采用羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行MTB藥物敏感性試驗(yàn)的影響因素分析

姜廣路 戴廣明 黃海榮

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·論著·

采用羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行MTB藥物敏感性試驗(yàn)的影響因素分析

姜廣路 戴廣明 黃海榮

目的 評(píng)價(jià)基于羅氏培養(yǎng)基絕對(duì)濃度法的結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)檢測(cè)異煙肼、利福平、乙胺丁醇的藥物濃度標(biāo)準(zhǔn)，以及不同接種菌量、接種方式對(duì)耐藥性檢測(cè)結(jié)果的影響。方法 按照世界衛(wèi)生組織推薦方法從可能敏感患者和可能耐藥患者痰液樣本中的分離菌株，分別測(cè)定兩類菌株對(duì)異煙肼、利福平、乙胺丁醇的最低抑菌濃度(MIC)并計(jì)算累計(jì)百分比，以兩類菌株累計(jì)百分比差值最大的MIC確定耐藥界限；分別將菌量為10-3mg和10-4mg的結(jié)核分枝桿菌，接種于比例法耐藥界限的3種藥物含藥培養(yǎng)基，經(jīng)4周孵育后比較耐藥結(jié)果；比較接種量均為10-6mg菌量的兩種接種方法(接種環(huán)和滴管接種)孵育4周后菌落形成單位(CFU)的數(shù)量差異。 結(jié)果 異煙肼、利福平和乙胺丁醇經(jīng)絕對(duì)濃度法測(cè)定的濃度界限分別為0.2 μg/ml、40 μg/ml、2 μg/ml；不同接種量(10-3mg與10-4mg)接種相同含藥培養(yǎng)基，其藥敏試驗(yàn)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為0.57、0.00、0.00，P值分別為0.45、1.00、1.00)；使用接種環(huán)接種菌懸液的菌落形成單位數(shù)[(40.60±34.54)個(gè)，95%CI=35.08～46.12個(gè)]明顯多于使用滴管的菌落形成單位數(shù)[(11.27±11.11)個(gè)，95%CI=9.50～13.05個(gè)](t=11.58，P<0.01)。 結(jié)論 異煙肼、利福平、乙胺丁醇的耐藥界限采用比例法藥物濃度界限更適宜；接種菌量10-3mg和10-4mg對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果無明顯影響；接種環(huán)接種效果較滴管接種效果好。

分枝桿菌, 結(jié)核； 微生物敏感性試驗(yàn)； 培養(yǎng)基, 無血清； 診斷技術(shù)和方法； 結(jié)果與過程評(píng)價(jià)(衛(wèi)生保健)； 因素分析, 統(tǒng)計(jì)學(xué)

耐藥結(jié)核病是全球關(guān)注的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2016年結(jié)核病疫情報(bào)告估算，全球結(jié)核病疫情較以往估算更為嚴(yán)重。耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)患者絕對(duì)數(shù)最多的前3個(gè)國家分別是印度、中國、俄羅斯聯(lián)邦[1-2]，耐藥結(jié)核病仍是結(jié)核病控制的重大挑戰(zhàn)之一。高質(zhì)量的結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)，對(duì)耐藥結(jié)核病的控制至關(guān)重要。綜合考慮成本和可操作性等諸多因素，基于羅氏培養(yǎng)基的傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)短期內(nèi)仍不能被完全替代。目前我國的結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢測(cè)指南、檢驗(yàn)規(guī)程將絕對(duì)濃度法和比例法同時(shí)作為標(biāo)準(zhǔn)方法[3-4]，但在實(shí)際工作中，這兩種方法的耐藥檢測(cè)結(jié)果有一定差異，曾經(jīng)有學(xué)者對(duì)兩種方法的接種菌量、細(xì)菌菌懸液的制備、出現(xiàn)差異的菌株最低抑菌濃度(MIC)等方面進(jìn)行了研究[5-9]，各個(gè)研究的結(jié)論不盡相同[10-11]；尤其對(duì)于兩種方法耐藥結(jié)果不一致時(shí)，如何確定結(jié)果的問題仍沒有明確解決。本研究基于對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)指南發(fā)展歷程的回顧[12-13]，按照世界衛(wèi)生組織(WHO)[14]及其他文獻(xiàn)推薦的方法[15]，根據(jù)兩種方法的不同之處，及患者抗結(jié)核藥物治療史選取符合研究目的的結(jié)核分枝桿菌菌株，測(cè)定異煙肼、利福平、乙胺丁醇的絕對(duì)濃度法耐藥濃度界限,并對(duì)接種量和接種方式(接種環(huán)接種和吸管滴加)等因素進(jìn)行分析, 以期為結(jié)束兩種方法并行，形成統(tǒng)一的檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

材料和方法

一、材料

1.菌株：依據(jù)研究目的不同，選取不同來源的菌株。所有結(jié)核分枝桿菌臨床分離株均經(jīng)過對(duì)硝基苯甲酸鑒別培養(yǎng)基(PNB)鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。(1)測(cè)定耐藥濃度界限的菌株：①可能敏感的結(jié)核分枝桿菌菌株(PS)。來自2007年全國結(jié)核病耐藥基線調(diào)查時(shí)未進(jìn)行抗結(jié)核藥物治療的新登記肺結(jié)核患者的分離菌株，共100株。②可能耐藥的結(jié)核分枝桿菌菌株(PR)。來自中國全球基金耐藥結(jié)核病控制項(xiàng)目湖北肺結(jié)核治療失敗患者分離株，以及北京胸科醫(yī)院肺結(jié)核患者經(jīng)異煙肼、利福平、乙胺丁醇治療不少于6個(gè)月的臨床分離株，共計(jì)對(duì)異煙肼、利福平的可能耐藥菌株各100株，對(duì)乙胺丁醇的可能耐藥菌株73株?？赡苊舾械慕Y(jié)核分枝桿菌菌株和可能耐藥的結(jié)核分枝桿菌菌株用于藥敏試驗(yàn)含藥培養(yǎng)基濃度標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，菌株數(shù)量符合WHO規(guī)定[14]的可能敏感的菌株不少于100株，可能耐藥的菌株不少于50株的規(guī)定。(2)用于藥敏試驗(yàn)接種菌量的研究菌株：來自2007年全國結(jié)核病耐藥基線調(diào)查菌株515株，用于藥敏試驗(yàn)接種菌量的研究菌株。(3)用于藥敏試驗(yàn)接種方法研究的菌株：北京胸科醫(yī)院肺結(jié)核患者分離株160株。(4)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株：H37Rv(ATCC27294)，來自國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室。

2.抗結(jié)核藥物：藥物純粉來自Sigma公司，異煙肼批號(hào)為115K0675，乙胺丁醇批號(hào)為28H1266，利福平批號(hào)為058K1405。

3.培養(yǎng)基：參照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[16]規(guī)定配制空白羅氏培養(yǎng)基和相應(yīng)濃度含藥羅氏培養(yǎng)基。

4. 22SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)：一環(huán)接種液體體積約10 μl[4]，由國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

5.耐藥性分子檢測(cè)試劑：結(jié)核分枝桿菌rpoB基因和突變檢測(cè)試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法，Cepheid 公司生產(chǎn)；批次：1000039249)。結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR熔解曲線法，廈門致善生物科技股份有限公司出品；批號(hào)：17010301)。

二、研究方法

1.絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)?zāi)退幗缦逌y(cè)定：綜合現(xiàn)行的比例法和絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)方法的濃度界限，制備一系列不同濃度的含藥培養(yǎng)基，以測(cè)定藥物的MIC。異煙肼終濃度分別為：0.05、0.1、0.2、0.4、1、2、4、8、16 μg/ml；利福平終濃度分別為5、10、20、40、80、100、200、250 μg/ml；乙胺丁醇終濃度為0.25、0.5、1、2、3、4、5 μg/ml。

2.菌懸液制備及接種：將試驗(yàn)菌株轉(zhuǎn)種至空白羅氏培養(yǎng)基，36～37 ℃培養(yǎng)至約3～4周，制備1麥?zhǔn)蠞岫?相當(dāng)于1 mg/ml菌懸液濁度)的菌懸液，經(jīng)2次10倍稀釋成10-2mg/ml，以滴管取0.1 ml分別滴加至空白培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基，在36～37 ℃下進(jìn)行孵育，孵育4周后報(bào)告結(jié)果。在對(duì)照培養(yǎng)基上細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛的前提下，以抑制99%結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為該試驗(yàn)的菌株MIC。

3.耐藥界限確定：分別統(tǒng)計(jì)可能敏感菌和可能耐藥菌的MIC累計(jì)百分比，將累計(jì)百分比之差(可能敏感菌和可能耐藥菌累計(jì)百分比相減的差值)最大的MIC確定為耐藥濃度界限。

4.耐藥驗(yàn)證：取利福平40 μg/ml

5.兩種檢測(cè)方法不同接種量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)耐藥性比較：比較含藥培養(yǎng)基藥物濃度相同而接種量不同的藥敏試驗(yàn)結(jié)果。按照比例法標(biāo)準(zhǔn)制備的異煙肼(0.2 μg/ml)、乙胺丁醇(2 μg/ml)、利福平(40 μg/ml)含藥培養(yǎng)基。取2007年全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查的結(jié)核分枝桿菌菌株515株，按照目前國內(nèi)規(guī)程絕對(duì)濃度法接種量[制備1麥?zhǔn)蠞岫?1 mg/ml)的菌懸液，逐步10倍稀釋制備成10-2mg/ml]，以滴管滴加0.1 ml接種于空白培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基上，經(jīng)36～37 ℃孵育，4周后報(bào)告結(jié)果；同時(shí)按照比例法藥敏試驗(yàn)方法[接種菌量(10-2mg/ml)]操作，以接種環(huán)的方式接種0.01 ml測(cè)定該細(xì)菌的耐藥性，將兩種方法的結(jié)果相比較，結(jié)果采用配對(duì)資料McNemar 檢驗(yàn)。

6.接種方式比較：比較接種量均為10-6mg菌量的兩種接種方法菌落生成單位(CFU)的數(shù)量差異。臨床分離結(jié)核分枝桿菌菌株160株，制備1麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，逐?0倍稀釋為10-4mg/ml和10-5mg/ml濃度的菌懸液，使用微量移液器取10-4mg/ml 菌懸液10 μl，接種至2支羅氏培養(yǎng)基后，再以接種環(huán)劃線涂勻；另取2支羅氏培養(yǎng)基，使用無菌吸管吸取10-5mg/ml菌懸液滴加0.1 ml至羅氏培養(yǎng)基，置于斜面架上，保持培養(yǎng)基斜面水平；將以上兩種接種方式接種的培養(yǎng)基置于同一恒溫培養(yǎng)箱孵育。經(jīng)36～37 ℃孵育4周后觀察菌落生成數(shù)量的差異。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，兩種檢測(cè)方法不同藥物濃度在相同培養(yǎng)基上檢測(cè)的耐藥性比較采用配對(duì)資料McNemar檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.藥敏試驗(yàn)在相同含藥培養(yǎng)基的濃度界限測(cè)定：異煙肼、利福平、乙胺丁醇的MIC測(cè)定結(jié)果分別為：異煙肼0.2 μg/ml、利福平40 μg/ml、乙胺丁醇2 μg/ml。詳見表1～3。檢測(cè)結(jié)果與絕對(duì)藥物法的MIC標(biāo)準(zhǔn)相同。

表1 異煙肼最低抑菌濃度分布

注 MIC累計(jì)百分比為(該濃度菌株數(shù)+以上所有濃度菌株數(shù))/菌株總數(shù)；MIC累計(jì)百分比之差為可能敏感菌和可能耐藥菌累計(jì)百分比相減的差值；“-”表示本研究對(duì)低于0.05 μg/ml或高于16 μg/ml的 MIC檢測(cè)濃度未進(jìn)行檢測(cè)，故未計(jì)算差值

表2 利福平最低抑菌濃度分布

注 MIC累計(jì)百分比為(該濃度菌株數(shù)+以上所有濃度菌株數(shù))/菌株總數(shù)；MIC累計(jì)百分比之差為可能敏感菌和可能耐藥菌累計(jì)百分比相減的差值；“-”表示本研究對(duì)低于5 μg/ml或高于250 μg/ml的MIC檢測(cè)濃度未進(jìn)行檢測(cè)，故未計(jì)算差值

表3 乙胺丁醇最低抑菌濃度分布

注 MIC累計(jì)百分比為(該濃度菌株數(shù)+以上所有濃度菌株數(shù))/菌株總數(shù)；MIC累計(jì)百分比之差為可能敏感菌和可能耐藥菌累計(jì)百分比相減的差值；“-”表示本研究對(duì)低于0.25 μg/ml或高于5 μg/ml的 MIC檢測(cè)濃度未進(jìn)行檢測(cè)，故未計(jì)算差值

2.耐藥基因突變驗(yàn)證結(jié)果：利福平40 μg/ml

3.不同接種量結(jié)果比較：本研究?jī)H對(duì)絕對(duì)濃度法和比例法的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用配對(duì)資料McNemar檢驗(yàn)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表4)。

4. 不同接種方法菌落計(jì)數(shù)：因菌落融合不能計(jì)數(shù)等原因，160對(duì)已接種細(xì)菌的羅氏培養(yǎng)基中，可統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量的培養(yǎng)基為153對(duì)。滴管接種法菌落均數(shù)為(11.27±11.11)個(gè) (95%CI：9.50～13.05個(gè))，劃線接種法菌落均數(shù)為(40.60±34.54)個(gè)(95%CI：35.08～46.12個(gè))，兩種接種方法菌落生成單位數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.58，P<0.01)。

討 論

一、異煙肼、利福平和乙胺丁醇絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)含藥培養(yǎng)基濃度標(biāo)準(zhǔn)界定

(一)國外絕對(duì)濃度法和比例法發(fā)展概述

1963年WHO公報(bào)提出結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)方法，包括Gertrud Meissner提出的絕對(duì)濃度法和Canetii提出的比例法[17]。絕對(duì)濃度法檢測(cè)的藥物包括異煙肼、鏈霉素、對(duì)氨基水楊酸，其中異煙肼濃度為0.2 μg/ml和1 μg/ml，含藥羅氏培養(yǎng)基制備時(shí)僅凝固1次，制備1麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，稀?0倍，以10 μl接種環(huán)分別接種于空白培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基各1環(huán)，接種菌量為2×10-4mg，約為2000～10 000個(gè)細(xì)菌。待結(jié)果報(bào)告時(shí)，含藥培養(yǎng)基生長(zhǎng)菌落超過20個(gè)為耐藥，判讀標(biāo)準(zhǔn)實(shí)質(zhì)是耐藥菌數(shù)量超過全部菌最低數(shù)量的1%即為耐藥。Canetti等提出的比例法，檢測(cè)藥物包括異煙肼、鏈霉素、對(duì)氨基水楊酸，其中異煙肼濃度為0.2 μg/ml和1 μg/ml，制備10-3mg/ml和10-5mg/ml菌懸液，分別取0.2 ml接種至空白培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基，至結(jié)果報(bào)告時(shí)，含藥培養(yǎng)基菌落數(shù)≥1%即為耐藥。由此可見，絕對(duì)濃度法與比例法創(chuàng)始之初，兩種方法理論基礎(chǔ)相同，耐藥臨界濃度和接種量均相同或相近。這些方法實(shí)踐基礎(chǔ)與1963年在東部非洲醫(yī)院的結(jié)核病患者異煙肼治療與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果比對(duì)的研究[17]有密切的關(guān)系，其研究發(fā)現(xiàn)患者治療后培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)情況與耐受0.2 μg/ml異煙肼的結(jié)核分枝桿菌所占的比率相關(guān)性最好，而與耐受1 μg/ml、5 μg/ml、50 μg/ml的所占比率相關(guān)性很差；特別值得注意的是，文獻(xiàn)[17]著重說明，療效與結(jié)核分枝桿菌的MIC無明顯的相關(guān)性。

至1969年，WHO公報(bào)中進(jìn)一步明確異煙肼濃度為0.2 μg/ml，利福平為40 μg/ml，乙胺丁醇為2 μg/ml[14]，并規(guī)定了結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)?zāi)退帩舛冉缦薜姆椒?，其?guī)定為選取可能敏感的菌株不少于100株，可能耐藥的菌株不少于50株，對(duì)這些菌株進(jìn)行MIC測(cè)定并統(tǒng)計(jì)累計(jì)百分比，將累計(jì)百分比差別最大的最低抑菌濃度作為耐藥界限。1997年World Health Organization與International Union Against Tuberculosis and Lung Disease[19]公布的Globalworkinggrouponantituberculosisdrugresistancesurveillance1guidelineforsurveillanceofdrugresistanceintuberculosis中提及的藥敏試驗(yàn)方法及其耐藥濃度界限仍保持與1963年、1969年WHO公報(bào)的耐藥界限一致。

(二)國內(nèi)絕對(duì)濃度法發(fā)展概述

我國最初的結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程規(guī)定的藥敏試驗(yàn)方法在1963年頒布[20]。其方法規(guī)定羅氏培養(yǎng)基制備時(shí)需凝固2次，檢測(cè)藥物包括異煙肼、鏈霉素、對(duì)氨基水楊酸，異煙肼濃度分別為0.1、1、10 μg/ml，接種量為0.1 mg，即相當(dāng)于1麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?.1 ml分別接種至空白培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基上；含藥培養(yǎng)基菌落少于10個(gè)菌落不報(bào)告，需重復(fù)試驗(yàn)；大于10個(gè)則記錄該濃度并報(bào)告該濃度，該方法重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)耐藥標(biāo)準(zhǔn)待與臨床結(jié)果比對(duì)后再確定；由此可知，國內(nèi)絕對(duì)濃度法創(chuàng)立最初其實(shí)質(zhì)是簡(jiǎn)化的MIC測(cè)定，并沒有規(guī)定耐藥標(biāo)準(zhǔn)。1963—1980年諸多學(xué)者對(duì)結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)進(jìn)行了研究[21-23]，但耐藥菌株均分離自臨床治療過的患者，并未嚴(yán)格來自治療失敗或治療6個(gè)月以上的結(jié)核病患者；制備羅氏培養(yǎng)基時(shí)仍然凝固2次。1980年《抗結(jié)核藥物耐藥性測(cè)定暫行規(guī)定》頒布[24]，含藥培養(yǎng)基中濃度分別為異煙肼1 μg/ml和10 μg/ml、乙胺丁醇5 μg/ml和50 μg/ml，以及利福平5、10和250 μg/ml，羅氏培養(yǎng)基制備時(shí)需凝固2次。在1996年刊登在《中國防癆雜志》的《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[16]中，將羅氏培養(yǎng)基凝固次數(shù)由2次改為1次，但藥物濃度并未進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。2006年出版的《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》同時(shí)將比例法和絕對(duì)濃度法列出[3]，絕對(duì)濃度法中鏈霉素不再使用加倍量?；谝陨习l(fā)展歷程，國內(nèi)的絕對(duì)濃度法與世界衛(wèi)生組織公告中報(bào)道的絕對(duì)濃度法、比例法均不相同，在培養(yǎng)基制備過程、接種步驟、結(jié)果判讀等方面有很大差異，必然導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果存在差異。

(三)國內(nèi)學(xué)者對(duì)兩種方法的比較研究

丁北川等[7]按照WHO規(guī)定的絕對(duì)濃度法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果與比例法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。劉宇紅等[10]研究表明，比例法和國內(nèi)絕對(duì)濃度法結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的藥物是異煙肼、乙胺丁醇，而濃度界限接近的利福平則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有差異的菌株MIC均在比例法和絕對(duì)濃度法濃度界限之間。也說明了兩種藥敏方法結(jié)果有差異的主要原因是耐藥界限。劉宇紅等[11]采用2000年全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查分離的結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行兩種方法的檢測(cè)比較，結(jié)果顯示異煙肼和利福平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，乙胺丁醇差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；也提示了諸多學(xué)者的研究結(jié)果比較不盡相同的原因，即在研究的所有結(jié)核分枝桿菌菌株中，兩種方法檢測(cè)的結(jié)核分枝桿菌菌株MIC介于比例法和國內(nèi)絕對(duì)濃度法耐藥界限之間的構(gòu)成比率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，不嚴(yán)格界定患者的用藥史，難以獲得穩(wěn)定的比較結(jié)果，也難以確定耐藥濃度界限。

(四)本研究測(cè)定的耐藥界限及討論

本研究根據(jù)WHO規(guī)定，嚴(yán)格依據(jù)治療史納入試驗(yàn)菌株(可能敏感菌株來自未治療的患者，可能耐藥菌株來自治療失敗的患者)，且樣本量不少于WHO規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示異煙肼、利福平、乙胺丁醇的羅氏培養(yǎng)基耐藥界限與比例法耐藥界限一致，經(jīng)檢測(cè)對(duì)利福平和異煙肼耐藥基因突變的結(jié)核分枝桿菌，其MIC介于比例法和國內(nèi)絕對(duì)濃度法耐藥界限之間，多數(shù)明確存在與表型耐藥相關(guān)的耐藥基因突變。

雖然近年很多學(xué)者對(duì)耐藥結(jié)核病影響因素進(jìn)行了大量研究，有學(xué)者提出傳播是結(jié)核分枝桿菌耐藥的主要原因[25]，這種結(jié)論是將初治和復(fù)治耐藥菌株合并分析所得的結(jié)果，更傾向于耐藥流行的影響因素研究。而本研究根據(jù)治療史將菌株進(jìn)行分類并測(cè)定MIC，是基于結(jié)核分枝桿菌耐藥的產(chǎn)生原因進(jìn)行分析。也有學(xué)者基于2007年全國結(jié)核病耐藥基線調(diào)查，將初治和復(fù)治患者分別分析，認(rèn)為初治患者接受過小于1個(gè)月的治療，以及復(fù)治患者接受多次治療是耐藥的危險(xiǎn)因素[26-27]，說明結(jié)核病經(jīng)過抗結(jié)核藥物治療，尤其是多次治療是耐藥產(chǎn)生的影響因素。

國內(nèi)沿用絕對(duì)濃度法作為診斷和治療參考由來已久，尤其習(xí)慣于絕對(duì)濃度法設(shè)立高低兩個(gè)濃度，可以得到低濃度耐藥和高濃度耐藥結(jié)果，甚至在可選藥物很少的情況下，低濃度耐藥可為繼續(xù)使用該藥物提供某種程度的實(shí)驗(yàn)室“參考”依據(jù)。但需要注意的是，根據(jù)現(xiàn)有的WHO指南，同一種藥物，通過調(diào)整劑量作為某種程度的“新藥”使用的只有異煙肼，而且不是推薦的優(yōu)先選擇。其理論基礎(chǔ)是結(jié)核分枝桿菌不同的異煙肼基因突變導(dǎo)致異煙肼耐藥程度的不同，inhA基因突變可耐受0.2 μg/ml的異煙肼，katG基因突變導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌耐受1 μg/ml的異煙肼[28]。而國內(nèi)的絕對(duì)濃度法測(cè)定的異煙肼濃度分別為1 μg/ml和10 μg/ml，因此國內(nèi)的絕對(duì)濃度法低濃度耐藥難以作為繼續(xù)使用異煙肼的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。另外，近年來，高劑量利福平臨床實(shí)驗(yàn)較多，其目的是在藥物不良反應(yīng)增加不明顯的前提下，將利福平用量從10 mg/kg提高至15 mg/kg甚至20 mg/kg，從而提高初治結(jié)核病患者的治愈率[29-31]。這種方法是將利福平作為一種藥物一種劑量使用，并非依據(jù)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平不同耐藥程度選擇不同劑量。本研究雖然設(shè)定單一濃度界限，但并不反對(duì)從科研角度研究其他濃度界限和不同突變位點(diǎn)的關(guān)系[32]，但如上文1963年針對(duì)結(jié)核病患者異煙肼治療結(jié)果的研究報(bào)道，耐藥程度(實(shí)驗(yàn)室具體表現(xiàn)為MIC)與療效無明顯相關(guān)性[18]。針對(duì)臨床治療而言，確定單一的耐藥界限后，進(jìn)而關(guān)注超過這一界限的結(jié)核分枝桿菌菌株的比率，可能對(duì)治療有更多參考價(jià)值。

耐藥菌的定義包含了耐藥菌的兩個(gè)關(guān)鍵屬性[16,33]，即臨床治療反應(yīng)性下降和明顯不同于接觸過藥物的野生菌株，其發(fā)現(xiàn)過程為在臨床治療中發(fā)現(xiàn)療效下降的菌株，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與未用過藥物菌株的差異，通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)這種差異從而為臨床治療提供參考。提示耐藥菌與敏感菌的臨床療效和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果明顯不同，有必要定期對(duì)治療失敗和未治療的患者菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分析，因?yàn)榻?jīng)過長(zhǎng)期的治療，這種源自臨床的耐藥界限可能存在一定程度的變化；如果結(jié)核病控制比較好，未治療患者的耐藥率可能會(huì)降低，反之則升高，這兩種狀況均會(huì)影響耐藥濃度界限的確定。

此外，雖然本研究的結(jié)果表明培養(yǎng)基藥物濃度界限與比例法測(cè)定相同，但數(shù)據(jù)表明利福平30 μg/ml和40 μg/ml差別很小。Laszlo等[34]在1997年發(fā)表的第1次全球結(jié)核病網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間的質(zhì)量評(píng)價(jià)，曾提出利福平在30 μg/ml和40 μg/ml可能差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用德國標(biāo)準(zhǔn)(DIN)方案的測(cè)試結(jié)果有望證實(shí)這一結(jié)果，其利福平的臨界濃度是32 μg/ml。

有學(xué)者對(duì)耐藥的定義提出了質(zhì)疑，即質(zhì)疑傳統(tǒng)表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果不能完全與臨床治療結(jié)果一致，認(rèn)為將復(fù)雜的臨床療效歸因于細(xì)菌耐藥存在一定局限，忽略了人體藥物代謝和免疫作用的因素[33]。同時(shí)Gumbo[35]根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)提出藥敏試驗(yàn)的臨界濃度應(yīng)進(jìn)一步降低。但就目前研究狀況而言，難以將細(xì)菌抗藥性、藥物代謝、人體免疫狀況等因素進(jìn)行整合后再全面評(píng)價(jià)臨床療效。僅通過細(xì)菌學(xué)方法進(jìn)行的耐藥性檢測(cè)也僅僅可以檢測(cè)細(xì)菌的屬性，故目前當(dāng)務(wù)之急是規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化藥敏試驗(yàn)，以便將來整合其他影響因素來評(píng)價(jià)療效。

二、接種量對(duì)結(jié)果的影響

研究結(jié)果顯示，藥物濃度界限采用比例法但接種量采用絕對(duì)濃度法的細(xì)菌量(菌液質(zhì)量濃度10-2mg/ml，接種0.1 ml，接種量為10-3mg)，其藥敏試驗(yàn)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)比例法的結(jié)果(菌液質(zhì)量濃度10-2mg/ml，接種0.01 ml，接種菌量為10-4mg)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與黎友倫等[8]的研究結(jié)果相同。其原因可能是無論哪一種接種菌量(1 mg濕菌細(xì)菌數(shù)量相當(dāng)于107數(shù)量級(jí),10-3mg、10-4mg的細(xì)菌數(shù)量分別為104、103)，均遠(yuǎn)低于耐藥自然突變率(結(jié)核分枝桿菌的異煙肼、利福平、乙胺丁醇自然突變率為每106、108、105個(gè)細(xì)菌檢出一個(gè)自然耐藥突變)，提示接種量對(duì)兩種接種方法藥敏試驗(yàn)結(jié)果無明顯影響。

三、接種方式的差異

本研究結(jié)果提示，使用接種環(huán)以涂抹方式接種(劃線接種法)的菌落數(shù)明顯多于滴管法，原因可能是使用滴管滴加方式可使一次滴加菌液較多(0.1 ml 或100 μl)，盡管保持培養(yǎng)基斜面水平放置，但由于結(jié)核分枝桿菌表面脂質(zhì)較多，疏水性較強(qiáng)，在菌懸液中結(jié)核分枝桿菌更易聚集而不易分開，導(dǎo)致生成的菌落數(shù)較少；而經(jīng)接種環(huán)取少量菌懸液(10 μl)劃線接種，液體成分較少，經(jīng)接種環(huán)劃線后，結(jié)核分枝桿菌直接與培養(yǎng)基斜面接觸，不易再聚集，故菌落較多。

本研究結(jié)果顯示，雖然滴管接種法菌落均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差[(11.27±11.11)個(gè)]較小，但根據(jù)95%CI絕大多數(shù)滴管法的菌落在9.50～13.05個(gè)之間，而絕大多數(shù)劃線接種法菌落數(shù)在35.08～46.12個(gè)之間；故可認(rèn)為在多數(shù)情況下，針對(duì)同一菌懸液，使用劃線接種較滴管法接種效果好。

綜上，比例法和絕對(duì)濃度法是基于MIC的藥敏試驗(yàn)方法，兩種方法僅在接種方法和判讀方式等方面有所不同，不宜將這兩種方法對(duì)立看待，絕對(duì)濃度法可以看作是在接種量精確定量前提下的比例法。比例法從理論的角度相對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)，絕對(duì)濃度法在操作方面相對(duì)簡(jiǎn)易，只需將目前國內(nèi)《結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》中絕對(duì)濃度法的藥物耐藥界限調(diào)整為與比例法藥物濃度界限一致, 則無論采用哪種方法檢測(cè)耐藥性，其結(jié)果均具有較高的一致性和可比性，有助于解決某些菌株檢測(cè)結(jié)果不一致的問題。此外，使用接種環(huán)以涂抹方式接種菌液，較滴管法能獲得相對(duì)較多的菌落數(shù)，有助于進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。已有學(xué)者對(duì)其他影響因素(如含藥培養(yǎng)基中藥物含量及保存時(shí)間等)進(jìn)行了研究，總體結(jié)論是含藥培養(yǎng)基中藥物處于持續(xù)衰減狀態(tài)，含藥培養(yǎng)基保存不要超過1個(gè)月[36-38]，其結(jié)論與目前國內(nèi)外的相關(guān)指南[3-4]基本一致。關(guān)于測(cè)定其他抗結(jié)核藥物的濃度界限及影響因素還有待進(jìn)一步研究。

志謝 湖北省疾病預(yù)防控制中心傳染病防治研究所李國明及周麗平兩位老師給予了本研究?jī)A力幫助和支持。

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(本文編輯：孟莉 薛愛華)

Analysis on influencing factors ofMycobacteriumtuberculosisdrug susceptibility test by using L?wenstein Jensen medium

JIANGGuang-lu,DAIGuang-ming,HUANGHai-rong.

TuberculosisClinicalLaboratoryofBeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

HUANGHai-rong,Email:huanghairong@tb123.org

Objective To evaluate the drug concentration criteria of drug susceptibility test (DST) ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) to isoniazid, rifampicin, ethambutol by using absolute concentration method based on Lowenstein-Jensen media, and to evaluate the effects on DST results when different inoculums and inoculation me-thods were adopted. Methods According to the methods recommended by World Health Organization (WHO), the MTB strains were isolated from the sputum specimens collected from the TB patient who were likely drug susceptible cases and likely drug resistant cases respectively, and then the minimal inhabitation concentration (MIC) of isoniazid, rifampicin, ethambutol to the two kinds of MTB strains were tested. The cumulative percentage of the two kinds of MTB strains were calculated and the MIC of which the greatest difference of cumulative percentage between the two kinds of MTB strains was regarded as the cut-off value of drug resistance. 10-3mg and 10-4mg MTB were inoculated on the drug contained media with isoniazid, rifampicin and ethambutol respectively and their drug-resis-tance cut-off values were the criteria of proportion method. The drug resistance results were compared after 4 weeks incubation; MTB suspicion were inoculated on Lowenstein-Jensen with loop or pipette respectively (inoculums were both 10-6mg), colony-forming units (CFU) were compared after four weeks incubation. Results The concentration cut-off values of isonazid, rafampicin and ethambutol tested by absolute concentration method were 0.2 μg/ml, 40 μg/ml and 2 μg/ml respectively. The DST results showed no statistically significant difference between the dif-ferent inoculums (10-3mg vs. 10-4mg)(χ2was 0.57, 0.00, 0.00;Pvalue was 0.45, 1.00, 1.00 respectively). The number of CFU inoculated with loop (40.60±34.54, 95%CI=35.08-46.12) was significantly higher than the number of CFU inoculated with pipette (11.27±11.11, 95%CI=9.50-13.05) (t=11.58,P<0.01). Conclusion The drug resistance cut-off values of isonazid, rifampicin and ethambutol tested by the proportion method are more reasonable. There is no obvious difference between the DST results with the inoculums of 10-3mg and 10-4mg. It is better to inoculate with loop than with pipette.

Mycobacteriumtuberculosis; Microbial sensitivity tests; Culture media, serum-free; Diagnostic techniques and methods; Outcome and process assessment (health care); Factor analysis, statistics

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.007

北京市醫(yī)院管理局“登峰”計(jì)劃專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助(DFL20151501)

101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室

黃海榮，Email：huanghairong@tbl23.org

2017-05-13)