肺結核患者血清維生素D與外周血T淋巴細胞亞群水平變化及臨床意義

周穎 董偉毅 倪佩青 鐘慧君 俞萍

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·論著·

肺結核患者血清維生素D與外周血T淋巴細胞亞群水平變化及臨床意義

周穎 董偉毅 倪佩青 鐘慧君 俞萍

目的 探討肺結核患者血清25-羥基維生素D[25-(OH)D]與血清T淋巴細胞亞群水平的變化及臨床意義。方法 于2012年2 月至2014年5月收集上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院結核病防治門診診治的386例肺結核患者作為肺結核組；選取同期在醫(yī)院進行健康體檢的647名健康人群作為健康對照組。肺結核組中所有患者均進行了規(guī)范的抗結核藥物治療，采用數(shù)字表法隨機選取 44例患者在抗結核藥物治療基礎上增加維生素D治療，作為治療組；選取45例患者不增加維生素D治療，作為治療對照組。采用液相色譜-質譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)測定研究對象血清25-(OH)D2、25-(OH)D3和T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+絕對值水平，比較肺結核組與健康對照組，以及維生素D治療組和治療對照組上述指標的變化情況。結果 肺結核組患者25-(OH)D、25-(OH)D2、25-(OH)D3水平分別為31.3(22.5～41.5)、0.3(0.0～1.5)、31.9(22.3～41.1) nmol/L，明顯低于健康對照組的42.0(34.3～51.5)、2.0(1.5～3.6)、40.1(31.9～49.5) nmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(Z值分別為12.19、16.42、9.89，P值均<0.01)；肺結核組CD3+、CD4+、CD8+絕對值水平分別為968.0(800.0～1164.0)、524.0(460.0～656.0)、394.0(288.0～512.0)個/μl，明顯低于健康對照組的1324.0(1116.0～1568.0)、708.0(568.0～864.0)、524.0(412.0～652.0)個/μl，差異均有統(tǒng)計學意義(Z值分別為15.68、13.30、12.15，P值均<0.01)。肺結核維生素D治療組25-(OH)D3、25-(OH)D以及CD3+絕對值水平在治療6個月分別為39.3(31.7～54.5) nmol/L、46.5(36.0～57.5) nmol/L、1268.0(1012.0～1448.0)個/μl，高于治療對照組同期水平[39.3(34.3～45.8) nmol/L、38.0(33.8～44.8) nmol/L、1008.0(752.0～1212.0)個/μl]，差異有統(tǒng)計學意義(Z值分別為2.57、1.45、2.41，P值分別為0.012、0.150、0.018)。結論 肺結核患者血清25-(OH)D及外周血T淋巴細胞亞群水平低下，糾正維生素D的缺乏或不足可改善患者的細胞免疫功能。

結核，肺； 維生素D； T淋巴細胞亞群； 橫斷面研究

維生素D是一種脂溶性維生素，除具有調控鈣、磷代謝和骨穩(wěn)定狀態(tài)等作用外，還參與宿主防御、炎癥、免疫調節(jié)和修復等一系列病理生理過程[1]。研究表明，維生素D能作用于各種免疫細胞表面的維生素D受體(VDR)調節(jié)免疫系統(tǒng)[2]，尤其是T淋巴細胞，維生素D能誘導其增殖分化[3]。筆者采用液相色譜-質譜-質譜(LC-MS-MS)聯(lián)用法測定肺結核患者的血清25-羥基維生素D[25-(OH)D]水平，以及血清T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+絕對值水平，探討肺結核患者血清25-(OH)D水平與外周血T 淋巴細胞亞群水平的變化及臨床意義。

對象和方法

1.對象：于2012年2 月至2014年5月收集上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院結核病防治門診診治的386例肺結核患者作為肺結核組；選取同期在醫(yī)院進行健康體檢的647名健康人群作為健康對照組。肺結核組中所有患者均進行了規(guī)范的抗結核藥物治療，應用隨機數(shù)字表法選取 44例患者在抗結核藥物治療基礎上增加維生素D治療，作為治療組；選取45例患者不增加維生素D治療，作為治療對照組。研究對象均簽署知情同意書。

2.納入排除標準：(1)肺結核組：參照《肺結核診斷標準》(WS288-2008)，根據患者臨床癥狀、體征、胸片、CT掃描結果、痰菌檢查確診，排除肝腎功能不全、惡性腫瘤、3個月內服用含維生素D保健品及藥品者。(2)健康對照組：體檢健康者，排除肝腎功能不全、惡性腫瘤、3個月內服用含維生素D的保健品及藥品者。(3)患者治療組：在確診的肺結核患者中，排除年齡>65歲、<18歲的患者，應用數(shù)字表隨機抽取44例患者在規(guī)范抗結核藥物治療的基礎上增加維生素D治療，即口服阿法骨化醇軟膠囊(南通華山藥業(yè)有限公司)，0.25 μg/片，每次0.5 μg(2粒)，1次/d。(4)治療對照組：在確診肺結核患者中，數(shù)字表法隨機抽取45例患者，進行規(guī)范的抗結核藥物治療，不增加維生素D治療，僅監(jiān)測外周血維生素D及T淋巴細胞亞群水平。

3.維生素D檢測：抽取研究對象空腹血清，采用LC-MS-MS法，以25-羥基維生素D2-氘3和25-羥基維生素D3-氘6為內標，測定25-(OH)D2和25-(OH)D3，用 Analyst 1.5軟件采集檢測數(shù)據并作定量分析。API 4000串聯(lián)質譜儀購自美國AB Sciex公司，Shimadzu系列液相色譜儀購自日本島津公司。低、中、高濃度質控的準確度為85%～115%，精密度(CV)應在15%以內。

4.外周血T淋巴細胞亞群檢測：采用 FACS流式細胞儀(美國BD公司)，試劑由美國 BD公司提供，嚴格按照操作程序優(yōu)化機器檢測條件，進入Multi SE 自動運行軟件，進行絕對計數(shù)質量控制和樣本檢測。

結 果

1.一般資料：肺結核組共386例，其中男 205例(53.1%)，女181例(46.9%)；年齡 15～84歲，平均年齡(39.21±17.86)歲。健康對照組共647名，其中男336名(51.9%)，女311名(48.1%)；年齡23～60歲，平均年齡(39.79±15.77)歲。兩組研究對象性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義，均衡可比(χ2=0.13，P=0.714；t=-0.54，P=0.590)。

患者治療組44例中有3例拒絕使用維生素D治療，故最終納入41例患者。其中，男17例(41.5%)，女24例(58.5%)；平均年齡(34.82±18.30)歲；初治38例(92.7%)，復治3例(7.3%)；菌陽15例(36.6%)，菌陰26例(63.4%)。治療對照組45例患者中，男18例(40.0%)，女27例(60.0%)；平均年齡(41.27±18.00)歲；初治43例(95.6%)，復治 2例(4.4%)；菌陽 16例(35.6%)，菌陰 29例(64.4%)。兩組研究對象性別、年齡、初復治情況、菌陰菌陽情況差異均無統(tǒng)計學意義，均衡可比(χ2=0.02，P=0.890；t=-1.64，P=0.104；χ2=0.32，P=0.570；χ2=0.01，P=1.000)。

2.肺結核組與健康對照組比較：肺結核患者的25-(OH)D[包括25-(OH)D2和25-(OH)D3] 及CD3+、CD4+、CD8+絕對值水平均低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(表 1)。

3.維生素D治療組與治療對照組的比較：維生素D治療組與治療對照組在治療前25-(OH)D3、25-(OH)D水平及CD3+、CD4+、CD8+絕對值水平差異無統(tǒng)計學意義(Z值分別為0.86、1.02、0.44、0.81、0.35，P值分別為0.390、0.310、0.662、0.416、0.729)。治療組在治療2個月和6個月時25-(OH)D、25-(OH)D3水平及CD3+、CD4+、CD8+絕對值水平均較治療前明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(2個月與治療前差值的統(tǒng)計量S值分別為207.5、204.5、202.0、64.5、82.5，P值分別為0.004、0.005、0.007、0.393、0.291；6個月與治療前差值的統(tǒng)計量S值分別為316.5、255.5、255.5、188.0、159.5，P值分別為0.000、0.001、0.000、0.013、0.030)；與治療對照組同期相比，25-(OH)D3、25-(OH)D及CD3+絕對值水平明顯高于治療對照組，差異有統(tǒng)計學意義(治療2個月：Z值分別為2.04、2.10、2.49，P值分別為0.045、0.039、0.015；治療6個月：Z值分別為2.57、1.45、2.41，P值分別為0.012、0.150、0.018)。治療對照組患者治療6個月期間25-(OH)D3、25-(OH)D及CD3+、CD4+、CD8+絕對值水平差異無統(tǒng)計學意義(2個月與治療前差值S值分別為42.0、36.5、-98.5、26.0、1.0，P值分別為0.641、0.685、0.271、0.773、0.991；6個月與治療前差值S值分別為204.5、197.5、0.5、35.5、42.0，P值分別為0.019、0.024、0.996、0.693、0.641)，見表2。

表1 25-(OH)D及T淋巴細胞亞群水平在肺結核組和健康對照組間的比較

表2 25-(OH)D和T淋巴細胞亞群水平在肺結核維生素D治療組與治療對照組間的比較

討 論

在科學家揭示了紫外光對皮膚結核有治療作用并因此獲得諾貝爾獎100多年后，研究人員終于弄清楚從陽光到維生素D到身體的識別結核分枝桿菌和對其發(fā)動免疫反應關鍵能力的途徑，發(fā)現(xiàn)結核分枝桿菌感染發(fā)病與維生素D缺乏相關[4-5]。

維生素D在經肝、腎內羥基化后，形成具有生物活性的1,25-二羥基維生素D3，稱為活性維生素D，但1,25-二羥基維生素D3在人體內的穩(wěn)定性不如25-(OH)D3。25-(OH)D3是血清中多種維生素D代謝產物中含量最多且最穩(wěn)定的一種[6]，故以25-(OH)D3作為衡量體內維生素D水平的主要指標。傳統(tǒng)觀念認為25-(OH)D3僅與機體鈣磷代謝有關，但近期研究表明，25-(OH)D3不僅具有調節(jié)鈣磷代謝的作用，還具有神經內分泌及免疫調節(jié)的作用，其免疫調節(jié)的靶細胞主要為T淋巴細胞群族，單核細胞等[7]，主要作用為正向的促增殖，從而提高機體細胞免疫功能。T淋巴細胞亞群水平的高低，是反應細胞免疫功能的重要指標[8]，維生素D與T細胞亞群水平的變化需進一步的研究。此類相關研究在國內較為缺乏。筆者通過隨訪肺結核患者抗結核藥物治療過程中維生素D與T細胞亞群水平的變化，以及部分肺結核患者在常規(guī)抗結核治療的基礎上增加足量的維生素D治療后維生素D與T細胞亞群水平的變化，探討維生素D與T細胞亞群水平變化的臨床意義，具有一定的科學依據。

本研究肺結核組患者總25-(OH)D[包括25-(OH)D2和25-(OH)D3]以及CD3+、CD4+、CD8+絕對值水平明顯低于健康對照組，予以抗結核藥物治療后無論治療組還是治療對照組25-(OH)D3、25-(OH)D以及CD3+、CD4+、CD8+絕對值水平均較治療前上升；肺結核患者血清25-(OH)D水平及外周血T 淋巴細胞亞群水平降低，證實維生素D缺乏抑制機體細胞免疫功能[9]，從而導致機體對結核分枝桿菌易感，隨著結核的治愈，細胞免疫功能改善，維生素D恢復正常水平。

肺結核患者在常規(guī)抗結核藥物治療的基礎上增加足量的維生素D治療，以提高患者免疫功能，協(xié)同提高抗結核藥物治療、提高肺結核治愈率[10]。本研究提示，增加維生素D治療組25-(OH)D3、25-(OH)D以及CD3+、CD4+、CD8+絕對值水平在治療2個月、6個月后均較治療前明顯上升，明顯高于治療對照組同期水平。25-(OH)D3水平低的肺結核患者，其機體免疫功能比較低下，如果能補充維生素D，使患者25-(OH)D3維持正常或較高水平，不僅可誘導、調節(jié)T淋巴細胞族群進一步分化，而且提高細胞免疫功能[11]，對使患者在合理用藥的基礎上盡快康復具有重要的作用。但也有多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照的有效性研究顯示，活動性肺結核患者標準化療方案基礎上加用維生素D不能縮短患者的痰菌陰轉時間[12]，而由于本研究的研究對象例數(shù)有限，故尚需進一步研究。

維生素D在20世紀40年代末期曾用來治療結核病。20世紀50年代中期，隨著抗結核藥物的出現(xiàn)，維生素D用來治療結核的關注度已明顯下降。通過維生素D治療提高細胞免疫功能，是否可用作治療結核病的輔助藥物，是否適合對結核病密切接觸和潛伏感染者用藥，以及其對改善結核病患者預后情況等仍需要進一步研究。

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(本文編輯：李敬文)

The changes and significance of 25-hydroxy vitamin D and T lymphocyte subsets levels in patients with pulmonary tuberculosis

ZHOUYing,DONGWei-yi,NIPei-qing,ZHONGHui-jun,YUPing.

DepartmentofInfectiousDiseases,ShanghaiXuhuiCenterHospital,Shanghai200031,China

ZHOUYing,Email:yingzhouwu@hotmail.com

Objective To investigate the changes and clinical significance of serum 25-hydroxy vitamin D (25-(OH)D) and peripheral blood T lymphocyte subsets levels in patients with pulmonary tuberculosis. Methods From Feb 2012 to May 2014, 386 cases of pulmonary tuberculosis patients and 647 healthy controls in Shanghai Xuhui Center Hospital were enrolled. All cases received standard anti-tuberculosis treatment. By using random number method, 44 patients were assigned to receive standard anti-tuberculosis treatment and vitamin D therapy (vitamin D treatment group), while 45 patients were assigned to receive standard anti-tuberculosis treatment only (control group). By using liquid chromatography and mass spectrometry (LC-MS/MS), serum 25-(OH)D2, 25-(OH)D3, CD3+, CD4+, CD8+T lymphocyte subsets levels were determined in all subjects. The changes were compared between pulmonary tuberculosis patients and healthy controls as well as between vitamin D treatment and control groups. Results The levels of 25-(OH)D, 25(OH)D2, and 25(OH)D3in pulmonary tuberculosis patients (31.3 (22.5-41.5), 0.3 (0.0-1.5), and 31.9 (22.3-41.1) nmol/L) were significantly lower than those in the healthy controls (42.0 (34.3-51.5), 2.0 (1.5-3.6), and 40.1 (31.9-49.5) nmol/L); the differences were statistically significant (Z=12.19, 16.42, and 9.89, respectively; allP<0.01). The CD3+, CD4+, and CD8+absolute value levels in pulmonary tuberculosis patients (968.0(800.0-1164.0)/μl, 524.0 (460.0-656.0)/μl, and 394.0 (288.0-512.0)/μl) were significantly lower than those in healthy controls (1324.0 (1116.0-1568.0)/μl, 708.0 (568.0-864.0)/μl, and 524.0 (412.0- 652.0)/μl); the differences were statistically significant (Z=15.68, 13.30, and 12.15, respectively; allP<0.01). In the vitamin D treatment group, the levels of 25-(OH)D3, 25-(OH)D, CD3+after 6 months of treatment were 39.3 (31.7-54.5) nmol/L, 46.5 (36.0-57.5) nmol/L and 1268.0 (1012.0-1448.0)/μl, which were higher compared with the control group (39.3 (34.3-45.8) nmol/L, 38.0 (33.8-44.8) nmol/L and 1008.0 (752.0-1212.0)/μl; the differences were statistically significant (Z=2.57, 1.45, 2.41, respectively;P=0.012, 0.150, 0.018, respectively). Conclusion The levels of serum 25-(OH)D and peripheral blood T lymphocyte subsets in patients with pulmonary tuberculosis are decreased. Correcting vitamin D deficiency/insufficiency can improve cellular immune function of patients with pulmonary tuberculosis.

Tuberculosis, pulmonary; Vitamin D; T-lymphocyte subsets; Cross-sectional studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.019

上海市徐匯區(qū)醫(yī)學科研項目(SHXH201204)

200031 上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院感染性疾病科

周穎，Email：yingzhouwu@hotmail.com

2017-02-23)