花粉破壁率檢測方法研究進展

田洪星 殷少文

貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002

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花粉破壁率檢測方法研究進展

田洪星 殷少文*

貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002

花粉破壁率的高低常被認為是評價花粉破壁方法及破壁粉體質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，但目前尚沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的花粉破壁率檢測方法。因此，探討了花粉破壁率不同的檢測方法，分析了各種方法的優(yōu)缺點，并提出了存在的不足之處及發(fā)展趨勢，以期為花粉破壁率檢測方法深入研究奠定基礎(chǔ)。

花粉破壁率；檢測方法；研究進度

花粉是植物的雄性配子體，存在于雄性花粉囊內(nèi)，是雄性花蕊上粉狀顆粒性細胞與蜜蜂的特殊分泌物所組成的復(fù)雜混合物[1]。研究證明，花粉不僅是植物的生命源泉，而且有“微型營養(yǎng)寶庫”之稱(內(nèi)含25%～30%蛋白質(zhì)、20多種易被人體吸收的游離氨基酸，10多種維生素、微量元素、天然活性酶及黃酮類物質(zhì))，具有很高的營養(yǎng)價值和醫(yī)療保健作用[2-6]。

花粉外壁堅硬主要由是由孢粉素、纖維素、角質(zhì)和花粉素等致密物質(zhì)所構(gòu)成，化學(xué)性質(zhì)很穩(wěn)定，具有耐酸、耐堿的特性，造成花粉壁內(nèi)的有效物質(zhì)浸出受到很大程度的阻礙，使得其有效物質(zhì)不能被人體充分利用[7]。為了提高花粉的利用價值，人們對花粉外壁做了諸多的探索，其中“花粉破壁技術(shù)”就是其中主要的研究方向之一。研究表明[8-9]，通過對花粉進行破壁處理，可以提高花粉的利用率。目前花粉破壁方法主要有復(fù)合破壁法[8-9]、物理破壁法[10-11]、生化破壁法[12-13]等，但無論采用哪種破壁方法及工藝條件都應(yīng)有一個破壁率檢測方法，以檢驗花粉的破壁程度。鑒于目前尚沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的花粉破壁率檢測方法，本文探討了花粉破壁率不同的檢測方法，分析了各種方法的優(yōu)缺點，并提出了存在的不足之處及發(fā)展趨勢，擬為花粉破壁率檢測方法深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 顯微測定法

1.1 玻片直接計數(shù)法與改良組巴氏血球計數(shù)法 王華凱等[14]利用破壁前后的花粉能進行定量的對比而求出百分率的方式對比分析了玻片直接計數(shù)法與改良組巴氏血球計數(shù)器計數(shù)法。結(jié)果表明，玻片直接計數(shù)法簡便易行，但因蓋玻片有擠壓作用，花粉細胞分布不易均勻，按視野計數(shù)，具有重疊或遺漏等缺點，且重現(xiàn)性較差。玻片直接計數(shù)法的測定方法是利用微量注射器( 或血色素吸管 )分別吸取已配制成等濃度的水溶液破壁花粉漿和未破壁花粉漿稀釋液10μL于普通載玻片上，加20mm×20mm蓋玻片，置顯微鏡下，移動推進器，在蓋玻片的中心位置，從左到右，從上到下，用高倍鏡逐個視野計數(shù)。測算所得花粉破壁率(η)公式如下：

破壁率(%)×(對照品中花粉細胞數(shù)﹣檢品中留存的完整花粉細胞數(shù))/對照品中花粉細胞數(shù)×100%；

而改良組巴氏血球計數(shù)器計數(shù)法則比玻片直接讀數(shù)法更為合理，因計數(shù)室有0.1 mm 深度，花粉細胞不受擠壓，四大格分布均勻，重現(xiàn)性好。且在沒有微量注射器的情況之下，也可用點眼棒沽取1小滴樣品于計數(shù)室內(nèi)，但充填要適度。該操作方法是由一厚玻片制成，整個計數(shù)室劃分為九大格。每大格面積為1mm2，其深度為0.1mm。 四角之四大格，每格劃分為16個中方格，分別吸取已配制成等濃度水溶液的破壁花粉漿和未破壁花粉漿稀釋液10μL，沿蓋玻片邊緣充入計數(shù)室，待3～5min，在高倍鏡下計數(shù)，將四角之四大格細胞總數(shù)÷4 即得每大格花粉細胞數(shù)。以每mm3，容積細胞數(shù)相比較，測算所得花粉破壁率(η)公式如下：

破壁率(%)=100%﹣{100%×(A÷4×10)/(B÷4×10)}

試中：A 檢品的四大格總數(shù)；

B 對照品的四大格總數(shù)。

另外，通過改良組巴氏血球計數(shù)器計數(shù)法對50余批花粉破壁率測定檢查，與玻片直接計數(shù)法測定方法相比較，該方法更具有快速、簡便、重復(fù)性好，結(jié)果可靠等優(yōu)點，可作為今后檢測花粉破壁程度的評價指標(biāo)之一。

1.2 染色法涂片法 該方法主要是在玻片直接計數(shù)法的基礎(chǔ)上，利用花粉經(jīng)染色后原生質(zhì)體呈淡紅色、壁為紫紅色，形成兩者反差大，花粉易于計數(shù)的原理進行測定花粉的破壁率。薛妙男[15]通過用定量的堿性品紅染色液將破壁和未破壁的中國蜜源花粉分別染色1～1.5h，然后將染色后的花粉液稀釋5倍，攪勻后，用移液管取定量花粉液置載片上，涂抹展開于一定面積中，在40℃溫箱中烘干，用二甲苯透明2～3min，取出后用加拿大樹膠封片，然后進行觀察，統(tǒng)計。光鏡下，配以目鏡測微尺，采用5點取樣法計算各點0.5cm2范圍內(nèi)的破壁及未破壁花粉數(shù)，按下列公式計算花粉的破壁率：

花粉破壁率(%)=100%×(破壁前完整花粉數(shù)﹣破壁后完整花粉數(shù))/破壁前完整花粉數(shù)；

由上可知，此法較玻片直接計數(shù)法檢測法更為合理，顏色上的反差使得花粉易于計數(shù)，進一步提供了顯微觀察結(jié)果的可靠性，然而也存在著玻片直接計數(shù)法中花粉分布不均勻，重疊或遺漏的現(xiàn)象，因此，該方法值得進一步深入探討。

1.3 重量分析法配合顯微定量法 該法是在上述玻片直接計數(shù)法基礎(chǔ)之上，參考中藥顯微定量法，以完整花粉粒為參比物，用重量分析法配合顯微定量，測定花粉破壁率[16]。測算所得花粉破壁率(η)公式如下：

花粉破壁率(%)={1-(樣品花粉個數(shù)/對照花粉個數(shù))×(對照花粉重量/樣品花粉個數(shù))}×100%

樣品花粉個數(shù)為樣品花粉二次試樣9個視野觀察的總平均值；

對照花粉個數(shù)為對照花粉二次試樣9個視野觀察的總平均值；

對照花粉重量為配制混懸液時所稱對照花粉的實際重量(mg)；

樣品花粉重量為配制混懸液時所稱樣品的實際重量(mg)。

此法簡便易行，采用水合氯醛試液進行裝片，并在同1樣品2次混懸液觀察9個視野花粉粒的平均值，且相對偏差均小于5%。同時增加了重量法分析原理，使得測量結(jié)果準(zhǔn)確度提高，更加可靠，但是原料必須為單一花粉，不得混有其它花粉及雜質(zhì)，否則易影響測量結(jié)果。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定法 標(biāo)準(zhǔn)曲線法原理是利用不同濃度的點來探討自變量和因變量之間的關(guān)系的一種定量分析方法。李英等[17]利用此原理摸索了松花粉破壁率與未破壁花粉細胞數(shù)的關(guān)系，并采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化了影響測定的各種因素，得出了最佳試驗條件。所得的方法曲線線性關(guān)系良好、準(zhǔn)確度高、簡便易行。 實驗步驟首先是分別稱取未破壁松花粉對照品0g， 1.00g，5.00g， 10.00g、15.00g、 20.00g，用100%破壁松花粉稀釋至20.00 g混勻，制成破壁率分別為100%，95%，75%，50%，25%，0%的標(biāo)樣。分別稱取各標(biāo)樣0.50g，用水溶解并定容至25.00mL，制成20.00mg/mL的混懸液，然后再分別取經(jīng)振搖后的混懸液0.25mL于載玻片上，展開成面積約為5cm2的橢圓形薄片，在顯微鏡(目鏡×15、物鏡×10)下觀察，觀察5個視野，記錄每個視野內(nèi)未破壁花粉細胞數(shù)，每個標(biāo)樣平行操作3次，求出算術(shù)平均值。以破壁率為縱坐標(biāo)，以每個視野內(nèi)檢出未破壁花粉細胞數(shù)的算術(shù)平均值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品中檢出未破壁花粉細胞數(shù)，按照下公式，計算花粉破壁率：

Y= a+ bX

式中：Y松花粉的破壁率(%)；

X未破壁松花粉算術(shù)平均值(個)；

a, b常數(shù)。

此法，適用于測定松花粉的破壁率，同時，也適應(yīng)于多種花粉破壁率的測定，且該法具有精密度、準(zhǔn)確度高，簡便易行，線性范圍廣等特點。

2 激光粒度分析法

近年來，隨著中藥破壁率的研究發(fā)展，越來越多的科研學(xué)者已不再局限于傳統(tǒng)的顯微測定法進行破壁率的研究，而是在不斷尋求新的破壁率測定方法。其中，激光粒度分析法就是比較具有前瞻性的分析方法，具有很大的發(fā)展優(yōu)勢，不僅可以克服顯微測定法的主觀影響因素大的特性，而且還可以進行中藥顯微特征不明顯的中藥材細胞破壁率的測定，另外，具有操作簡便易行，結(jié)果可靠，準(zhǔn)確度高等優(yōu)點[18]。其原理主要是利用米氏散射理論，散射光的能量分布與顆粒直徑的分布直接相關(guān)，通過接受和測量散射光的能量分布就可以得出顆粒的粒度分布特征[19-20]。根據(jù)所測藥材的特性，可選擇濕法測定和干法測定。濕法測量是要先將樣品與某液體混合配制成懸浮液，并借助于攪拌、超聲波等物理條件進行分散處理，使聚集顆粒分散為原始粒子， 并使原始粒子在分散液中保持良好的分散狀態(tài)；干法測定用于測定水溶性或無合適分散介質(zhì)的固態(tài)試樣，通過由空壓機提供的高速氣流對團聚的顆粒進行沖擊分散，然后通過密閉空氣池進行測量后被連接的真空吸塵器收集[21]。何煜等[22]首次探討了中藥細胞平均直徑、超微粉碎后的粒徑、細胞破壁率之間的關(guān)系，結(jié)果得出了理想的破碎模型計算法，破壁率公式(η)：

η1=[1-(1-1/n)3]×100%(n>1)；

η2=100%(n≤1)；

η=η1+η2；

其中，n為顆粒粒徑與細胞直徑之比。

在此基礎(chǔ)之上，楊瑛等[23]不僅建立了使用重量分析法配合顯微定量采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蒲黃的細胞破壁率，同時探討了破壁率與粒徑值得關(guān)系，結(jié)果表明，細胞破壁率與粒徑值具有明顯的負相關(guān)性，隨著細胞破壁率的增大，粒徑值減小。此外，孫會麗等[24]分別以中藥顯微定量法及激光粒度分析法測定破壁率為評價指標(biāo)，對蒲黃超高壓撞擊流破壁處理進行探討，優(yōu)選破壁最佳工藝；比較破壁前后蒲黃在顯微、粒度分布等方面的變化，兩種方法所測得破壁率結(jié)果基本一致。可知，激光粒度法用于代替?zhèn)鹘y(tǒng)中藥顯微定量法測定蒲黃破壁率具有一定的可行性，同時，對于其它花粉破壁率激光粒度分析法研究奠定堅實的基礎(chǔ)。且該方法簡便、快捷，具有客觀性的特性。

3 化學(xué)成分法

相關(guān)文獻研究表明，破壁率與化學(xué)成分存在一定關(guān)系[18,24-26]，在此基礎(chǔ)之上，劉英梅等[27]探討了不同破壁率與不同破壁率花粉中脯氨酸含量的關(guān)系，提出了一種測定黑松花粉破壁率的新方法。利用分光光度法測出不同破壁率的樣品中脯氨酸含量在 520nm 處的吸光度后，按照下式計算松花粉的破壁率:

Y(%)=(a+bX)×100%

式中:Y：花粉的破壁率(%)；

X：樣品脯氨酸含量在 520nm 處的吸光度；

a、b： 為常數(shù)。

結(jié)果表明，花粉破壁率與其對應(yīng)的脯氨酸吸光度關(guān)系方程為y=11.886x-0.0637，R2= 0.9897。由此可見其線性關(guān)系良好，只要測出一種花粉破壁后的脯氨酸吸光度，代入方程，就可以得到其花粉破壁率，簡便準(zhǔn)確，可避免顯微測量破壁率所帶來的繁瑣操作過程。但存在一定的缺陷，不同的黑松花粉其內(nèi)在可利用到脯氨酸含量有所不同，測到的破壁率就有所不同，因此，影響結(jié)果的可靠性。

4 各種檢測方法優(yōu)缺點總結(jié)

縱觀目前花粉破壁率檢測方法，雖然每一種破壁率檢測方法都有自身的優(yōu)勢，但仍存在一些不足之處見表1。

表1 各種檢測方法優(yōu)缺點總結(jié)

5 小結(jié)與展望

目前學(xué)術(shù)界普遍認為天然花粉若不經(jīng)破殼處理，其有效成分便不能充分釋放，因此，花粉破壁率的高低便成為評價花粉破壁方法及花粉破壁粉體質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。就目前文獻研究來看，花粉破壁率檢測方法主要有顯微測定法、激光粒度測定法以及化學(xué)成分測定法等方法，但是哪一種檢測方法才是比較合理的破壁率檢測方法，目前尚沒有統(tǒng)一的定論，通過表1各種檢測方法優(yōu)缺點總結(jié)，可見，每一種檢測方法均有一定的優(yōu)勢和缺陷，因此，何種檢測方法才是合理的，有待今后進一步深入研究，但就筆者而言，激光粒度分析法可能是今后探討花粉破壁率研究一大熱點，有望成為一種合理標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法[24]。

另外，在分析或者研究何種花粉破壁率檢測方法更為合理時，首先要明確該檢測方法本身是否具有科學(xué)性，同時其檢驗工藝是否存在一定的合理性，能否把產(chǎn)生誤差來源的因素降低到最小，使實驗結(jié)果更為可靠。比如，盧敬慈等[28]對靈芝孢子粉破壁率分析方法的測量不確定度評估及方法改良與優(yōu)化的思路，就給花粉破壁率分析方法不確定度的分析提供一個很好的例子。因此，在探討花粉破壁率檢測方法時，應(yīng)針對每種花粉的自身的特異性，對多種檢測方法作比較，相互驗證，從而制定出合理的破壁率檢驗標(biāo)準(zhǔn)方法。

基于上述各種論述，筆者提出了以下幾方面的建議，以期為今后制定合理的檢測標(biāo)準(zhǔn)提供參考：加強破壁率檢測方法自身不確定度研究，以降低誤差來源因素，提高實驗結(jié)果的可靠性；加強粒徑與花粉破壁率相關(guān)性研究以及影響因素的探討，以實現(xiàn)激光粒度分析法測定花粉破壁率，使檢測更為簡便，操作易行，克服傳統(tǒng)顯微的不足之處；加強成分分析測定花粉破壁率研究，破壁率的高低某種程度上與花粉中化學(xué)成分成正比關(guān)系，但它們的相關(guān)性研究還缺乏深入研究；在測量某種花粉破壁率時，應(yīng)進行多種檢測方法的系統(tǒng)研究或是多種方法聯(lián)合分析，使實驗結(jié)果更合理與可靠。

[1]Chichiricog，Pacinie.Cupressus arizonica pollen wall zonation and in vitro hydration[J].Plant Systematics and Evolution,2008，270(3):231-242.

[2]石憬林.花粉壁里的有效成份[J].養(yǎng)蜂科技，1992，(3)：18-19.

[3]阿依努爾·熱西提.油菜蜂花粉破壁及產(chǎn)品研究[D].新疆：新疆大學(xué)，2015.

[4]帥利寬.蜂花粉能治療腦中風(fēng)后遺癥[J].蜜蜂雜志，2012(1)：44-4.

[5]劉俊紅.松花粉治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍188例臨床研究.河北中醫(yī)，2013，35(6)：901-903.

[6]李璐，張紅，吳云，等.油菜花粉活性部拉對尿生殖糞誘導(dǎo)的鼠前列腺增生的治療作用[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2016，18(2)：291-294.

[7]王娟, 余少文.花粉的營養(yǎng)成分、結(jié)構(gòu)及破壁方法[J].2007，28(8)：150-152.

[8]楊芙蓮，黨云剛.溫差-超聲波復(fù)合破壁法對花粉破壁率和黃酮得率的影響[J].陜西科技大學(xué)學(xué)報，2010，28(1)：58-61.

[9]馬福敏，劉玉玲.復(fù)合破壁方法對蜂花粉破壁率及其主要功能性成分的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2016,42(5)：184-186.

[10]倪輝，蔡慧農(nóng)，吳黎明，等.利用蒸汽爆破法破壁花粉的技術(shù)[J].農(nóng)業(yè)工報,2010,26(5)： 367-371.

[11]李麗，劉曄瑋，趙劍喜，等.高速剪切技術(shù)破碎油菜蜂花粉細胞壁工藝[J].食品科學(xué)，2012,33(12): 97-101

[12]楊文超，陳湖南，繆曉青.蓮花蜂花粉酶解破壁工藝條件優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2012，33(16): 12-17.

[13]曹紅剛，張政，木華芬，等.油菜蜂花粉的4種真菌發(fā)酵破壁酶活變化及營養(yǎng)分析[J].中國食品學(xué)報，2016，16(1)：259-262.

[14]王華凱，何竹慶，高忠儒.花粉破壁率計算方法的探討[J].中成藥研究，1986，(6)：3-4.

[15]薛妙男.花粉破壁率測定技術(shù)[J].廣西師范大學(xué)學(xué)報，1988，6(1):55-59.

[16]張全龍.花粉破壁率測定方法介紹[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，1999，7(1)：44.

[17]李英，劉秋萍，黃永剛，等.標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定松花粉破壁率的研究[J].林業(yè)科技，2004，29(6)：47-48.

[18] 蔡光先, 趙迪加, 張水寒,等.中藥微粉粒度的評價初探[J].中成藥, 2007,29(5):719-722.

[19] 舒霞, 吳玉程, 程繼貴,等.Mastersizer 2000激光粒度分析儀及其應(yīng)用[J].合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)版, 2007, 30(2):164-167.

[20]Shu X, Wu Y, Tao Q, et al.An analysis on report of Mastersizer 2000 laser particle size analyzer[J].Experimental Technology & Management, 2011.

[21]殷園園, 王秀莉, 宋丹丹,等.中藥微粉粒度的分析研究[J].河南科學(xué), 2014(10):1992-1995.

[22]何煜，莊香久.細胞級微粉碎與細胞級微粉中藥技術(shù)[C].2001中國藥學(xué)會學(xué)術(shù)年會大會報告集，2001：914-918.

[23]楊瑛，楊永華，凌翔，等.蒲黃的細胞破壁率測定及其與粒徑值的相關(guān)性研究[J].中成藥，2008，30(11)：1646-1648.

[24]孫會麗，謝明，王盛民，等.蒲黃的超高壓撞擊流破壁技術(shù)的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2014，25(7)：1793-1796.

[25]艷玲，劉永錄，趙建平，等.不同粒徑淫羊藿中化學(xué)成分溶出度比較研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40(1)：220-222.

[26]李偉，李茜，張海英.不同粒徑參藶散超微粉和細粉溶出度比較[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2016,22(6)：58-59.

[27]劉英梅，韓曉弟，王文龍，等.利用分光光度法測定花粉破別率[J].食品工業(yè)科技，2011，7(32)：400-401.

[28]陳勇軍, 梁學(xué)良, 錢錦花,等.激光法檢測中藥破壁飲片粒度的影響因素探討[J].今日藥學(xué), 2014(2):102-105.

[29]盧敬慈，梁啟文，莫惠鳳.靈芝孢子粉破壁率分析方法的測量不確定度評估及方法改良與優(yōu)化[J].藥物分析雜志，2014，34(3)：554-559.

田洪星(1990-)，男，土家族，碩士研究生在讀，研究方向為中藥、民族藥新制劑及新劑型。E-mail:846563439@qq.com

殷少文(1989-)，男，漢族，碩士，研究方向為民族藥質(zhì)量控制及新藥研發(fā)。E-mail:2488247271@qq.com

R914

A

1007-8517(2017)13-0052-04

2017-04-24 編輯：梁志慶)