耐鹽性一般，能在低溫條件下發(fā)酵產(chǎn)酶，生長(zhǎng)穩(wěn)定期達(dá)到產(chǎn)酶高峰。16S rRNA 基因序列初步確定4株為假單胞菌(Pseudomonassp.)，另外2株分別為芽孢桿菌(Bacillussp. ) 和節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)?！窘Y(jié)論】本研究篩選到的同屬近緣種群較多，但生理特征各異，這進(jìn)一步拓展了低溫酶菌種資源庫(kù)，為深入探究低溫蛋白酶結(jié)構(gòu)特性及在生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用潛力奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

布倫口湖群濕地；低溫蛋白酶；耐冷菌；16S rRNA

【研究意義】低溫蛋白酶主要由生活在低溫生境中的微生物產(chǎn)生[1-2]，其在低溫(0～20 ℃)下仍能有效催化蛋白質(zhì)肽鍵水解，最適催化溫度一般不超過40 ℃，遠(yuǎn)低于同功能常溫酶(50 ℃)，但高溫下(>60 ℃)易失活[3-4]。這一特性使其在食品醫(yī)藥、日用化工、環(huán)境污染物治理等對(duì)冷要求較高的行業(yè)有重要應(yīng)用潛力和開發(fā)價(jià)值[5-6]，有著中高溫酶無可比擬的優(yōu)越性。如在糕點(diǎn)烘烤過程中，低溫蛋白酶能有效降低生面團(tuán)發(fā)酵時(shí)間，提升面包心質(zhì)量，改善面包香味及濕度，且經(jīng)高溫短時(shí)處理即失活，阻止酶作用過度，不至使面包變得太軟或太粘。隨著世界各國(guó)逐步加強(qiáng)對(duì)低溫酶制劑產(chǎn)業(yè)的科研開發(fā)支持力度，從極端低溫環(huán)境中開發(fā)產(chǎn)酶功能微生物資源成為研究熱點(diǎn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自20世紀(jì)70 年代以來，人們相繼自深海、極地、冰川雪冰、常年凍土等常年酷寒生境中篩選低溫蛋白酶高產(chǎn)菌株[7-9]，并從中挖掘到一些優(yōu)質(zhì)高效、具有新特性的產(chǎn)酶新菌種，但對(duì)濕地這一富有生物多樣性的自然生態(tài)系統(tǒng)的研究卻鮮有報(bào)道。濕地是水域和陸地生態(tài)系統(tǒng)之間的過渡綜合體，具有獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)價(jià)值和資源潛力，與森林、海洋一起并稱為全球三大生態(tài)系統(tǒng)[10-11]。濕地同時(shí)還是天然的微生物基因庫(kù)，為研究不同歷史時(shí)期自然環(huán)境演變對(duì)微生物時(shí)空格局影響以及豐富物種多樣性提供了極好框架?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】布倫口湖群濕地位于新疆喀什西南部，屬塔里木河水系(平均海拔3300 m，38°25′～39°00′N，74°40′～75°00′E)，由發(fā)源于西昆侖山及帕米爾高原的許多河流及山泉供水形成的微咸水湖泊和沼澤、灘地組成，面積20 km2[12]。作為我國(guó)最西部的高原湖泊群濕地，布倫口湖群濕地冬季受西伯利亞高壓影響強(qiáng)烈，寒冷漫長(zhǎng)，平均氣溫-4.8 ℃，是低溫微生物的生存棲息地，也是分泌新型活性先導(dǎo)化合物，如酶、色素、多糖、抗凍蛋白等菌株的潛在種源地?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文自布倫口湖群濕地分離高產(chǎn)低溫蛋白酶細(xì)菌菌株，了解其生理特征并揭示菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為深入探究極端酶的結(jié)構(gòu)特性及在生物工程領(lǐng)域的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

1.1.1 主要試劑設(shè)備 細(xì)菌基因組DNA提取及膠回收試劑盒：北京康為世紀(jì)生物公司；PCR 擴(kuò)增全套試劑及擴(kuò)增引物：TaKaRa(大連)公司；相關(guān)生理生化試劑：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑廠和天津登科化學(xué)試劑廠。

高速冷凍離心機(jī)5430R、PCR儀 Mastercycler pro S：德國(guó) Eppendorf公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠；JY04S-3C凝膠成像系統(tǒng)：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 蛋白酶篩選培養(yǎng)基：脫脂乳粉20 g/L、酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、瓊脂20 g/L，pH值7.2。種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、葡萄糖10 g/L、氯化鈉10 g/L，pH值7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨20 g /L、酵母提取物10 g/L、葡萄糖5 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 1g/L，KCl 0.5 g/L，pH值7.2。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集 采集布倫口湖群濕地不同積水狀態(tài)樣品，采集時(shí)環(huán)境溫度4 ℃。所得樣品混合置于含冰袋的保鮮盒內(nèi)，12 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室處理備用。在超凈工作臺(tái)將樣品與蒸餾水按照1∶5比例混勻，置于搖床震蕩15 min，靜置20 min備用。

1.3.2 產(chǎn)酶菌株篩選 將樣品懸液適度稀釋，用移液槍吸取100 μl均勻涂布到蛋白酶篩選培養(yǎng)基上，15 ℃低溫倒置培養(yǎng)1～2 d，觀察平板上蛋白水解圈形成情況，并測(cè)量水解圈直徑D(mm)和菌落直徑d(mm)。選取D/d值較大菌株在選擇平板上不斷劃線純化，直至獲得純培養(yǎng)物，即為初篩到的產(chǎn)蛋白酶低溫菌株。將其保存到一定濃度的滅菌甘油保藏管中，-80 ℃凍存。

用接種針挑取一環(huán)純培養(yǎng)菌株至5 mL種子培養(yǎng)基試管中，經(jīng)15 ℃，180 r /min搖床振蕩培養(yǎng)18 h即得種子液。按照3 %接種量將種子液接入150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min高速離心5 min，棄下層菌體沉淀，所得上清即為蛋白酶粗酶液。

1.3.3 低溫蛋白酶活力測(cè)定 采用Folin-酚顯色法測(cè)定粗酶活力[13]。酶活力單位定義: 在15 ℃和pH 7.0條件下，樣品每分鐘水解底物酪蛋白降解釋放出1 μg酪氨酸所需酶量為1個(gè)酶活單位(U)。

1.3.4 理化因素對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶特性影響 ①最適生長(zhǎng)溫度及耐鹽性測(cè)定。將培養(yǎng)好的菌懸液按3 %接種量接入5 mL種子培養(yǎng)基試管中，分別于不同溫度梯度(10、15、18、25、30、37 ℃)下200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定不同溫度下各菌株OD420nm值，確定其最適宜生長(zhǎng)溫度。將各菌種分別接入不同NaCl含量 (1 %、4 %、6 %、8 %、10 %、12 %、14 %、16 % )的發(fā)酵培養(yǎng)基中，最適生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)48 h后測(cè)OD420nm值。②菌株的生長(zhǎng)曲線及其產(chǎn)酶特性。將產(chǎn)酶菌株種子液按3 %接入量接入裝有150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在各自最適生長(zhǎng)溫度下180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，每隔12 h測(cè)定培養(yǎng)基中各菌株OD420nm光密度值及蛋白酶活力，確定菌株生長(zhǎng)情況及產(chǎn)酶狀況，并繪制生長(zhǎng)和產(chǎn)酶曲線。

1.3.5 產(chǎn)蛋白酶菌株的16S rRNA 基因序列與系統(tǒng)發(fā)育分析 用試劑盒提取產(chǎn)酶菌株的基因組DNA，以細(xì)菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。目的產(chǎn)物經(jīng)上海生工的膠回收試劑盒純化完成測(cè)序。測(cè)序返回結(jié)果利用BLAST工具從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列同源性搜索，選取基因庫(kù)中相似度較高的16S rRNA基因序列，通過MEGA 6.0軟件分析產(chǎn)酶菌株遺傳關(guān)系并生成系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖。

表1 產(chǎn)酶菌株的形態(tài)特征

圖1 6株菌株在脫脂乳鑒別培養(yǎng)基上的產(chǎn)酶水解圈Fig.1 Transparent circle of 6 cold protease-producing strains on skim milk plate

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫蛋白酶菌株的篩選

以脫脂乳鑒別培養(yǎng)基為模型，從布倫口湖群不同濕地類型樣品中共分離到24 株疑似產(chǎn)蛋白酶的可培養(yǎng)菌株。將水解圈直徑D/菌落直徑d較大的純培養(yǎng)物劃線純化，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，F(xiàn)olin-酚顯色法測(cè)定粗酶液酶活力，最終獲得6株分泌低溫蛋白酶性能良好的細(xì)菌菌株。

圖1為產(chǎn)低溫蛋白酶功能菌株在脫脂乳鑒別培養(yǎng)基上產(chǎn)生的相應(yīng)水解圈。革蘭氏染色結(jié)果表明，6株產(chǎn)酶菌株中4株為陰性，其余2株為陽性，具體表型特征見表1。

圖2 產(chǎn)低溫蛋白酶菌株生長(zhǎng)溫度的測(cè)定Fig.2 Determination of growth temperature of cold-protease producing strains

2.2 產(chǎn)酶菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶特性

2.2.1 產(chǎn)酶菌株的最適生長(zhǎng)溫度及耐鹽性測(cè)定 由圖2可知，產(chǎn)酶菌株的最佳生長(zhǎng)溫度在18～25 ℃左右，生長(zhǎng)溫度介于4～37 ℃，屬耐冷菌。耐鹽性研究中，6株產(chǎn)酶菌株耐鹽性一般，最高不超過6 %。菌株5-1在6 % 高鹽度下雖可以生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)極為緩慢。1-3耐鹽性最差，鹽濃度高于4 %即停止生長(zhǎng)。

2.2.2 產(chǎn)酶菌株生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶特性 將產(chǎn)酶菌株接入液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，每間隔12 h取樣測(cè)定其光密度和發(fā)酵上清液粗酶活力。由圖3可知，6株低溫菌均有明顯的延滯期，培養(yǎng)24～36 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期。1-4、4-1、5-1生長(zhǎng)速度較快，發(fā)酵48 h后即到達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定期，其余3株菌則在培養(yǎng)60 h后進(jìn)入平穩(wěn)期。

圖4表明，菌株的產(chǎn)酶速度各異，3-1和5-1初始產(chǎn)酶速度較快，但1-3、5-1在發(fā)酵60 h后即先到達(dá)酶活最高點(diǎn)，其它菌株則在72 h后達(dá)到酶活高峰。之后隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，所有菌株酶活力開始減低。綜合圖3～4可知，6株菌的產(chǎn)酶能力與生長(zhǎng)具有一定偶聯(lián)性，隨菌體密度增大，產(chǎn)酶活力也在明顯上升，至平穩(wěn)期達(dá)到酶活高峰，說明其在生長(zhǎng)平穩(wěn)期酶催化能力最強(qiáng)，酶活力最高。

圖3 低溫蛋白酶菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of cold-protease producing strains

圖4 低溫蛋白酶菌株的產(chǎn)酶特性Fig.4 Enzymatic activity of cold-lipase producing strains

2.3 產(chǎn)蛋白酶菌株的16S rRNA 基因序列與系統(tǒng)發(fā)育分析

以6株產(chǎn)低溫蛋白酶菌株的基因組為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，獲得16S rDNA片段約1500 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，交由上海生工完成測(cè)序工作。測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)，用BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索比對(duì)，并構(gòu)建低溫蛋白酶產(chǎn)生菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖5可知，1-3、1-6、3-1、9-2屬于假單胞菌(Pseudomonassp.)，4-1屬于節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)，5-1屬于芽孢桿菌(Bacillussp.) 。

3 討 論

低溫蛋白酶在食品加工保鮮、洗滌紡織、植物保護(hù)、生物環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用發(fā)展?jié)摿?。雖然生物圈超過80 %部分為永久性低溫地區(qū)，為極端微生物資源的發(fā)掘提供了豐富源泉，但目前極端酶生物工程技術(shù)的開發(fā)并不成熟，低溫蛋白酶資源開發(fā)廣度及低溫酶結(jié)構(gòu)特征、作用機(jī)制、基因工程改造等尚需進(jìn)一步探索研究。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)布倫口湖泊濕地可培養(yǎng)產(chǎn)酶細(xì)菌的分離和篩選，了解高原湖泊濕地產(chǎn)低溫蛋白酶細(xì)菌的生長(zhǎng)特征、產(chǎn)酶性能及遺傳多樣性。研究分離到的6株產(chǎn)酶功能菌株的最適生長(zhǎng)溫度不超過25 ℃，符合低溫微生物的生理特性，屬于耐冷菌范疇。菌株的生長(zhǎng)范圍介于4～37 ℃，在常溫和低溫下均能正常生存生長(zhǎng)，推測(cè)可能是常溫菌長(zhǎng)期適應(yīng)低溫條件自然選擇的結(jié)果。目前國(guó)內(nèi)針對(duì)分泌低溫蛋白酶菌株的分子鑒定、系統(tǒng)發(fā)育及酶學(xué)性質(zhì)基礎(chǔ)研究尚不多，分離到的產(chǎn)酶菌株多隸屬于以下菌屬：Pseudomonas、Pseudoalteromona、Shewanella、Colwellia、Sphingobacterium、Flavobacterium及Arthrobacter屬等。本研究從布倫口湖群濕地分離的6株產(chǎn)低溫蛋白耐冷菌，能在15 ℃條件下發(fā)酵分泌低溫蛋白酶，耐鹽性一般。結(jié)合形態(tài)學(xué)及16S rDNA序列同源性分析，鑒定其中四株菌屬于假單胞菌(Pseudomonassp.)，與倪永清[14]、易浪波[15]、高云航[16]等結(jié)果一致。而假單胞菌是低溫生境中的優(yōu)勢(shì)菌群，廣泛存在于極地、冰川雪山、常年凍土、深海等常年酷寒環(huán)境中[17-20]，是目前微生物中較豐富的酶庫(kù)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解能力。另外兩株菌分屬于節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)和芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，在四川若爾蓋高原[21]、西藏尼瑪縣甲熱布錯(cuò)湖[22]、渤海和黃海[23]地區(qū)同樣分離到。

本研究自東帕米爾高原湖泊群濕地中分離到的6株產(chǎn)酶菌株，其16S rDNA序列與已知分類地位的同屬模式菌株相似度在98 %以上，因此最多只能區(qū)分到屬(genus)，不能到種[24]。此外，盡管分離到的4株假單胞菌株的16S rRNA 基因序列同源性在98 %～99 %左右，但菌落形態(tài)、大小等表型特征及生長(zhǎng)、產(chǎn)酶性能存在差異，說明目前主要依據(jù)的可培養(yǎng)菌株16S rRNA基因序列差異并不能準(zhǔn)確反映產(chǎn)低溫酶功能微生物的遺傳多樣性。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)或可嘗試采用重復(fù)序列rep-PCR指紋分析技術(shù)，結(jié)合菌株的生理學(xué)代謝譜、產(chǎn)酶性狀譜等將同源性較高的Pseudomonas菌株劃分到不同的亞群，進(jìn)而對(duì)應(yīng)于同屬不同的種或者種組[25-26]，以更加全面地揭示極端環(huán)境中產(chǎn)酶菌株遺傳多樣性與種群進(jìn)化關(guān)系，挖掘出優(yōu)質(zhì)高效、具有新特性的高產(chǎn)低溫蛋白酶新菌種，為低溫酶制劑的研究應(yīng)用奠定更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

圖5 基于16S rDNA序列產(chǎn)酶菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of cold-adapted bacteria producing protease based on 16S rDNA sequence

4 結(jié) 論

從新疆東帕米爾高原布倫口湖群濕地共篩選到6株高產(chǎn)低溫蛋白酶菌株，其在15 ℃條件下均能生長(zhǎng)繁殖，但耐鹽能力一般，在生長(zhǎng)穩(wěn)定期達(dá)到產(chǎn)酶高峰。16S rRNA 基因序列初步確定4株為假單胞菌 (Pseudomonassp.) ，另2株分屬于芽孢桿菌(Bacillussp. ) 和節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)。

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(責(zé)任編輯 陳 虹 )

Isolation and Identification of Cold-adapted Bacteria Producing Protease from Bulunkou-lake Group Wetlands

WANG Ji-lian, LI Ming-yuan, REN Yu

(College of Biology and Geographic Sciences, Kashgar University, Key Laboratory of Ecology and Biological Resources in Yarkand Oasis of Education of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Xinjiang Kashgar 844006, China)

【Objective】The bacterial strains producing cold-adapted protease from the Bulunkou-lake group wetlands, East Pamirs were isolated and identified, which would provided a useful basis for further study of cold-adapted protease．【Method】The bacterial strains by the screening media containing skim milk were isolated. The phenotypic characteristics, the optimum growth temperature, salt resistance, growth characteristic and enzyme properties of the strains were studied, and their taxonomic identity and genetic variability by the 16S rRNA gene sequences were determined. 【Result】6 high-yield protease-producing strains growing at 15 ℃ were obtained and belonged to psychrotrophs. The 6 strains had low salt-resistance but could be fermented under relative low temperature, which could reach the peak production of enzyme in the stable phase. Primary identification showed that 4 strains belonged to the genusPseudomonas, the other two belonged to the genusBacillusandArthrobacter. 【Conclusion】Although many closely related populations were isolated, they had different physiological characteristics, which would expand the existing resource database of cold-adapted strains producing protease and provide a basis for the further study of structure characteristics of cold-active protease and application in the field of biological engineering.

Bulunkou-lake group wetlands; Cold-adapted protease; Psychrotrophs; 16S rRNA

1001-4829(2017)6-1330-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.016

2016-07-12

新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏?jì)劃項(xiàng)目(XJEDU2016 S072)；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2016D01B011)

王繼蓮(1986-)，女，山東鄆城人，講師，研究方向：低溫微生物學(xué)，E-mail:wjilian0710@sina.com。

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