MTB線粒體翻譯控制28蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)和純化

卓文基 劉志輝 周琳 陳燕梅 陳濤 孫琦 郭卉欣

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·技術(shù)交流·

MTB線粒體翻譯控制28蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)和純化

卓文基 劉志輝 周琳 陳燕梅 陳濤 孫琦 郭卉欣

對(duì)MTB線粒體翻譯控制(mitochondrial translation control，MTC) 蛋白MTC28基因進(jìn)行克隆， 構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒并在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)MTC28蛋白。采用PCR技術(shù)從MTB H37Rv 標(biāo)準(zhǔn)株基因組中擴(kuò)增MTC28基因片斷，MTC28基因片斷和質(zhì)粒pFastbac1經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切，T4 DNH連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastbac1-MTC28，轉(zhuǎn)染DH5α感受態(tài)細(xì)菌，在含有氨芐青霉素溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)固體培養(yǎng)基中篩選陽性克隆，挑選生長的菌落進(jìn)而在含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)菌克隆。PCR鑒定目的基因插入質(zhì)粒后，陽性克隆細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒(pFastbac1-MTC28)的提取。pFastbac1-MTC28質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DH10 Bac感受態(tài)細(xì)菌構(gòu)建重組桿狀質(zhì)粒(Bacmid-MTC28)，用含有慶大霉素、卡那霉素和四環(huán)素的液體LB培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌克隆，采取藍(lán)白斑技術(shù)篩選陽性菌落。PCR鑒定為陽性的細(xì)菌進(jìn)行桿狀重組質(zhì)粒(Bacmid-MTC28)的提取。利用脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，將桿狀重組質(zhì)粒(Bacmid-MTC28)轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞中，包裝重組桿狀病毒，并表達(dá)蛋白質(zhì)。結(jié)果成功構(gòu)建了MTC28真核表達(dá)質(zhì)粒，建立了桿狀病毒表達(dá)MTC28蛋白的表達(dá)體系，并表達(dá)MTC28蛋白，通過純化獲得了高純度且均一化的MTC28蛋白。

分枝桿菌, 結(jié)核； 線粒體蛋白質(zhì)類； 基因, 線粒體； 轉(zhuǎn)染； 質(zhì)粒； 基因, 昆蟲

當(dāng)前全球面臨的結(jié)核病疫情十分嚴(yán)峻，但現(xiàn)有結(jié)核病疫苗—卡介苗(BCG)免疫保護(hù)效果極不穩(wěn)定，線粒體翻譯控制(mitochondrial translation control，MTC：就是線粒體翻譯控制)28 蛋白存在于MTB、牛分枝桿菌及少數(shù)的卡介菌中，該蛋白可被大多數(shù)結(jié)核病患者和感染者的血清所識(shí)別， 因此 MTC28是一種理想的疫苗候選抗原。本研究為了獲得MTC28蛋白，克隆了MTC28基因，并成功首次構(gòu)建到桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒穿梭載體桿粒(Bacmid)中并獲得Bacmid-MTC28重組桿狀病毒質(zhì)粒。之后利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系，表達(dá)了MTC28蛋白，并進(jìn)一步利用親和層析(鎳柱)和分子篩層析(Superdex 200 PG)純化得到高純度、均質(zhì)化的MTC28蛋白。

材料和方法

一、材料

pFastbac1載體購自美國Invitrogen公司、大腸桿菌(Escherichiacoli)菌種DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存，菌種DH10 Bac購自美國Invitrogen公司。昆蟲細(xì)胞系sf9、High Five購自美國Invitrogen公司；結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株(由本實(shí)驗(yàn)室保存)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(購自德國TIANGEN公司)；限制性內(nèi)切酶EcoRI、XhoI、T4 DNA連接酶、DNA marker(購自大連TaKaRa寶生物公司)；pfu DNA聚合酶(購自美國Promega公司)。親和層析(鎳柱)和分子篩(Superdex 200 PG)購自美國General Electric(GE)公司；AKTA Purifier儀器借用平臺(tái)中心儀器。

二、 方法

(一)引物設(shè)計(jì)

參照美國基因數(shù)據(jù)庫(Gen Bank)公布的序列(登錄號(hào)：U7527.1)，擴(kuò)增目的基因MTC28編碼區(qū)長度為933 bp。上游引物MTC28-F：5′-CCGGAATTCATGATCCAGATCG-CGCGCAC-3′；下游引物1 MTC28-R1：5′-GCGCGGCGGGACTGGT-3′；下游引物2 MTC28-R2：5′-CCCTCGAGCTACATCATCACCATCACCAT(6×His-tag)GCGCGGCGGGACTGGT-3′。其中，CCG：上游引物保護(hù)性堿基；GAATTC：EcoRI內(nèi)切酶位點(diǎn)；CG：下上物保護(hù)性堿基；CTCGAG：XhoI內(nèi)切酶位點(diǎn)。

此外，合成M13引物進(jìn)行桿狀病毒重組質(zhì)粒Bacmid-MTC28鑒定，上游引物M13-F：CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG；下游引物M13-R：AGCGGATAACAATTT-CACACAGG。上述所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司負(fù)責(zé)合成。

(二)目的基因的擴(kuò)增

按曲拉通法(略有改進(jìn):根據(jù)MTB臨床標(biāo)本的特點(diǎn)，筆者對(duì)TE-Triton法中原有的裂解液進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)后的配方為：三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) (pH 8.0)10 mmol, 乙二胺四乙酸(EDTA) 1 mmol, 聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100) 1%,chelex-100(一種聚苯乙烯基體離子交換樹脂) 1%,乙基苯基聚乙二醇(NP-40) 10%。提取結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的DNA，以此為模板擴(kuò)增MTC28全長基因。PCR反應(yīng)體系：超純水24.25 μl，50%甘油5 μl，二甲基亞砜(DMSO) 2.5 μl，三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNTPs) 4 μl，pfu緩沖液(pfu buffer)5 μl，上游引物MTC28-F 2 μl，下游引物MTC28-R1 2 μl，模板DNA 5 μl，pfu DNA聚合酶0.25 μl，總體積50 μl。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min，進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性55 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后采用TIANGEN試劑盒純化回收。

上述回收的片段用MTC28-F和MTC28-R2繼續(xù)進(jìn)一步PCR，以便連入6×His-tag標(biāo)簽，目的是便于后期表達(dá)的MTC28蛋白的純化。

(三)真核表達(dá)載體的構(gòu)建

堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI和XhoI雙酶切真核表達(dá)載體pFastbac1(pFastbac1經(jīng)過改造加入GP67分泌信號(hào)肽)和目的基因MTC28。上述雙酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳分離后的目的條帶用TIANGEN試劑盒進(jìn)行純化回收，回收后的目的條帶用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

(四)真核表達(dá)載體的鑒定

經(jīng)氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選，挑取陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定。當(dāng)菌液渾濁時(shí)，取1 μl菌液進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)條件和反應(yīng)程序同前。陽性菌液轉(zhuǎn)接至4 ml玻璃管中進(jìn)行搖菌，提取重組質(zhì)粒pFastbac1-MTC28。

(五)昆蟲表達(dá)載體的構(gòu)建

將上述重組質(zhì)粒pFastbac1-MTC28轉(zhuǎn)化至DH10 Bac感受態(tài)細(xì)菌中，利用藍(lán)白斑篩選技術(shù)進(jìn)一步篩選陽性桿狀重組穿梭載體桿粒(Bacmid-MTC28)。轉(zhuǎn)染后的感受態(tài)細(xì)菌放置溫箱中培養(yǎng)，待白斑明顯后挑取白斑轉(zhuǎn)接到4 ml含有卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素的溶菌肉湯(LB)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)菌克隆。

(六)昆蟲表達(dá)載體的鑒定和提取

用M13引物對(duì)上述菌液進(jìn)行PCR測(cè)定，鑒定重組質(zhì)粒Bacmid-MTC28。陽性條帶大小為3300 bp，其中300 bp處為陰性條帶。陽性菌液利用異丙醇沉淀法提取重組質(zhì)粒Bacmid-MTC28。

(七)桿狀病毒的制備

上述重組質(zhì)粒Bacmid-MTC28轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長期的草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda，Sf9)細(xì)胞，包裝重組桿狀病毒。在超凈臺(tái)中，膠原凝集素Ⅱ(CellfectinⅡ) 6～8 μl + unsupplemented Grace’s Medium 200 μl，輕輕混勻，然后加入重組質(zhì)粒Bacmid-MTC28 2 μg后輕輕混勻，靜置孵育30 min。然后加至用sf9細(xì)胞貼壁鋪盤的六孔板中，并補(bǔ)加800 μl unsupplemented Grace’s Medium至6孔板。放入27 ℃培養(yǎng)箱中靜置孵育4～6 h。棄去6孔板中的培養(yǎng)混合液，每孔加2 ml Sf-900 Ⅲ 無血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM)(Thermo Fisher Scientific公司)(含50 U/ml 青霉素、50 μg/ml 鏈霉素和0.125 μg/ml Fungizone?Antimycotic)。27 ℃)培養(yǎng)箱中孵育，隨時(shí)注意觀察轉(zhuǎn)染現(xiàn)象。72 h后收取病毒上清至無菌的EP管，4 ℃避光保存，這就是P1病毒。P1病毒拉梯度轉(zhuǎn)染擴(kuò)增P2病毒，3 d后收取P2病毒并擴(kuò)增P3病毒。病毒成功包裝擴(kuò)增的現(xiàn)象為宿主細(xì)胞sf9變大、變圓，且細(xì)胞呈現(xiàn)顆粒化狀態(tài)。

(八) MTC28蛋白的表達(dá)

P3病毒轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長期的High Five昆蟲細(xì)胞，P3病毒按照1∶3的比例轉(zhuǎn)染High Five昆蟲細(xì)胞進(jìn)行MTC28蛋白的表達(dá)。

(九)MTC28蛋白的純化

3天后收取High Five昆蟲細(xì)胞表達(dá)的上清，上清液經(jīng)過0.22 μm孔徑抽濾后結(jié)合到鎳柱上，然后用梯度咪唑洗脫目的蛋白。經(jīng)過試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用10 mmol Tris-Hcl，200 mmol NaCl，350 mmol Imidazole可以洗脫下來MTC28蛋白。

洗脫下來的蛋白繼續(xù)用Superdex 200 PG分析篩進(jìn)一步純化，最終得到高純度且均質(zhì)化的MTC28蛋白。

結(jié) 果

一、目的基因的擴(kuò)增

擴(kuò)增的MTC28的全長結(jié)構(gòu)基因?yàn)?33 bp，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示，在預(yù)期部位出現(xiàn)目的條帶。連入6×His-tag標(biāo)簽后條帶大小有所增加，但不明顯(圖 1)。

M：DNA分子標(biāo)準(zhǔn)marker；1：MTC28-6×His-tag PCR條帶；2：MTC28 PCR條帶圖1 PCR擴(kuò)增MTC28基因電泳結(jié)果

二、桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pFastbac1-MTC28轉(zhuǎn)染DH10 Bac感受態(tài)細(xì)菌后，利用同源重組構(gòu)建重組質(zhì)粒Bacmid-MTC28。M13引物鑒定后發(fā)現(xiàn)重組基因大小為3300 bp左右(圖 2)。

M：DNA分子標(biāo)準(zhǔn)marker；1：陰性重組質(zhì)粒Bacmid-MTC28 PCR條帶；2：陽性重組質(zhì)粒Bacmid-MTC28 PCR條帶圖2 PCR鑒定重組質(zhì)粒Bacmid-MTC28基因電泳結(jié)果

三、MTC28蛋白的純化

重組質(zhì)粒Bacmid-MTC28轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長期的sf9昆蟲細(xì)胞后，包裝并擴(kuò)增P3病毒，之后利用P3病毒轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長期的High Five昆蟲細(xì)胞進(jìn)行MTC28蛋白的表達(dá)。表達(dá)后的蛋白上清液，先后經(jīng)過親和層析(鎳柱)和分子篩純化，最終獲得高純度均質(zhì)化的MTC28蛋白。親和層析發(fā)現(xiàn)，用10 mmol Tris-Hcl，200 mmol NaCl，350 mmol Imidazole可以洗脫下來MTC28蛋白，為進(jìn)一步獲得高純度和均質(zhì)化的MTC28蛋白，繼續(xù)用分子篩Superdex 200 PG進(jìn)一步純化，結(jié)果顯示MTC28在100 ml左右出峰，MTC28蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為28 000(28 kDa)(圖 3)。

左側(cè)第一泳道為標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker；右側(cè)4個(gè)泳道為MTC28蛋白純化后的樣品泳道圖3 MTC28分子篩純化，以及SDS-PAGE(二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)鑒定

討 論

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)顯示，全球有近1/3人口感染結(jié)核分枝桿菌，每1秒鐘都會(huì)新增1例患者，尤其是多重耐藥菌株的出現(xiàn)及與艾滋病共同感染的發(fā)生，更加重了結(jié)核病對(duì)人類健康的危害[1-2]?？焖?、有效和靈敏的診斷是控制結(jié)核病的關(guān)鍵之一。目前，常用的診斷試劑結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)是一種未被明確成分的結(jié)核分枝桿菌抗原混合物，其普遍存在于結(jié)核分枝桿菌及環(huán)境中的非結(jié)核分枝桿菌等菌株中，檢測(cè)時(shí)常將卡介苗接種者及活動(dòng)性肺結(jié)核治愈者誤檢為陽性，而且不能將活動(dòng)性肺結(jié)核與潛伏感染相區(qū)別，限制了PPD的臨床應(yīng)用[3]。MTC28是新近從結(jié)核分枝桿菌H37Rv株培養(yǎng)濾液中純化分離出的蛋白抗原，蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)全長為933個(gè)堿基，相對(duì)分子質(zhì)量約為28 000[4]，由310個(gè)氨基酸組成。存在于結(jié)核分枝桿菌、牛型結(jié)核分枝桿菌及少數(shù)的卡介菌中，且該蛋白可被大多數(shù)結(jié)核病患者和結(jié)核病感染者的血清所識(shí)別。因此，結(jié)核分枝桿菌中的MTC28蛋白是一種理想的疫苗候選抗原[5]，有望成為結(jié)核病血清學(xué)診斷的候選抗原之一[5]。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中的一種，具有安全性高，對(duì)外源基因克隆容量大，重組病毒易于篩選，具有完備的翻譯后加工修飾系統(tǒng)和高效表達(dá)外源基因的能力等特點(diǎn)[6]，它能對(duì)多種目的蛋白進(jìn)行修飾和加工，使其高效表達(dá)且具有一定的生物學(xué)活性，在近年得到較為廣泛的應(yīng)用。草地貪夜蛾卵巢組織來源的細(xì)胞(Sf9和Sf21)是應(yīng)用最廣泛的桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(baculovirus ex-pression vector system，BEVS)，可以用于表達(dá)多種體外重組的蛋白質(zhì)[7]。

本試驗(yàn)昆蟲表達(dá)載體Bacmid-MTC28的成功構(gòu)建及高純度均質(zhì)化MTC28蛋白的獲得，較之前原核表達(dá)體系和pcDNA3.1(+)-MTC28真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建有著本質(zhì)的區(qū)別。昆蟲細(xì)胞更類似于哺乳類細(xì)胞，能對(duì)蛋白質(zhì)完成翻譯后修飾(如磷酸化、脂肪酸?；?、糖基化等)，其表達(dá)的MTC28重組蛋白和天然蛋白更接近，具有更高的生物活性[8]。昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)極易生長，很快即可適應(yīng)無血清培養(yǎng)基，用于生物發(fā)酵罐的大規(guī)模培養(yǎng)。鑒于桿狀病毒的宿主細(xì)胞僅限于昆蟲，其生物安全性更好[9]。目前，重組桿狀病毒的構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白質(zhì)表達(dá)的方法已應(yīng)用多年，大部分試劑和儀器較易獲得，較為經(jīng)濟(jì)[10]。

本研究首次在昆蟲表達(dá)載體中表達(dá)并獲得了可溶性的MTC28蛋白，經(jīng)過親和層析和分子篩Superdex 200 PG純化，結(jié)果顯示MTC28蛋白在100 ml左右出峰，MTC28蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為28 000。實(shí)驗(yàn)的整體性比較完善，接下來的工作可以重點(diǎn)研究分析MTC28蛋白的結(jié)構(gòu)與其他靶標(biāo)分子的相互作用。利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系，經(jīng)過階段性純化獲得可溶性的高純度及均質(zhì)化的MTC28蛋白，為進(jìn)一步研究該蛋白的免疫保護(hù)效果和相應(yīng)的結(jié)核病疫苗及免疫學(xué)研究奠定了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(本文編輯：范永德)

Expression and purification of the MTC 28 protein in insect cells

ZHUOWen-ji*,LIUZhi-hui,ZHOULin,CHENYan-mei,CHENTao,SUNQi,GUOHui-xin.

*CenterforTuberculosisControlofGuangdongProvince,Guangzhou510630,China

ZHOULin,Email:gdtb@vip.163.com

To clone theMycobacteriumtuberculosis(MTB) mitochondrial translation control (MTC) gene, construct the Bacmid-MTC28 eukaryotic expression plasmid and express MTC28 protein in insect cells. MTC28 gene fragment was amplified from the genome of the MTB H37Rv standard strain by PCR. Then the PCR products and plasmid pFastbac1was digested with EcoRI and XhoI, linked with T4 ligase, the recombinant plasmid pFastbac1-MTC28 was constructed. The pFastbac1-MTC28 was transfected into DH5α competent cells, positive clone was screened by Ampicillin L-B medium and biological amplified by LB liquid medium.The plasmid (pFastbac1-MTC28) extracted from positive clone was identified by PCR and transfected into DH10 Bac competent cells to construct Bacmid-MTC28. The competent cells was amplified with liquid LB medium containing gentamicin, kanamycin and tetracycline, positive clone was screened by blue-white technique. The positive bacteria was amplified by LB liquid medium, extracted the plasmid (Bacmid-MTC28) and identified the target genes by PCR. By liposome transfection, the recombinant plasmid Bacmid-MTC28 was transfected into Sf9 insect cells in logarithmic growth phase, packaged recombinant baculovirus and expressed protein. We successfully constructed the eukaryotic expression plasmid of Bacmid-MTC28, established a baculovirus expression vector and expressed the corresponding proteins. High purity and homogenized MTC28 protein was obtained by purification.

Mycobacteriumtuberculosis； Mitochondrial proteins； Genes, mitochondrial； Transfection； Plasmid； Insect cells

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.021

廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020212238、2016A020216021);廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201604020006)

510630 廣州，廣東省結(jié)核病控制中心(卓文基、周琳、陳燕梅、陳濤、孫琦、郭卉欣)；廣州市胸科醫(yī)院肺部疾病研究所(劉志輝)

周琳,Email:gdtb@vip.163.com

2017-06-19)