84株廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)新型氟喹諾酮類藥物的耐藥情況分析

宗兆婧 荊瑋 霍鳳敏 董玲玲 馬異峰 逄宇 黃海榮

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·論著·

84株廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)新型氟喹諾酮類藥物的耐藥情況分析

宗兆婧 荊瑋 霍鳳敏 董玲玲 馬異峰 逄宇 黃海榮

目的 研究廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對(duì)新型氟喹諾酮類藥物的耐藥特征以及氟喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)基因突變的特點(diǎn)。 方法 選取2012年4月至2014年4月在北京胸科醫(yī)院住院治療的84例廣泛耐藥結(jié)核病患者的臨床分離菌株，應(yīng)用微孔板阿爾瑪藍(lán)顯色法(micro-plate alamar blue assay，MABA) 檢測(cè)菌株對(duì)左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)，所有菌株都進(jìn)行了gyrA基因和gyrB基因的耐藥決定區(qū)(QRDR)的序列測(cè)定。 結(jié)果 84株廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株經(jīng)MABA 檢測(cè)，分別以1 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml作為耐藥判讀標(biāo)準(zhǔn)，左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星3種氟喹諾酮類藥物的耐藥率分別是88.1%(74/84)、44.0%(37/84)、61.9%(52/84)。89.3%(75/84)的臨床分離株發(fā)生了gyrA基因耐藥決定區(qū)突變，其中以第94位點(diǎn)突變最為常見，Asp94Gly突變菌株的MIC值較高，而所有菌株的gyrB基因均為野生型。 結(jié)論 廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)新型氟喹諾酮類藥物耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，耐藥基因突變形式以gyrA基因突變?yōu)橹?，?4位點(diǎn)的Asp94Gly突變可能和高水平耐藥有關(guān)。

泛耐藥結(jié)核??； 分枝桿菌，結(jié)核； 喹諾酮類； 微生物敏感性試驗(yàn)； 多藥耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)類； 點(diǎn)突變

結(jié)核病耐藥形勢(shì)日趨嚴(yán)重，新型抗結(jié)核藥物的開發(fā)和針對(duì)耐藥結(jié)核病治療的新方案制定迫在眉睫。氟喹諾酮類藥物 (fluoroquinolones，F(xiàn)Qs) 抗菌譜廣、殺菌效果好、半衰期長(zhǎng)，并且對(duì)結(jié)核分枝桿菌同樣有效，因此被認(rèn)為是一類治療耐藥結(jié)核病的有效藥物[1]。包含氟喹諾酮類藥物的抗結(jié)核治療方案可提高痰菌轉(zhuǎn)陰率，縮短抗結(jié)核治療周期，對(duì)減少結(jié)核病的傳播和耐藥結(jié)核病的發(fā)生有重要意義[2]。第三代氟喹諾酮類藥物左氧氟沙星在我國(guó)已被廣泛應(yīng)用于耐藥結(jié)核病的治療，擁有更強(qiáng)抗分枝桿菌活性的第四代氟喹諾酮類藥物莫西沙星和加替沙星，近年來也逐步在臨床得到使用。氟喹諾酮類藥物與常用的一線、二線抗結(jié)核藥物無交叉耐藥[3]，莫西沙星和加替沙星不僅有強(qiáng)大的殺菌活性，對(duì)人體內(nèi)持留菌也有殺菌作用[4]，因此對(duì)耐藥結(jié)核病的治療顯示出良好的應(yīng)用前景。在WHO耐藥結(jié)核病指南[5]和我國(guó)耐藥結(jié)核病診療指南[6]中，都推薦第三代和第四代氟喹諾酮類藥物用于耐藥結(jié)核病的治療，但氟喹諾酮類藥物對(duì)廣泛耐藥(extensive drug resis-tance，XDR)結(jié)核病的應(yīng)用價(jià)值，無論是技術(shù)指南還是臨床實(shí)踐，都缺乏針對(duì)性的數(shù)據(jù)。

氟喹諾酮類藥物通過與細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶(拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ)結(jié)合，阻止DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致DNA降解和細(xì)菌死亡，進(jìn)而達(dá)到殺滅結(jié)核分枝桿菌的作用。結(jié)核分枝桿菌對(duì)氟喹諾酮類藥物發(fā)生耐藥的分子機(jī)制主要是編碼DNA促旋酶的基因突變[7]。DNA促旋酶由gyrA和gyrB編碼的A亞基和B亞基組成，A亞基是多數(shù)氟喹諾酮類藥物的作用靶點(diǎn)，因此不同氟喹諾酮類藥物之間容易出現(xiàn)交叉耐藥[8]。由于氟喹諾酮類藥物的不合理使用和抗生素濫用，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群對(duì)該類藥物的耐藥情況日益加重，環(huán)丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等已經(jīng)出現(xiàn)較高的耐藥性[9]。而且，隨著臨床用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，氟喹諾酮類藥物的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)還會(huì)隨之逐漸升高[10]，耐藥程度加重。

因此，了解廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對(duì)不同氟喹諾酮類藥物的藥物耐受情況及耐藥相關(guān)基因突變情況，可以為廣泛耐藥結(jié)核病方案中氟喹諾酮類藥物的選擇提供依據(jù)。本研究選擇廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，對(duì)左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)以及耐藥相關(guān)基因突變的檢測(cè)分析。

資料和方法

一、菌株和試劑來源

1. 菌株來源：本研究的84株廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株來自北京胸科醫(yī)院2012年4月至2014年4月住院患者臨床分離株。所有菌株均經(jīng)對(duì)硝基苯甲酸(PNB)抑制生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定為結(jié)核分枝桿菌，且絕對(duì)濃度法臨床檢測(cè)均對(duì)氧氟沙星耐藥。

2. 試劑儀器來源：藥敏試驗(yàn)所用左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星、7H9培養(yǎng)基藥粉均購(gòu)買于Sigma公司。營(yíng)養(yǎng)添加劑OADC購(gòu)買于美國(guó)BD公司，羅氏培養(yǎng)基購(gòu)買于珠海銀科公司，96孔板購(gòu)買于美國(guó)Costar公司，阿爾瑪藍(lán)(Alamar blue)購(gòu)買于美國(guó)Bio-Rad公司。

二、研究方法

1. 微孔板阿爾瑪藍(lán)顯色法(micro-plate Alamar blue assay，MABA)藥敏試驗(yàn)：刮取羅氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4周的新鮮菌落，磨菌瓶研磨均勻，稀釋菌懸液至1麥?zhǔn)媳葷岫?，再稀?/20，向預(yù)制的含藥96孔板中每孔加入100 μl菌液。37 ℃培養(yǎng)7 d，再向微孔板中加入20 μl阿爾瑪藍(lán)和50 μl 5% Tween-80的預(yù)混顯色液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h觀察96孔板顏色變化。判定標(biāo)準(zhǔn)：藍(lán)色孔為無菌生長(zhǎng)，粉色孔為有菌生長(zhǎng)，藍(lán)色孔的最低藥物濃度記為能抑制結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的MIC。對(duì)3種氟喹諾酮類藥物(左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星)均設(shè)置11個(gè)倍比稀釋的濃度測(cè)試梯度，為0.032～32 μg/ml。當(dāng)MIC>判定界值時(shí)判斷為耐藥，反之則為敏感。按照WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)，分別按照1 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml 作為左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星的流行病學(xué)耐藥判讀標(biāo)準(zhǔn)[5]，其中高水平耐藥按照MIC≥4 μg/ml判讀[11]。

2. 氟喹諾酮類耐藥相關(guān)基因擴(kuò)增及序列測(cè)定：新鮮菌落80 ℃金屬浴2 h，離心半徑8 cm，12 000 r/min離心10 min去上清，每個(gè)環(huán)氧樹脂(EB)離心管內(nèi)加20 μg/ml溶菌酶200 μl和菌沉淀37 ℃孵育過夜。按照MasterPure基因組DNA提取試劑盒流程抽提菌株的基因組DNA。設(shè)計(jì)引物對(duì)gyrA和gyrB進(jìn)行擴(kuò)增、產(chǎn)物測(cè)序。gyrA上游引物序列5′-GATGACAGACACGACGTTGC-3′，下游引物序列5′-GGGCTTCGGTGTACCTCAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為398 bp；gyrB上游引物序列5′-GAGTTGGTGCGGCGTAAGAGC-3′，下游引物序列5′-CGGCCATCAAGCACGATCTTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為322 bp。以上擴(kuò)增產(chǎn)物均送睿博興科公司測(cè)序。

結(jié) 果

1. 左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星的MIC結(jié)果：在84株廣泛耐藥菌株中，左氧氟沙星的MIC值分布在0.25～16 μg/ml之間，莫西沙星的MIC值分布在0.125～16 μg/ml之間，加替沙星的MIC值分布在0.125～8 μg/ml之間。所有廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對(duì)左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星的MABA法藥敏試驗(yàn)MIC結(jié)果如表1所示。分離株對(duì)左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星的耐藥率分別是88.1%、44.0%、61.9%。

表1 84株廣泛耐藥MTB菌株對(duì)左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星的MIC值分布情況

注 Lfx：左氧氟沙星；Mfx：莫西沙星； Gfx：加替沙星

2. 三種新型喹諾酮類藥物之間的交叉耐藥結(jié)果：按照WHO推薦的1 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml判讀左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星耐藥情況，84株臨床分離株中包括左氧氟沙星耐藥74株、莫西沙星耐藥37株、加替沙星耐藥52株，對(duì)這3種新型氟喹諾酮類藥物同時(shí)耐藥的菌株有37株。按照WHO提出的莫西沙星耐藥臨界值0.5 μg/ml判讀，臨床分離株對(duì)左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星耐藥的菌株數(shù)目分別是74、76、52株，對(duì)3種藥物同時(shí)耐藥的菌株有52株，如圖1所示。

圖1 左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星三種新型氟喹諾酮類藥物之間的交叉性耐藥情況

3. 耐藥相關(guān)基因測(cè)序分析結(jié)果：對(duì)菌株進(jìn)行g(shù)yrA和gyrB測(cè)序分析，gyrA基因突變率較高(89.3%，75/84)。突變集中在第88、90、91、94位點(diǎn)，以第94位點(diǎn)突變?yōu)橹?57.1%，48/84)，且在該位點(diǎn)檢測(cè)到Asp94Gly、Asp94Asn、Asp94Ala、Asp94Tyr、Asp94His共5種氨基酸突變形式，其中存在Asp94Gly突變的菌株MIC較高，該突變位點(diǎn)和形式可能與氟喹諾酮類藥物高水平耐藥相關(guān)，具體數(shù)據(jù)見表2。gyrB未見堿基突變，均為野生型，未見gyrA和gyrB兩基因聯(lián)合突變。

討 論

氟喹諾酮類藥物在耐藥結(jié)核病治療中非常重要，但此類藥物兼有廣譜抗生素身份，在社區(qū)獲得性肺炎、支氣管擴(kuò)張、慢性阻塞性肺疾病急性加重期、泌尿系感染等一般細(xì)菌感染中廣泛應(yīng)用，因而易于出現(xiàn)過多藥物暴露而發(fā)生耐藥。廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對(duì)新型氟喹諾酮類抗菌藥物出現(xiàn)較高的耐藥率，將給臨床抗結(jié)核治療方案的制定造成極大難題。

通過MABA法檢測(cè)84株廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的MIC值顯示，同一菌株中莫西沙星和加替沙星的MIC小于左氧氟沙星，與研究報(bào)道一致[12]。WHO曾經(jīng)推薦的莫西沙星耐藥的臨床臨界值為0.5 μg/ml，新的指南改為推薦0.5 μg/ml和2 μg/ml兩個(gè)濃度，但更傾向于推薦應(yīng)用2 μg/ml的濃度[5]。在84株臨床分離株中，所測(cè)試的3種藥物之間存在著雙向交叉耐藥，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群對(duì)第三代和第四代氟喹諾酮類藥物有較高的耐藥比例，這一結(jié)論也和目前指南[5-6]指出的第四代氟喹諾酮類藥物體外藥敏試驗(yàn)提示交叉耐藥一致[12-15]。當(dāng)按照0.5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)判讀莫西沙星耐藥時(shí)，耐藥菌株比例(76/84，90.5%)甚至超過左氧氟沙星耐藥的菌株(74/84，88.1%)，但按照2 μg/ml耐藥界值判讀，則莫西沙星耐藥菌株的比例大幅度降低(44.0%，37/84)。由此不難發(fā)現(xiàn)，藥物敏感性試驗(yàn)中臨界值的選定對(duì)于耐藥和交叉耐藥的判定起著決定性影響，因此臨界濃度的確定需要在長(zhǎng)期、多中心、大數(shù)據(jù)評(píng)估的基礎(chǔ)之上建立才可能更準(zhǔn)確。

除了莫西沙星外，WHO新的指南也調(diào)整了左氧氟沙星的耐藥臨界濃度，由2 μg/ml更改為1 μg/ml[5]。本課題組一項(xiàng)研究也證實(shí)目前應(yīng)用的左氧氟沙星臨界濃度值大于結(jié)核分枝桿菌的流行病學(xué)界值，故而會(huì)將一些含有耐藥相關(guān)基因突變的菌株判讀為野生菌株[17]。Poissy等[11]對(duì)5株廣泛耐藥菌株進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，對(duì)左氧氟沙星耐藥的廣泛耐藥菌株在莫西沙星MIC<2 μg/ml時(shí)仍可在廣泛結(jié)核病治療中應(yīng)用。Maitre等[18]認(rèn)為無論氟喹諾酮類耐藥還是敏感，在廣泛耐藥結(jié)核病的治療中莫西沙星的治療效果明顯優(yōu)于左氧氟沙星。本研究有39株(39/84，46.43%)臨床分離株因莫西沙星耐藥臨界值由0.5 μg/ml 變?yōu)? μg/ml而被判讀為莫西沙星敏感菌株，有13株(13/84，15.48%)菌株對(duì)左氧氟沙星的MIC為1 μg/ml、因臨界值改變由原來的敏感菌株被判讀為耐藥菌株。然而，這些患者應(yīng)用莫西沙星方案是否有效尚不得而知。耐藥臨界值是提示結(jié)核分枝桿菌對(duì)藥物敏感情況的一項(xiàng)重要指標(biāo)，在患者抗結(jié)核方案的制定中起到非常重要的作用。然而WHO對(duì)莫西沙星MIC判讀標(biāo)準(zhǔn)改變?cè)虿⑽醋龀鲈敿?xì)的解釋，左氧氟沙星耐藥且莫西沙星MIC介于0.5～2 μg/ml之間的菌株對(duì)莫西沙星臨床治療效果如何，還需要進(jìn)一步的臨床觀察和評(píng)估。

表2 84株廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中g(shù)yrA基因突變形式和MIC

注 Lfx：左氧氟沙星；Mfx：莫西沙星； Gfx：加替沙星；Ala：丙氨酸；Asn：天冬酰胺；Val：纈氨酸；Pro：脯氨酸；His：組氨酸；Tyr：酪氨酸；Gly：甘氨酸；Cys：半胱氨酸；Asp：天冬氨酸；Ser：絲氨酸；耐藥菌株數(shù)目按照流行病學(xué)界值判讀；高水平耐藥定義為MIC≥4 μg/ml

按照莫西沙星臨床耐藥臨界濃度2 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)，左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星三者之間比較，出現(xiàn)了左氧氟沙星、加替沙星耐藥但莫西沙星敏感的現(xiàn)象。本研究中加替沙星耐藥率高于莫西沙星，考慮是因?yàn)榧犹嫔承亲鳛榈谒拇Z酮類藥物，殺菌活性較強(qiáng)，然而其MIC臨界值則使用了和三代氟喹諾酮類藥物相同的1 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)。不排除隨著加替沙星使用的增多，在獲得更多數(shù)據(jù)的情況下會(huì)對(duì)耐藥臨界值的調(diào)整。

因氟喹諾酮類藥物不同于一線抗結(jié)核藥物的殺菌機(jī)制，被廣泛應(yīng)用于耐藥結(jié)核病的治療[19]。本研究發(fā)現(xiàn)的突變熱點(diǎn)主要集中在gyrA基因的QRDR，該段序列高度保守，是氟喹諾酮類藥物結(jié)合的主要部位[21]。本研究結(jié)果初步表明，gyrA基因突變是廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)以上3種氟喹諾酮類藥物耐藥主要機(jī)制。本研究得到的gyrA基因突變均為錯(cuò)義突變，主要發(fā)生在基因保守區(qū)第67～106位的密碼子區(qū)，第88位、90位、91位、94位密碼子上，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致[16,21]。Asp94Gly和Ala90Val的改變是最常見的耐藥突變類型，與同類研究結(jié)果一致[16,22]。在gyrA基因突變類型中，Asp94Gly位點(diǎn)突變可能與氟喹諾酮類高水平耐藥有關(guān)，該種突變形式相關(guān)的高水平耐藥菌株數(shù)目為左氧氟沙星>莫西沙星>加替沙星，說明在目前左氧氟沙星更易出現(xiàn)高水平耐藥突變?？赡芘c該位點(diǎn)基因突變類型引起致氟喹諾酮類藥物靶標(biāo)gyrA結(jié)構(gòu)的顯著改變有關(guān)，氟喹諾酮類藥物和gyrA結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變，使A亞基和氟喹諾酮類藥物結(jié)合能力顯著下降，進(jìn)而導(dǎo)致MIC的變化并出現(xiàn)耐藥。

在本研究的84株廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中，未檢測(cè)到gyrA突變也無gyrB的菌株有9株，其中分別有4株對(duì)左氧氟沙星耐藥、5株對(duì)莫西沙星耐藥。此種表型藥敏試驗(yàn)和基因型藥敏結(jié)果不一致的現(xiàn)象，推測(cè)可能與菌群的異質(zhì)性有關(guān)?；颊吒腥镜慕Y(jié)核分枝桿菌復(fù)合群同時(shí)存在對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥和敏感的不同菌群，如敏感菌株為優(yōu)勢(shì)菌群，可能會(huì)因?yàn)槟退幘瓯壤^低而無法檢測(cè)到相關(guān)耐藥基因突變，而表型藥敏試驗(yàn)由于能檢測(cè)到較低比例的耐藥菌群的存在，因此報(bào)告耐藥[23]。另外，gyrA和gyrB基因突變以外的其他耐藥機(jī)制也可能造成上述結(jié)果的不一致，如拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的改變、細(xì)胞膜通透性改變、藥物外排泵等機(jī)制。

部分廣泛耐藥菌株在第88和第90位點(diǎn)存在突變(Gly88Ala突變3株、Ala90Val突變4株)，但這些菌株仍表現(xiàn)為對(duì)這3種新型氟喹諾酮類藥物敏感的藥敏表型，考慮為氨基酸結(jié)構(gòu)原因。纈氨酸(Val)、甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)同屬于非極性氨基酸，且這三種氨基酸在結(jié)構(gòu)、荷電性等方面相似，因此Gly88Ala、Ala90Val的改變未能引起gyrA基因與氟喹諾酮類藥物結(jié)合能力的明顯改變，故未能導(dǎo)致明顯耐藥表型改變。

綜上所述，廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌中氟喹諾酮類藥物耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，新型氟喹諾酮類藥物已存在嚴(yán)重耐藥，氟喹諾酮類藥物在廣泛耐藥結(jié)核病治療中的應(yīng)用受到極大地挑戰(zhàn)。在廣泛耐藥結(jié)核病治療方案制定中，應(yīng)按照藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)估相應(yīng)的用藥指征，而耐藥界值的判定需要更多的臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證。

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(本文編輯：范永德)

首屆臨床結(jié)核病超聲診斷與治療新進(jìn)展研討會(huì)征文通知

超聲在結(jié)核病的診斷與治療中不可或缺，應(yīng)該引起業(yè)界同仁的高度重視并進(jìn)行實(shí)踐探索。超聲及超聲介入技術(shù)簡(jiǎn)便易行，具有高性價(jià)比，尤其超聲技術(shù)對(duì)多臟器的可企及性，更是開辟了對(duì)多種臟器結(jié)核病診斷與治療的新領(lǐng)域。為及時(shí)交流臨床結(jié)核病超聲診斷與治療的經(jīng)驗(yàn)和科研成果，掌握最新學(xué)術(shù)動(dòng)態(tài)，推動(dòng)結(jié)核病超聲診療工作的規(guī)范化進(jìn)程，由中國(guó)防癆協(xié)會(huì)《中國(guó)防癆雜志》期刊社、杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院聯(lián)合主辦的“首屆臨床結(jié)核病超聲診斷與治療新進(jìn)展研討會(huì)”擬于2017年10月19—22日在浙江省杭州市召開。大會(huì)將邀請(qǐng)國(guó)內(nèi)結(jié)核病超聲領(lǐng)域、臨床領(lǐng)域、基礎(chǔ)研究領(lǐng)域知名專家對(duì)結(jié)核病診療國(guó)內(nèi)外最新研究動(dòng)向、最新理論等進(jìn)行精彩的專題學(xué)術(shù)講座，同時(shí)將遴選優(yōu)秀會(huì)議征文進(jìn)行大會(huì)發(fā)言，并擬于《中國(guó)防癆雜志》組織專題重點(diǎn)號(hào)刊發(fā)。

征文要求：(1)凡符合超聲診斷與介入技術(shù)在結(jié)核病臨床應(yīng)用、基礎(chǔ)研究方面內(nèi)容的稿件均在征文之列。來稿要求未在國(guó)內(nèi)外公開發(fā)行刊物上發(fā)表(請(qǐng)?jiān)谖念}上方注明“未公開發(fā)表，未一稿多投”)；(2)論著類稿件需提供全文+800字左右的摘要，摘要包括目的、方法、結(jié)果和結(jié)論，也可僅提供符合上述要求的摘要；(3)其他類型稿件為全文投稿；(4)全文4000字以內(nèi)，編排順序?yàn)椋侯}目、郵編、單位(至科室)、姓名、中文摘要、正文、參考文獻(xiàn)；(5)本次會(huì)議征文不接收通過郵局郵寄的紙質(zhì)版論文，只接收Word版電子文件；格式為：題目3號(hào)黑體、正文5號(hào)宋體，單倍行距；(6)請(qǐng)務(wù)必附第一作者與通信作者的通信地址、聯(lián)系電話、手機(jī)、Email。入選論文將納入會(huì)議《資料匯編》，經(jīng)大會(huì)學(xué)術(shù)委員會(huì)評(píng)選出的優(yōu)秀論文將推薦刊登于《中國(guó)防癆雜志》或《結(jié)核病與肺部健康雜志》，并安排大會(huì)發(fā)言；(7)征文請(qǐng)通過Email發(fā)送至郭萌編輯郵箱(手機(jī)：17718596164；電話：010-62257257；Email：guomenggg@163.com)。郵件注明“結(jié)核病超聲會(huì)議”；截止日期：2017年9月1日。

《中國(guó)防癆雜志》期刊社

杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院

Resistance analysis of 84 extensively drug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates against three new generation fluoroquinolones

ZONGZhao-jing,JINGWei,HUOFeng-min,DONGLing-ling,MAYi-feng,PANGYu,HUANGHai-rong.

NationalClinicalLaboratoryonTuberculosis,BeijingKeyLaboratoryforDrug-resistantTuberculosisResearch,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingTuberculosisandThoracicTumorInstitute,Beijing101149，China

HUANGHai-rong,Email:huanghairong@tb123.org

Objective To investigate the resistant status of extensively drug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates against new genratation fluroquinolones (FQs)． Methods Extensively drug-resistantMycobacteriumtuberculosis(XDR-MTB) clinical isolates were collected from Beijing Chest Hospital between 2012—2014. Absolute concentration method was used for ofloxacin (Ofx) and levofloxacin (Lfx) susceptibility testing, while broth dilution method was used to detect the minimal inhibitory concentration (MIC) of the isolates against three FQs，including Lfx，moxifloxacin (Mfx) and gatifloxacin (Gfx). The quinolone resistance determining regions (QRDR) ofgyrAandgyrBwere sequenced for all the enrolled isolates. Results A total of 84 XDR-MTB isolates were enrolled. Among them,74 (74/84, 88.1%), 37 (37/84，44.0%) and 52 (52/84, 61.9%) isolates were resistant to Lfx, Mfx and Gfx according the cut-off criteria recommended by WHO, respectively. Mutations at 88, 90, 91 and 94 locus ofgyrAwere detected among 89.3% (75/84)of the enrolled isolates, and Asp94Gly accounting for high-level FQs resistance. All the strains had wild typegyrB. Conclusion Our findings demonstrated that new generation FQs resistance were very frequently observed among XDR-MTB isolates, and mutation within QRDR ofgyrAwas the main mechanism of FQs resistance.

Extensively drug-resistant tuberculosis;Mycobacteriumtuberculosis; Quinolones; Microbial sensitivity tests; Multidrug resistance-associated proteins; Point Mutation

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.005

101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 國(guó)家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室

黃海榮，Email: huanghairong@tb123.org

2017-06-19)