蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子鑒定及orf138/orfB基因序列差異性分析

李曉梅，柴 靚，楊 峰，冉茂林,3 *

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所，四川 德陽(yáng) 618000；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，四川 成都 610066；3.蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066)

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蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子鑒定及orf138/orfB基因序列差異性分析

李曉梅1，柴 靚2，楊 峰1，冉茂林1,3 *

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所，四川 德陽(yáng) 618000；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，四川 成都 610066；3.蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066)

【目的】本研究旨在了解蘿卜雄性不育細(xì)胞質(zhì)的分子特征?！痉椒ā恳?份蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系、5份不育材料及6個(gè)蘿卜品種為試材，利用線粒體基因orf138及orfB為分子標(biāo)記，設(shè)計(jì)特異引物對(duì)材料進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析?！窘Y(jié)果】8份蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系、5份不育材料及5個(gè)蘿卜品種檢測(cè)到含有orf138特異片段，為Ogura胞質(zhì)類(lèi)型，不育系相應(yīng)保持系則未檢測(cè)到特異片段；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)所有Ogura胞質(zhì)材料可分為2種類(lèi)型，Type A和Type H；27份材料orfB特異擴(kuò)增后，其產(chǎn)物按編碼區(qū)核苷酸序列的差異可分為2個(gè)類(lèi)型，Ogura胞質(zhì)中序列一致，普通胞質(zhì)中序列一致。【結(jié)論】由此可見(jiàn)，orf138與orfB基因在Ogura胞質(zhì)與普遍胞質(zhì)間均差異明顯，可利用orf138的有無(wú)及orfB基因的核苷酸序列差異進(jìn)行胞質(zhì)類(lèi)型鑒定。

蘿卜(RaphanussativusL.)；雄性不育細(xì)胞質(zhì)；分子鑒定；orf138；orfB

【研究意義】蘿卜(RaphanussativusL.)是一種古老的蔬菜作物，我國(guó)現(xiàn)今年平均種植面積約120萬(wàn)hm2，為我國(guó)第三大蔬菜作物。蘿卜為典型的異花授粉植物，自交衰退嚴(yán)重，其雜種優(yōu)勢(shì)明顯。利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系做母本進(jìn)行雜交制種是當(dāng)前蘿卜雜種優(yōu)勢(shì)利用的有效途徑，具有雜種一代純度高、制種成本低、親本不易流失等優(yōu)點(diǎn)[1]。細(xì)胞質(zhì)雄性不育性(CMS)是由胞質(zhì)基和核基因共同作用的一種母性遺傳，已被證實(shí)與線粒體基因有關(guān)，線粒體基因組分子內(nèi)或分子間的重組或重排，可以形成嵌合基因或新的開(kāi)放閱讀框(ORF)而導(dǎo)致CMS[2-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自1968年日本學(xué)者小倉(cāng)發(fā)現(xiàn)第一個(gè)蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育類(lèi)型(Ogura CMS)以來(lái)，現(xiàn)今已有77-01A、Kos、NWB及DCGMS等不同胞質(zhì)類(lèi)型被發(fā)現(xiàn)[4-8]，但Ogura CMS因敗育徹底，育性易于恢復(fù)，到目前為止為研究最充分、應(yīng)用最廣泛的不育胞質(zhì)，現(xiàn)已通過(guò)雜交和體細(xì)胞融合等技術(shù)轉(zhuǎn)育到其他十字花科作物中[9-11]。研究證明，線粒體基因orf138是導(dǎo)致Ogura CMS的主控因子，引起敗育的原因可能是其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)線粒體活性有毒性從而抑制花藥絨氈層的形成[12-14]。orfB為atp8同系物，負(fù)責(zé)編碼ATPase，與線粒體能量代謝有關(guān)，存在于Ogura胞質(zhì)和普通胞質(zhì)中，其與細(xì)胞質(zhì)雄性不育的關(guān)系爭(zhēng)議較大。Ogura CMS正是orf138插入orfB的5′端形成，因此orf138-orfB為Ogura CMS線粒體基因組中的重要結(jié)構(gòu)[15-17]。諸多研究者利用orf138和orfB為分子標(biāo)記進(jìn)行蘿卜胞質(zhì)鑒定與分類(lèi)，依orf138核苷酸堿基位點(diǎn)的差異，Ogura CMS被分為9個(gè)類(lèi)型(Type A→I)，依編碼區(qū)及側(cè)翼堿基的差異，orfB被分為3個(gè)類(lèi)型(Type 1→3)，其中Type1為Ogura CMS特有，這些發(fā)現(xiàn)證明了Ogura CMS具有豐富的多態(tài)性，有助于進(jìn)行胞質(zhì)類(lèi)型鑒定及不同材料進(jìn)化關(guān)系的研究[18-21]。鑒定蘿卜胞質(zhì)不育類(lèi)型并對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)，是有效進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育的前提和基礎(chǔ)，不僅可以提高種質(zhì)材料的利用效率，還可以加快雜種一代選育進(jìn)程，同時(shí)還將有助于研究細(xì)胞質(zhì)基因與核基因互作機(jī)理[22-23]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本試驗(yàn)利用orf138和orfB為分子標(biāo)記對(duì)8份蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，8份蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育保持系，5份不育材料及6個(gè)蘿卜品種進(jìn)行胞質(zhì)鑒定，同時(shí)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以分析其差異性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】旨在為加快蘿卜CMS的轉(zhuǎn)育奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

植物材料：本試驗(yàn)所用材料共27份，包括8份蘿卜雄性不育系及其保持系、5份不育材料和6個(gè)蘿卜品種，每個(gè)材料取3個(gè)單株，重復(fù)2次。不育系“沈A”由沈陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，“藏蘿卜A”為甘孜州理塘縣藏蘿卜中發(fā)現(xiàn)的不育株，6個(gè)商業(yè)品種購(gòu)于市場(chǎng)，其他材料均為四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所蘿卜課題組的育種材料，各材料的性狀及來(lái)源見(jiàn)表1。

試劑盒、酶：通用型植物DNA提取試劑盒，PCR擴(kuò)增所用的TaqPlus、TaqPlus Buffer和Super pure dNTPs均購(gòu)自天根生化科技(北京)公司(TIANGEN)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物總DNA的提取 剪取蘿卜幼嫩葉片約2 g，按照TIANGEN公司通用型植物DNA提取試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明提取總DNA，將提取的DNA用TE稀釋至200 ng·μl-1，保存于-20 ℃，以備后續(xù)使用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 以蘿卜線粒體全基因組(Ogura-type GenBank:AB694744及Normal-type GenBank:AB694743)中包含orf138及orfB(atp8)特異片段的序列為模板[17]，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物(表2)，引物由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系為25 μl，含40 ng DNA，2.5 μl 10×TaqPlus Buffer(含Mg2+)，2 μl 2.5 mM Super pure dNTPs，0.5 μl 10 μM正向引物，0.5 μl 10 μM反向引物，0. 5 μl 2.5 U/μlTaqPlus，用ddH2O補(bǔ)齊25 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 次循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。 PCR產(chǎn)物于1.2 %瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，并切膠、回收、送交上海生工測(cè)序。序列分析在 NCBI上進(jìn)行(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，利用NCBI網(wǎng)站中的BLAST序列比較工具軟件進(jìn)行序列同源性分析(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST)，利用DNAMAN(Version 7.0)軟件進(jìn)行堿基及氨基酸序列多重比較分析。

表1 試驗(yàn)材料

表2 特異片段擴(kuò)增所用的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1orf138的擴(kuò)增和序列比對(duì)

利用特異引物orf138-F/R對(duì)8份蘿卜雄性不育系及其保持系、5份不育材料和6個(gè)蘿卜品種進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。如圖1所示，8份不育系、5份不育材料及5個(gè)蘿卜品種有特異性條帶，表明這些材料均為Ogura胞質(zhì)， 5個(gè)品種表現(xiàn)可育，推斷其為Ogura CMS與恢復(fù)系配制的雜交一代，8份保持系無(wú)特異條帶，說(shuō)明orf138正是引起這些不育系敗育的原因，韓國(guó)品種“世農(nóng)501”有微量花粉，但自交測(cè)交均不結(jié)實(shí)，說(shuō)明花粉無(wú)活性，符合NWB胞質(zhì)雄性不育特征，且未檢測(cè)到特異性片段，其可能為NWB胞質(zhì)類(lèi)型配制的雜種一代。

將PCR產(chǎn)物回收測(cè)序，對(duì)比這18個(gè)材料的orf138編碼區(qū)序列(417 bp)發(fā)現(xiàn)，所有材料可分為2種類(lèi)型，前一類(lèi)和后一類(lèi)核酸序列相比，有2個(gè)堿基差異，分別是61A→C，99A→G(圖2)。將這些序列在NCBI上做Blast分析發(fā)現(xiàn)：第一類(lèi)序列與Genbank已公布的蘿卜雄性不育細(xì)胞質(zhì)相關(guān)基因(GenBank: DQ010330.1)核酸序列完全一致，經(jīng)對(duì)比為T(mén)ype A 型 Ogura CMS；而第二類(lèi)序列與Genbank已公布的蘿卜雄性不育細(xì)胞質(zhì)相關(guān)基因(GenBank: AB055442.1)核酸序列完全一致，經(jīng)對(duì)比為T(mén)ype H型Ogura CMS(Yamagishi&Terachi，2001)，進(jìn)一步驗(yàn)證了Ogura CMS具有豐富的變異類(lèi)型。在DNAMAN軟件上進(jìn)行氨基酸多重序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)orf138序列上61位點(diǎn)堿基的差異改變了編碼區(qū)的氨基酸序列(賴氨酸→谷氨酰胺)，為有義突變，但顯然氨基酸的變化并沒(méi)有改變雄性不育的表型性狀，推測(cè)其屬于中性變異。

M：D2000，1～27：不同蘿卜材料序號(hào)M:D2000，1-27:Number of materials圖1 基于orf138基因的PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物 Fig.1 PCR products amplified from the orf138 locus of radish

圖2 Ogura 胞質(zhì)材料之間orf138序列差異性比較Fig.2 Nucleotide sequences analysis of orf138 locus of Ogura CMS

2.2orfB的擴(kuò)增和序列比對(duì)

以N-atp8-F/R及O-atp8-F/R為特異引物，PCR擴(kuò)增表明atp8存在于Ogura胞質(zhì)與普通胞質(zhì)中(圖3)，對(duì)PCR產(chǎn)物回收測(cè)序，并對(duì)其編碼區(qū)(476 bp)進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明：所有Ogura 胞質(zhì)的orfB編碼區(qū)堿基序列相同，普通胞質(zhì)的orfB編碼區(qū)堿基序列相同，且兩類(lèi)序列間存在兩個(gè)堿基位點(diǎn)的差異，即370C→ A，449C→T(圖4)，這與Terachi等的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了Ogura胞質(zhì)具有特異性的orfB序列。氨基酸多重序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩序列在堿基位點(diǎn)突變處均引起了編碼氨基酸的改變(370異亮氨酸→亮氨酸，449纈氨酸→丙氨酸)，這些氨基酸的變化是否引起基因功能的改變尚不知曉，有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論與討論

Ogura CMS是1968年小倉(cāng)在日本野生蘿卜群體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的首個(gè)蘿卜胞質(zhì)雄性不育材料，其不育源敗育徹底，是十字花科作物迄今發(fā)現(xiàn)的不育性最徹底的胞質(zhì)不育源之一，應(yīng)用價(jià)值巨大，隨后諸多學(xué)者對(duì)Ogura CMS進(jìn)行了廣泛研究。1991年，一個(gè)2.5 kb的片段Nco2.5被證實(shí)與Ogura CMS有關(guān)，隨后進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該片段包含orf138和orfB2個(gè)開(kāi)放閱讀框，在Ogura CMS中2個(gè)基因共轉(zhuǎn)錄一個(gè)1.4 kb的雙順?lè)醋觤RNA，其中orf138只在Ogura CMS中轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而orfB在不育與可育植株中均轉(zhuǎn)錄表達(dá)[12-13]。隨后研究者進(jìn)一步證實(shí)Ogura CMS正是orfB位點(diǎn)的5′插入特異orf138導(dǎo)致不育，orf138-orfB可能共同決定了Ogura 胞質(zhì)的不育性[15]，因此日本學(xué)者用107份日本野生蘿卜，29份來(lái)自中國(guó)和日本的品種及7份野芥為材料，研究了蘿卜在種間和種內(nèi)水平上orf138編碼區(qū)堿基的差異性，第一次在核苷酸水平證實(shí)了線粒體基因orf138的多態(tài)性。研究表明143份材料的orf138編碼區(qū)序列共存在6個(gè)堿基位點(diǎn)的變異和一個(gè)39個(gè)核苷酸的缺失，依此將Ogura CMS分為9個(gè)類(lèi)型(Type A→I)，中國(guó)蘿卜Ogura 胞質(zhì)的主要類(lèi)型為T(mén)ype H，并且這些變異均屬有義突變，引起了氨基酸序列的變化，但顯然并沒(méi)有引起蛋白質(zhì)功能的改變[18]，隨后中國(guó)學(xué)者也鑒定到2個(gè)Ogura CMS的變異類(lèi)型[22]。本研究用27個(gè)不同性狀蘿卜為試材，以orf138為特異分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示除了品種“雪單1號(hào)”(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所選育)，所有中國(guó)來(lái)源的材料均為T(mén)ype A Ogura 胞質(zhì)，韓國(guó)和日本品種均為T(mén)ype H Ogura 胞質(zhì)，然而Zhang等則只在中國(guó)蘿卜中鑒定到Type A[21]。

M：D2000，1～27：不同蘿卜材料序號(hào) M:D2000，1-27:The number of materials圖3 基于orf B基因的PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR products amplified from the orfB locus of radish

圖4 Ogura胞質(zhì)與Normal胞質(zhì)orfB序列差異性比較Fig.4 Nucleotide sequences analysis of orfB between Ogura-type and Normal-type

orf138-orfB成為Ogura 線粒體基因組的重要結(jié)構(gòu)，對(duì)其進(jìn)行鑒定與分類(lèi)具有重要的意義。

Terachi 等首次對(duì)46份蘿卜材料的orfB編碼區(qū)及側(cè)翼序列進(jìn)行測(cè)序分析，依序列堿基及酶切位點(diǎn)的差異將其分為3個(gè)類(lèi)型(Type 1、Type 2、Type 3)，其中Type 1只存在于Ogura胞質(zhì)中，Type2、Type3存在于普通胞質(zhì)中且其在編碼區(qū)的序列相同，與Type 1有2個(gè)堿基位點(diǎn)的差異，突變引起了編碼氨基酸序列的改變，Yamagishi(2004)、Zhang等(2012)的研究結(jié)果與之一致[19-21]。本文對(duì)27份材料的orfB的編碼區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，Type A與Type H Ogura胞質(zhì)的orfB編碼區(qū)堿基序列與Type 1一致，而所有普通胞質(zhì)的orfB編碼區(qū)堿基序列一致，與Terachi等的研究結(jié)果相同，進(jìn)一步證實(shí)了Ogura胞質(zhì)具有特異性的orfB序列，但其是否可作為分子標(biāo)記用于鑒定Ogura胞質(zhì)仍需進(jìn)一步的研究。

蘿卜不育胞質(zhì)的鑒定和分類(lèi)是利用不同遺傳背景雄性不育系的前提和基礎(chǔ)，對(duì)雄性不育系、保持系的選育具有非常重要的意義。本文鑒定到13份蘿卜不育材料及5個(gè)蘿卜品種均為Ogura胞質(zhì)，可再結(jié)合Ogura胞質(zhì)核恢復(fù)基因Rfo/rfo的酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)分子標(biāo)記快速篩選不育源的候選保持系，從而加快育種進(jìn)程[23]。同時(shí)也說(shuō)明了課題組選育材料胞質(zhì)類(lèi)型的單一性，應(yīng)加大不同胞質(zhì)類(lèi)型材料的引進(jìn)，避免長(zhǎng)期使用單一不育胞質(zhì)帶來(lái)的潛在危害。

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(責(zé)任編輯 陳 虹)

Molecular Identification of Cytoplasmic Male Sterility in Radish (RaphanussativusL.) and Sequence Analysis oforf138 andorfB

LI Xiao-mei1, CHAI Liang2, YANG Feng1, RAN Mao-lin1,3*

(1.Institute of Rice and Sorghum, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Deyang 618000,China; 2.Institute of Crop Research, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610066,China; 3.Sichuan Province Key Laboratory of Vegetable Germplasm and Varieties Innovation, Sichuan Chengdu 610066, China )

【Objective】The present study was conducted to understand the molecular characteristics of male-sterile cytoplasm in radish. 【Method】Theorf138 andorfBof mitochondrial loci were used as molecular markers, and a total of eight male-sterile lines, eight maintainer lines, five male-sterile populations and six cultivars by PCR amplification were analyzed.【Result】Theorf138 gene of the eight male-sterile lines, five male-sterile populations and five cultivars by specific amplification were Ogura CMS, but their maintainer lines did not. Sequence analysis oforf138 demonstrated that the Ogura CMS could be divided into two types, type A and type H. Based on the mutations of the coding region sequences oforfB, two types oforfBwere found in total of 27 tested materials, and the sequences from Ogura and normal cytoplasm were absolutely distinguished. 【Conclusion】Thus, the genes oforf138 andorfBbetween the Ogura cytoplasm and the general cytoplasm were significantly different, and the presence oforf138 and the nucleotide sequence differences oforfBwould be used in cytoplasm type identification.

Radish (RaphanussativusL.); Cytoplasmic male sterility; Molecular identification;orf138;orfB

1001-4829(2017)6-1262-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.004

2016-07-10

四川省科學(xué)技術(shù)廳“四川省科技創(chuàng)新苗子工程”(2016092)

李曉梅(1984-)，女，四川廣安人，農(nóng)學(xué)碩士，研究方向?yàn)樘}卜育種及分子生物技術(shù)，E-mail: lxmwsl@126.com，*為通訊作者：冉茂林，男，農(nóng)學(xué)碩士，研究方向?yàn)樘}卜育種，E-mail: ran633@sohu.com。

S631.1

A