結核分枝桿菌三種蛋白在結核病血清學診斷中的評價研究

劉毅 張旭霞 張雨晴 李傳友

?

·論著·

結核分枝桿菌三種蛋白在結核病血清學診斷中的評價研究

劉毅 張旭霞 張雨晴 李傳友

目的 對結核分枝桿菌相對分子質量為38 000(以下采用38 kD表示)、線粒體通透性轉換蛋白64 (mitochondrial permeability transition 64，MPT-64)和肝素結合血凝素(heparin-binding haemagglutinin，HBHA)蛋白在外周血中抗體的表達水平進行檢測和比較，并對它們在結核病血清學方面的診斷價值進行評估。方法 選取2012年7月至2013年10月北京胸科醫(yī)院收治的肺結核患者作為活動性肺結核(ATB)組，共78例；選取同期36例潛伏結核感染(LTBI)患者作為LTBI組；同期在北京胸科醫(yī)院進行體檢的31名健康人群(HC)作為HC組。將本實驗室前期純化的38 kD、MPT64和HBHA作為抗原應用于免疫學的檢測，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測血清中三種蛋白抗體的表達水平，經(jīng)過統(tǒng)計學處理后，分別比較ATB、LTBI和HC三組之間的差異，并結合受試者工作特征曲線計算各蛋白抗原的敏感度和特異度，評價三種蛋白血清抗體的臨床診斷價值。結果 ELISA檢測ATB組38 kD蛋白抗體的吸光度(A)450 nm處的A值(0.343±0.120)高于LTBI組(0.221±0.102)和HC組(0.143±0.097)，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.07，P<0.05)； MPT64抗體的A450值(0.234±0.102)高于LTBI組(0.198±0.087)和HC組(0.123±0.075)，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.79,P<0.05)；HBHA抗體的A450值(0.263±0.113)高于LTBI組(0.188±0.091)和HC組(0.148±0.078)，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.70,P<0.05)。以38 kD、MPT64和HBHA蛋白抗體表達水平從LTBI組鑒別ATB組時的受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)分別為0.78、0.61和0.62，敏感度分別為71.79%、62.82%和52. 56%，特異度為72.22%、58.33%和69.44%；從HC組鑒別ATB組時的AUC分別為0.91、0.81和0.79，敏感度分別為87.17%、69.23%和73.08%，特異度為80.65%、74.19%和74.19%；從HC組鑒別LTBI組AUC分別為0.63、0.75和0.69，敏感度分別為58.33%、77.78%和63.89%，特異度為64.52%、51.61%和74.19%。結論 MTB 38 kD、MPT64和HBHA蛋白都有較好的免疫反應性，3種蛋白抗體在不同患者人群血清中的表達水平有差異，對肺結核診斷價值的評估結果表明采用ELISA對外周血中MTB蛋白抗體進行檢測可作為結核病臨床檢測診斷的輔助方法。

分枝桿菌，結核； 細菌蛋白質類； 酶聯(lián)免疫吸附測定； 抗體； 血清學試驗； 評價研究

結核分枝桿菌(MTB)基因組共編碼約4000多種蛋白[1]，這其中有很多蛋白顯示了較好的免疫原性和應用價值。這些蛋白包括MTB 相對分子質量為38 000(以下采用38 kD表示)蛋白, 線粒體通透性轉換蛋白64 (mitochondrial permeability transition 64, MPT-64)和肝素結合血凝素(heparin-binding Haemagglutinin, HBHA)蛋白等。這三種蛋白可在結核病患者的感染和發(fā)病過程中誘發(fā)免疫反應，對其臨床診斷價值的研究成為人們關注的焦點。

MTB 38 kD蛋白是一種與磷酸鹽轉運有關的脂蛋白，含有特異的B 淋巴細胞和T淋巴細胞抗原決定簇，能誘導早期反應[2]。研究發(fā)現(xiàn)MTB的主要免疫原38 kD蛋白抗原免疫學活性很強，是較理想的血清學快速診斷抗原[3]。MPT64是MTB生長最早分泌的主要蛋白[4]，僅在MTB及牛分枝桿菌中存在，而作為疫苗的BCG中則不表達。MPT64蛋白能刺激T淋巴細胞反應，特異性也較好，可作為血清學診斷試劑[5]。HBHA是MTB分泌的一種黏附素，是一種糖蛋白，能介導肺結核和肺外結核的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，HBHA誘導產(chǎn)生的γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)可作為潛伏結核感染的診斷工具，有很好的敏感度和特異度[6]。

另外，MTB的潛伏感染和持留存在是導致結核病化療療程偏長、療效不佳及化療后易再次復發(fā)的主要原因之一[7],也是近年來肺結核卷土重來的重要原因之一[8]。而且對于潛伏結核感染 (latent tuberculosis infection, LTBI)的診斷存在嚴重不足，如何快速區(qū)分活動性肺結核(active tuberculosis, ATB)和LTBI是一直存在的難題[9]，尋找能夠快速檢測和診斷結核病的方法和手段一直是廣大研究人員努力的方向[10]。

鑒于MPT64、38 kD和HBHA這3種蛋白的功能和自身的免疫原性，本研究通過對78例ATB、36例LTBI和31名健康對照(healthy control, HC)人群中3種蛋白的抗體表達水平的比較，分析在外周血中3種蛋白抗體的表達水平是否存在差異，進而評價3種蛋白對ATB和LTBI的診斷效能，探討這3種蛋白在結核病血清學診斷中的應用價值, 為尋找更精確、更快速的免疫學檢測方法提供線索，同時為研究MTB的持留存在奠定基礎。

材料和方法

一、研究對象

選取2012年7月至2013年10月北京胸科醫(yī)院收治的78例初治活動性肺結核患者作為ATB組；36例LTBI患者作為LTBI組；HC健康體檢者31名作為HC組。所有研究對象均知情同意，經(jīng)過首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會的評審認證。對三組對象的性別進行卡方檢驗，年齡進行方差分析，提示差異均無統(tǒng)計學意義，說明各組在年齡、性別等方面均具有可比性(表1)。

二、 分組標準

ATB組：按照病史、臨床診斷、體征、胸部X線攝影和病原學診斷的結果，初次診斷為活動性肺結核患者，并排除結核性胸膜炎、結核性腦膜炎、體表結核和骨關節(jié)結核等其他部位的結核病。 LTBI組：有結核病患者接觸史，無結核病臨床癥狀，胸部X線攝影等檢查無異常，詢問BCG接種史并查驗卡痕，排除BCG接種；進行PPD皮膚試驗，72 h內硬結的平均直徑≥10 mm，酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT) 檢測陽性，病原學檢查陰性。HC組：無結核病臨床癥狀，胸部X線攝影等檢查無異常，詢問BCG接種史，排除BCG接種；進行PPD皮膚試驗，72 h內硬結的平均直徑<5 mm 或ELISPOT 檢測陰性。所有研究對象均排除HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等病毒感染，排除其他疾病如糖尿病、類風濕性關節(jié)炎、腎炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病。

表1 本研究三組人群的一般資料

三、 試驗試劑與儀器

酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測試劑盒(美國BD公司)，山羊抗人IgG(北京中杉金橋生物公司)，多功能酶標儀(美國BioTek公司)，恒溫搖床(江蘇太倉儀器)，離心機(德國Sigma公司)。

四、蛋白抗原

實驗室前期構建了原核表達載體，在大腸埃希菌中誘導后大量表達蛋白，經(jīng)過純化后分離獲得本研究中所需的蛋白，詳細步驟可參考文獻[11]。

五、ELISA方法檢測血清中的抗體

用蛋白抗原包被ELISA酶標板，用3%牛血清白蛋白/磷酸鹽緩沖液(BSA/PBS)封閉(200 μl/孔)；向包被好的ELISA酶標板加入試劑稀釋液(作為空白對照)、稀釋后血清(100 μl/孔)，37 ℃孵育1 h。向酶標板加入1∶2000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG，37 ℃溫箱孵育1.5 h，用吐溫磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌3次。加入底物試劑底物A(H2O2)+底物B[四甲基聯(lián)苯胺(TMB)](100 μl/孔)，室溫放置，觀察反應的顏色變化，待反應明顯時加入反應終止液(2 mol/L硫酸)。反應終止后30 min內，測吸光度(A)450 nm處的A值。

六、統(tǒng)計學處理

根據(jù)血清抗體濃度A450 nm吸光度值，用GraphPad Prism 5軟件繪散點圖；采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。多組間比較采用非參數(shù)獨立樣本的Kruskal-Wallis單因素ANOVA檢驗，任意兩組獨立變量之間的比較用配對t檢驗的方法, 計量資料采用百分率與構成比表示，組間差異的比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

七、評價診斷效能

為評價3種蛋白分別對ATB和LTBI的診斷效能，而且對LTBI的診斷必須能同時與ATB和HC組鑒別開，因此將鑒別診斷分析設計為3組：從LTBI組鑒別ATB組時以LTBI組為對照，從HC組鑒別LTBI組時以HC組為對照，從HC組鑒別ATB組時以HC組為對照。以SPSS 21.0軟件分別繪制3種蛋白抗原對上述3組人群進行鑒別診斷的受試者工作特征(ROC)曲線，計算曲線下面積(AUC), 用ROC曲線來描述對該蛋白抗原檢測的敏感度和特異度之間的關系，最佳臨界值(cut-off)的選取方法是根據(jù)SPSS提供的曲線上各種可能的cut-off點的敏感度和特異度，計算Youden指數(shù)(靈敏感度+特異度-1)最大時對應的A值則為最佳cut-off值；采用該cut-off值判定實驗組血清和對照組血清中的和陰性和陽性比例，待測標本A值≥該值判為陽性，待測標本A值<該值判為陰性。敏感度=實驗組中的陽性結果數(shù)量/總的樣本數(shù)量×100%；特異度=對照組中的陰性結果數(shù)量/總的樣本數(shù)量×100%。

結 果

一、三組人群血清中38 kD蛋白抗體水平分布

根據(jù)各組血清ELISA檢測結果，在A450 mm處的A值分布做出散點圖(圖1)。圖1顯示：ATB組(A值為0.343±0.120)和LTBI組(A值為0.221±0.102)相比，A值差異有統(tǒng)計學意義(t=3.07,P<0.05)；ATB組(A值為0.343±0.120)和HC組(A值為0.143±0.097)相比，A值差異有統(tǒng)計學意義 (t=2.70,P<0.01)；而在LTBI組(A值為0.221±0.102)和HC組(A值為0.143±0.097)間血清樣本抗體檢測的A值分布相近，差異無統(tǒng)計學意義(t=3.30,P>0.05)。

ATB:活動性肺結核患者組；LTBI:潛伏結核感染組；HC：健康人群組。圖中橫線代表中位數(shù)的水平圖1 血清中相對分子質量38 000蛋白抗體水平檢測分布散點圖

二、三組人群血清中MPT64蛋白抗體水平分布

根據(jù)各組血清ELISA檢測結果，在A450 mm處的A值分布做出散點圖(圖2)。圖2顯示：ATB組(A值為0.234±0.102)和LTBI組(A值為0.198±0.087)相比，A值差異有統(tǒng)計學意義(t=3.79,P<0.05)；ATB組(A值為0.234±0.102)和HC組(A值為0.123±0.075)相比，A值差異有統(tǒng)計學意義(t=3.14，P<0.01)；而在LTBI組(A值為0.198±0.087)和HC組(A值為0.123±0.075)間血清樣本抗體檢測的A值分布不同，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.29，P<0.05)。

ATB:活動性肺結核患者組；LTBI:潛伏結核感染組；HC：健康人群組。圖中橫線代表中位數(shù)的水平圖2 血清中MPT64蛋白抗體水平檢測分布散點圖

三、三組人群血清中HBHA蛋白抗體水平分布

根據(jù)各組血清ELISA檢測結果，在A450 mm處的A值分布做出散點圖(圖3)。圖3顯示：ATB組(A值為0.263±0.113)和LTBI組(A值為0.188±0.091)相比，A值差異有統(tǒng)計學意義(t=2.70,P<0.05)；ATB組(A值為0.263±0.113)和HC組(A值為0.148±0.078)相比，A值差異有統(tǒng)計學意義(t=1.98,P<0.01), 而在LTBI組(A值為0.188±0.091)和HC組(A值為0.148±0.078)間血清樣本抗體檢測的A值分布相近，差異無統(tǒng)計學意義(t=3.69，P>0.05)。

ATB:活動性肺結核患者組；LTBI:潛伏結核感染組；HC：健康人群組。圖中橫線代表中位數(shù)的水平圖3 血清中HBHA蛋白抗體水平檢測分布散點圖

四、各組血清中38 kD、MPT64和HBHA蛋白抗體水平檢測的敏感度、特異度比較

由表2可見， ATB和LTBI 2個組比較，以LTBI組為對照，通過38 kD蛋白抗體濃度檢測，診斷活動性肺結核的敏感度為71.79%，特異度為72.22%；MPT64的敏感度為62.82%，特異度為58.33%；HBHA的敏感度為52.56%，特異度為69.44%；3種蛋白抗體檢測ROC的(AUC)分別為0.78、0.61和0.62。

由表3可見， LTBI組和HC組比較，以HC組為對照，抗原38 kD蛋白抗體濃度檢測LTBI的敏感度為58.33%，特異度為64.52%；MPT64的敏感度為77.78%，特異度為51.61%；HBHA的敏感度為63.89%，特異度為74.19%；3種蛋白抗體檢測的AUC面積分別為0.63、0.75和0.69。

表2 不同蛋白抗原在ATB組和LTBI組中的敏感度和特異度比較

注 AUC：ROC曲線下面積；敏感度(%)=ATB組中的陽性結果數(shù)量/總的樣本數(shù)量×100%, 特異度(%)=LTBI組中的陰性結果數(shù)量/總的樣本數(shù)量×100%

表3 不同蛋白抗原在LTBI組和HC組中的敏感度和特異度比較

注 AUC：ROC曲線下面積；敏感度(%)=LTBI組中的陽性結果數(shù)量/總的樣本數(shù)量×100%, 特異度(%)=HC組中的陰性結果數(shù)量/總的樣本數(shù)量×100%

表4 不同蛋白抗原在ATB組和HC組中的敏感度和特異度比較

注 AUC：ROC曲線下面積；敏感度(%)=ATB組中的陽性結果數(shù)量/總的樣本數(shù)量×100%； 特異度(%)=HC組中的陰性結果數(shù)量/總的樣本數(shù)量×100%

由表4可見，LTBI組和HC組比較，以HC組為對照，抗原38 kD蛋白抗體濃度檢測LTBI的敏感度為87.17%，特異度為80.65%；MPT64的敏感度為69.23%，特異度為74.19%；HBHA的敏感度為73.08%，特異度為74.19%；3種蛋白抗體檢測的AUC面積分別為0.91、0.81和0.79。

討 論

結核病是危害人類健康的重要疾病，MTB可在人體內長期處于持續(xù)感染狀態(tài)，形成潛伏結核感染，這已成為目前在全世界范圍內檢測和消滅結核病的最大阻礙之一。正確快速地檢測結核病，對結核病的控制和治療都具有重要的意義。目前的檢測療法雖有很多種，但是仍然缺乏有效和快速的檢測方法。免疫學檢測方法是臨床實驗室診斷的重要補充，主要包括ELISA方法檢測MTB抗體[12]和ELISPOT方法檢測細胞免疫反應[13]。筆者通過將表達純化的蛋白應用于免疫學檢測，分析ATB、LTBI和HC這3組人群之間血清蛋白抗體表達的差異，尋找可應用于臨床診斷分析的方法和策略。

本研究結果表明38 kD蛋白血清抗體檢測在鑒別ATB和LTBI時具有較好的敏感度和特異度，而HBHA蛋白血清抗體檢測顯示了較好的特異度但敏感度較差，38 kD蛋白顯示了更好的總體診斷效能(AUC=0.78)，只是本研究3種蛋白血清抗體檢測的敏感度和特異度都有待提高。MPT64蛋白血清抗體檢測顯示，在鑒別LTBI和HC組時具有較好的敏感度但特異度較差，而38 kD和HBHA蛋白血清抗體檢測敏感度均偏低(表3)，MPT64蛋白的蛋白血清抗體檢測在區(qū)分LTBI和HC組顯示了較好的總體診斷效能(AUC=0.75)。而在區(qū)分ATB組和HC組的研究中，3種蛋白血清抗體檢測均顯示了較好的診斷效能，尤以38 kD蛋白血清抗體檢測顯示了更好的診斷效能(AUC=0.91)，敏感度和特異度分別達到87.17%和80.65%，MPT64和HBHA蛋白的蛋白血清抗體檢測的敏感度和特異度一般，說明38 kD蛋白的蛋白血清抗體檢測在診斷活動性肺結核上具有較好的臨床診斷和應用價值，這也和研究報道38 kD蛋白抗體在ATB患者血清中高表達的結果相一致[14]?？梢姡m然在外周血中3種蛋白抗體表達水平在ATB和LTBI組比較時差異均有統(tǒng)計學意義，但應用到臨床診斷時的敏感度和特異度卻產(chǎn)生了很大的差異，在區(qū)分LTBI和HC組時也遇到同樣的問題，這說明不能只看總體的表達水平差異是否存在統(tǒng)計學意義，而應該詳細評估它們在不同肺結核感染狀態(tài)下的診斷價值。研究結果也說明，這3種蛋白在結核感染和發(fā)病中具有不同的臨床和診斷價值。

導致敏感度和特異度變化的原因有很多，其中一個原因可能是患者血清中抗體的表達水平不夠高，不足以將ATB和LTBI分開，可能需要再另外補加新的檢測抗原[15]，或者改變檢測方法和檢測對象[16]。已有研究表明將多個蛋白并聯(lián)分析，或者進行抗原的不同組合，會使敏感度和特異度都得到加強[17]；有的研究甚至融合了7種蛋白抗原，結果顯示了很好的敏感度和特異度[18]。未來可以通過將這3種抗原進行組合檢測和并聯(lián)分析，通過不同抗原進行組合分析提高診斷的敏感度和特異度，可以進一步提高蛋白抗原在血清學中的診斷和應用價值。

本研究在收集標本時雖然缺少非結核呼吸系統(tǒng)疾病對照，在實驗設計上有不夠完善之處，未能將非結核呼吸疾病完全排除，但因為該研究中選取的蛋白均為結核分枝桿菌中特異表達的分泌蛋白，只在分枝桿菌屬中表達[19-20]，在其他的細菌或者病毒中均沒有表達或者同源性很低，因此對血清學檢測特異性的影響不會很大，所以本研究仍然具有重要的價值和意義。筆者在后續(xù)的研究中將會增加非結核呼吸系統(tǒng)疾病作為對照，更好地滿足研究的特異性要求。其次，在研究設計之初，BCG接種組被排除，是擔心會影響真正的LTBI組的研究。有研究表明BCG的接種會影響機體的免疫應答狀況[21]，接種后的免疫狀態(tài)可能和LTBI非常相似，這也會對檢測結果造成影響，因此將BCG接種過的健康對照者排除。當然，最好的設計是健康對照中將BCG接種的人群單獨作為一組進行研究，筆者在以后的研究中將會注意這方面的設計和要求，從而更好地體現(xiàn)BCG接種對血清學和免疫學檢測的影響情況。

綜上所述，本研究通過檢測分析3種蛋白的免疫原性和在血清中抗體的表達水平，驗證了3種蛋白對于肺結核的檢測和分析能力，可作為臨床結核病診斷的重要補充，有較好的臨床應用價值。

[1] Deng J, Bi L, Zhou L, et al.Mycobacteriumtuberculosisproteome microarray for global studies of protein function and immunogenicity. Cell Rep, 2014, 9(6):2317-2329.

[2] Wilkinson RJ, Haslov K, Rappuoli R, et al. Evaluation of the recombinant 38-kilodalton antigen ofMycobacteriumtuberculosisas a potential immuno diagnostic reagent. J Clin Microbiol, 1997, 35(3):553-557.

[3] 劉忠華，丁元生，畢愛笑，等.結核分枝桿菌38 kD-16 kD融合蛋白克隆表達及血清學診斷價值. 中國防癆雜志, 2009, 31(10):565-569.

[4] Wang Z, Potter BM, Gray AM, et al. The solution structure of antigen MPT64 fromMycobacteriumtuberculosisdefines a new family of beta-grasp proteins. J Mol Biol, 2007, 366(2):375-381.

[5] Yang H, Liu ZH, Zhang LT, et al. Selection and application of peptide mimotopes of MPT64 protein inMycobacteriumtuberculosis. J Med Microbiol, 2011, 60(Pt 1):69-74.

[6] Sun Z, Nie L, Zhang X, et al. Mycobacterial heparin-binding haemagglutinin adhesion-induced interferon & antibody for detection of tuberculosis. Indian J Med Res, 2011, 133:421-425.

[7] Fox GJ, Dobler CC, Marais BJ, et al. Preventive therapy for latent tuberculosis infection-the promise and the challenges. Int J Infect Dis, 2017, 56:68-76.

[8] Monack DM, Mueller A, Falkow S. Persistent bacterial infections: the interface of the pathogen and the host immune system. Nat Rev Microbiol, 2004, 2(9):747-765.

[9] Sgaragli G, Frosini M. Human Tuberculosis I. Epidemiology, Diagnosis and Pathogenetic Mechanisms. Curr Med Chem, 2016, 23(25):2836-2873.

[10] Zhang X, Su Z, Zhang X, et al. Generation ofMycobacteriumtuberculosis-specific recombinant antigens and evaluation of the clinical value of antibody detection for serological diagnosis of pulmonary tuberculosis. Int J Mol Med, 2013, 31(3):751-757.

[11] 聶理會，任衛(wèi)聰，王敬，等. 重組結核分枝桿菌黏附素、MPT64、38 kD蛋白在結核性胸膜炎中的診斷價值比較. 北京醫(yī)學, 2013, 35(9):760-763.

[12] 趙美芬，劉映霞，彭忠田，等.檢測外周血特異性結核分枝桿菌抗體對活動性結核病的診斷價值研究. 中國防癆雜志, 2014, 36(5)：356-361.

[13] 何秀云，黃香玉，朱傳智，等.PstS1-ESAT-6抗原血清學和γ-干擾素釋放試驗輔助診斷結核病的價值. 中國防癆雜志, 2016, 38(10)：805-812.

[14] Talavera-Paulin M, Garcia-Morales L, Ruiz-Sanchez BP, et al. Active tuberculosis patients have high levels of IgA anti-alpha-crystallin and isocitrate lyase proteins.Int J Tuberc Lung Dis, 2016, 20(12):1681-1688.

[15] Mendes KR, Malone ML, Ndungu JM, et al. High-throughput Identification of DNA-Encoded IgG Ligands that Distinguish Active and LatentMycobacteriumtuberculosisInfections. ACS Chem Biol, 2017,12(1)：234-243.

[16] Suzukawa M, Akashi S, Nagai H, et al. Combined Analysis of IFN-gamma, IL-2, IL-5, IL-10, IL-1RA and MCP-1 in QFT Supernatant Is Useful for Distinguishing Active Tuberculosis from Latent Infection. PLoS One, 2016, 11(4):e0152483.

[17] 林楠，吳小翠，趙平，等.四種結核抗原用于結核病血清學診斷的初步評價. 實用預防醫(yī)學, 2014, 21(6):655-657.

[18] Feng X, Xiu B, Chen K, et al. Enhanced serodiagnostic utility of novelMycobacteriumtuberculosispolyproteins. J Infect， 2013, 66(4):366-375.

[19] Jiang Y, Liu H, Wang H, et al. Polymorphism of antigen MPT64 inMycobacteriumtuberculosisstrains. J Clin Microbiol, 2013, 51(5):1558-1562.

[20] Lanfranconi MP, Alvarez HM. Functional divergence of HBHA fromMycobacteriumtuberculosisand its evolutionary relationship with TadA from Rhodococcus opacus. Biochimie, 2016, 127:241-248.

[21] Shah JA, Musvosvi M, Shey M, et al. A Functional TOLLIP Variant is Associated with BCG-Specific Immune Responses and Tuberculosis.Am J Respir Crit Care Med, 2017.

(本文編輯：王然 李敬文)

The evaluation study of threeMycobacteriumtuberculosisproteins in tuberculosis serologic diagnosis

LIUYi,ZHANGXu-xia,ZHANGYu-qing,LIChuan-you.

DepartmentofBacteriologyandImmunology,BeijingKeyLaboratoryonDrug-ResistantTuberculosisResearch,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute;BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

LIChuan-you,Email:lichuanyou6688@hotmail.com

Objective To compare the antibody expression of three recombinationMycobacteriumtuberculosis(MTB) protein antigens (MTB relative molecular mass 38 000 short as 38 kD, MPT64 and HBHA)in the peripheral blood serum, and comprehensively assess their performances in serologic diagnosis of tuberculosis (TB). Methods Seventy eight active tuberculosis (ATB) cases and 36 latent tuberculosis infection (LTBI) cases were selected from Beijing Chest Hospital as case groups, during July 2012 to October 2013. And 31 healthy control (HC) cases were recruited from the TB physical examination in Beijing Chest Hospital at the same period. We used these purified protein generated by our laboratory as antigens to measure the expression level of antibodies in serum by ELSIA, then compared the difference between ATB, LTBI and HC by statistical method. Sensitivity, specificity and diagnostic efficiency were calculated after getting the receiver operating characteristic (ROC) curve analysis with the results of Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, comprehensive diagnosis performance and application values of these proteins were evaluated. Results The absorbance (A)450 nmvalue of 38 kD measured by ELISA was higher in ATB group (0.343±0.120) than those in LTBI group (0.221±0.102) and HC group (0.143±0.097). The difference showed statistically significance (t=3.07,P<0.05). TheAvalue of MPT64 measured by ELISA was higher in ATB group (0.234±0.102) than those in LTBI group (0.198±0.087) and HC group (0.123±0.075). The difference showed statistically significance (t=3.79,P<0.05). TheAvalue of HBHA measured by ELISA was higher in ATB group (0.263±0.113) than those in LTBI group (0.188±0.091) and HC group (0.148±0.078). The difference showed statistically significance (t=2.70,P<0.05). Areas under the curve (AUC) of 38 KD, MPT64 and HBHA antibodies which used to distinguish ATB and LTBI were 0.78, 0.61 and 0.62; the sensitivity were 71.79%, 62.82% and 52. 56% separately; and the specificity were 72.22%, 58.33% and 69.44% separately. AUC which used to distinguish ATB and HC were 0.91, 0.81 and 0.79; the sensitivity were 87.17%, 69.23% and 73.08% separately; and the specificity were 80.65%, 74.19% and 74.19% separately. AUC which used for distinguish LTBI and HC were 0.63, 0.75 and 0.69; the sensitivity were 58.33%, 77.78% and 63.89% separately; the specificity were 64.52%, 51.61% and 74.19% separately. Conclusion The three proteins possessed good immune-reactivity characteristics, and the expression level of their antibodies showed significantly difference in different patient groups. The assessment of diagnostic efficiency for TB indicated that through detecting antibodies expression levels in peripheral blood of TB patient based on ELISA is an assistant method for diagnosis of TB in clinical laboratory.

Mycobacteriumtuberculosis; Bacterial proteins; Enzyme-linked immunosorbent assay; Antibodies; Serologic tests； Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.006

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(2014-4-2163)；北京市醫(yī)院管理局青苗計劃(QML20161601)

101149 北京市結核病胸部腫瘤研究所 首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院 耐藥結核病重點實驗室細菌免疫室

李傳友，Email：lichuanyou6688@hotmail.com

2017-05-15)