水稻白條紋突變體st13的表型分析及基因定位

孫立亭 林添資 王云龍 牛梅 胡婷婷 劉世家 王益華 萬建民, 2,*

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水稻白條紋突變體的表型分析及基因定位

孫立亭1, 3林添資1, 3王云龍1牛梅1胡婷婷1劉世家1王益華1萬建民1, 2,*

(1南京農(nóng)業(yè)大學作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部長江中下游粳稻生物學與遺傳育種重點實驗室/長江流域雜交水稻協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)中心，南京 210095；2中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京100081；3江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇句容 212400；*通訊聯(lián)系人，E-mail: wanjm@njau.edu.cn, wanjianmin@caas.cn)

【目的】葉色突變相關(guān)基因鑒定和克隆有助于研究光合作用，補充并完善葉綠體發(fā)育機理和色素合成代謝途徑，為開展水稻的高光效育種提供理論依據(jù)?！痉椒ā繌木酒贩NDongjin的組培后代中分離出一個白條紋突變體，成熟期測定野生型和的主要農(nóng)藝性狀，苗期測定色素含量并觀察葉綠體的超微結(jié)構(gòu)；將和Dongjin進行正反交，觀察F1植株表型，并對F2表型分離進行卡方檢驗，對進行遺傳分析；利用×南京11（秈稻品種）的F2和F2:3群體，對突變基因定位；采用qPCR分析葉綠體發(fā)育和葉綠素合成相關(guān)基因在與野生型相對表達量?！窘Y(jié)果】與野生型Dongjin相比，該突變體的株高、單株有效穗數(shù)、穗長、結(jié)實率和千粒重等主要農(nóng)藝性狀顯著下降。苗期的色素含量降低，分蘗期無差異。突變體的葉綠體中既有含豐富的類囊體膜結(jié)構(gòu)的正常葉綠體，也存在無類囊體結(jié)構(gòu)的葉綠體。遺傳分析和基因定位結(jié)果表明，的突變表型受1對隱性核基因控制，突變基因位于第3條染色體長臂InDel（Insertion-Deletion）標記I3-21和I3-22之間。進一步在這兩個標記之間設(shè)計了6對InDel標記，最終將基因定位在94 kb區(qū)間內(nèi)，此區(qū)間共有8個候選基因?！窘Y(jié)論】這8個候選基因中，有5個假定的蛋白，其他三個都是有功能注釋的蛋白，而這三個蛋白在水稻中均未見報道，因此，突變是由一個新的葉色基因突變引起的；同時中葉綠體發(fā)育、葉綠素合成和光合系統(tǒng)相關(guān)基因的表達也發(fā)生了顯著改變，推測可能是調(diào)控葉綠體發(fā)育的關(guān)鍵基因。

水稻；白條紋突變體；葉綠體；精細定位

水稻葉色突變是指葉片顏色發(fā)生變異，可通過直接觀察表型進行區(qū)分。通常葉色變異發(fā)生在苗期或分蘗期之前，易于鑒別、相對容易獲得。由于大多數(shù)葉色突變表現(xiàn)出光合速率下降、作物減產(chǎn)，過去常被認為是無意義的突變。隨著功能基因組學的發(fā)展，眾多研究結(jié)果都顯示葉色突變與植物光合作用[1]、激素生理[2]、光形態(tài)建成[3]等密切相關(guān)，因此，克隆和鑒定葉色突變相關(guān)基因有助于研究光合作用，補充和完善葉綠體發(fā)育機理和色素合成代謝途徑，為開展水稻的高光效育種提供理論基礎(chǔ)。

葉色突變體的發(fā)生機制主要有以下兩類: 一是葉綠素的生物合成及分解代謝途徑受阻。高等植物中葉綠素的生物合成途徑已基本明確[4-6]。葉綠素的合成從谷氨酰-tRNA開始到最終合成葉綠素a和葉綠素b共有15步，分別由15種酶催化，其中任何一步發(fā)生突變，都會導致葉色變異。這15種酶在水稻中克隆報道的有CHLD(鎂離子螯合酶D亞基)、CHLI(鎂離子螯合酶I亞基)[7]、CHLH(鎂離子螯合酶H亞基)[8]、YGL8(鎂離子原卟啉Ⅸ單酯環(huán)化酶)[9]、DVR(脫酯基葉綠素酸酯a乙烯基還原酶)[10]、POR(NADPH-原葉綠素酸酯氧化還原酶)[11]、CHLG (葉綠素合成酶)[12]和CAO(葉綠素a氧化酶)[5,13]。葉綠素的降解過程對葉色的變異也有著重要的影響，NOL和NYC1都編碼短鏈脫氫酶/還原酶，可形成葉綠素b還原酶復合體，行使葉綠素b還原酶的功能，在葉片衰老過程中調(diào)節(jié)葉綠素b和捕光復合體Ⅱ的降解，功能缺失后表現(xiàn)出滯綠表型[14]。二是葉綠體發(fā)育途徑受阻。編碼質(zhì)體RNA聚合酶(PEP)的一個必需的非核心亞基，PEP是成熟葉綠體中一種主要的RNA聚合酶，通過與PEP復合體亞基互作調(diào)控葉綠體發(fā)育；編碼Val-tRNA合成酶，調(diào)控葉綠體中核糖體的合成。和在早期葉綠體的發(fā)育中發(fā)揮重要的作用[15-16]。葉綠體的發(fā)育受核基因、葉綠體基因、光照和器官特異性的共同調(diào)節(jié)[17-18]，例如編碼光系統(tǒng)Ⅱ和Ⅰ蛋白復合物的和基因家族、、，影響葉綠體內(nèi)光系統(tǒng)的形成[19-20]；編碼轉(zhuǎn)運RNA 聚合酶的族的、和。此類基因缺失后，植株色素合成量降低[21]；編碼NADH脫氫酶的基因家族中的和，參與光合作用的等，這些基因調(diào)控葉綠體內(nèi)的能量代謝[22-23]。目前已分離和鑒定的葉色突變體超過180個，其中成功克隆的達80多個，但水稻葉色變化過程和調(diào)控機制并未闡明，因此需要挖掘、鑒定新的葉色突變相關(guān)基因。本研究對白條紋突變體進行了主要農(nóng)藝性狀、色素含量和葉綠體超微結(jié)構(gòu)等表型分析，同時利用×南京11(秈稻品種)的F2和F2:3群體進行定位，將基因定位在第3條染色體長臂87.4 cM和91.1 cM之間，兩者相距3.7 cM。進一步設(shè)計InDel標記，最終將基因定位在94 kb區(qū)間內(nèi)，共有8個候選基因，為基因的克隆和功能研究及育種應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與田間試驗

是從粳稻品種Dongjin的組培后代中分離出的一個白條紋突變體。野生型和突變體正季種植于南京農(nóng)業(yè)大學牌樓實驗基地，在苗期和分蘗期進行表型觀察和色素含量測定。成熟期調(diào)查突變體和野生型的株高、單株有效穗數(shù)、劍葉長、穗長、結(jié)實率和千粒重等主要農(nóng)藝性狀。每個樣品重復5次。

1.2 色素含量測定

取苗期(3葉期)完全展開葉，參照Wu等[12]測定葉片單位鮮質(zhì)量的葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)和類胡蘿卜素(Car)的含量。

1.3 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

取3葉期的野生型和突變體相同部位葉片，去掉中間葉脈，固定于2.5%的戊二醛溶液中(2.5%的戊二醛用0.1 mol/L磷酸緩沖液配制，pH 7.2)，4 h后沖洗，再在1%鋨酸中固定4 h，之后用乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、100%)梯度脫水，最后用環(huán)氧樹脂SPURR包埋、聚合、修塊，經(jīng)醋酸鈾染色后在日立JEM-1230透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.4 水稻總RNA的提取及實時熒光定量PCR

選取3葉期野生型和突變體相同部位葉片提取總RNA。RNA的提取采用天根公司的植物RNA小量提取試劑盒，提取步驟詳見說明書。反轉(zhuǎn)錄步驟參照TaKaRa公司的說明書，基因為內(nèi)參。實時PCR 20 μL反應體系如下: 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，10 μmol/L的正、反向引物各0.4 μL，SYBRGreen混合物(TaKaRa)10 μL，最后補水至20 μL。反應在7500實時PCR儀(Applied Biosystems)上進行，反應程序參照操作手冊，按2–ΔΔCt方法分析基因的相對表達量[24]，每個樣本重復3次。

A－3葉期幼苗；B－A圖中的第2片真葉；C－分蘗期植株。

Fig. 1. Phenotype of the wild-type and mutantat the seedling and tillering stages.

1.5 遺傳分析及定位群體構(gòu)建

用突變體和野生型Dongjin進行正反交，同年冬季在海南陵水加代獲得F2，第二年正季在南京農(nóng)業(yè)大學牌樓實驗基地種植，苗期統(tǒng)計F2群體中正常表型和白條紋表型單株數(shù)，計算分離比，并進行χ2測驗。

用與南京11雜交，獲得Fl種子，自交獲得F2種子，將F2種子種植于南京農(nóng)業(yè)大學牌樓基地，苗期鑒定植株白條紋分離比例，并選取白條紋表型的單株進行基因初定位。同時部分F2種子在海南陵水基地繁種。正季播種 F2:3群體種子，苗期分株系選取白條紋植株，進行基因的精細定位。

1.6 基因定位

基因組DNA提取采用SDS法[25]，用實驗室均勻分布于水稻12條染色體上的InDel標記(Insertion-Deletion)(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)對和南京11進行多態(tài)性分析，采用篩得的有多態(tài)的引物對/南京11的F2中235份白條紋單株和F2:3中2000個白條紋單株進行連鎖分析和基因定位。PCR擴增體系參照Shi等[26]，擴增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，銀染顯色。將具有的帶型記作“1”，具有南京11的帶型記作“2”，雜合帶型記作“3”，計算遺傳距離，構(gòu)建分子標記連鎖圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的表型分析

是從粳稻品種Dongjin的組培后代中分離出的一個白條紋突變體(圖1)。與野生型相比，突變體在3葉期表現(xiàn)出白條紋癥狀(圖1-A、B)，分蘗期轉(zhuǎn)綠，但株高比野生型降低(圖1-C)。主要農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果表明，突變體的株高、穗長、有效穗、結(jié)實率和千粒重與Dongjin相比均顯著下降(表1)，這表明該基因?qū)χ仓晟L發(fā)育十分重要。

2.2 野生型Dongjin和突變體的色素含量測定

為了確定突變體的白條紋表型是否由色素含量變化引起，我們分別測定了Dongjin和在苗期和分蘗期的色素含量。結(jié)果表明，苗期突變體的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量均比野生型Dongjin顯著降低(圖2-A)；當幼苗生長至分蘗期時，的葉片轉(zhuǎn)綠(圖1-C)，此時其葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量與野生型無顯著差異(圖2-B)。這表明的突變癥狀是由色素含量變化引起的。

表1 野生型Dongjin與突變體st13的主要農(nóng)藝性狀比較

**表示經(jīng)測驗后，野生型與突變體在0.01水平下差異顯著。

**Difference between the wild type and themutant was significant at 0.01 level by Student’s-test.

平均值±標準差, n=3。**P<0.01,*P<0.05 (t測驗)。

Fig. 2. Pigment contents of Dongjin andat the seedling and tillering stages.

A, D－野生型的葉綠體超微結(jié)構(gòu); B, C, E, F－突變體st13中同時含有具正常結(jié)構(gòu)的葉綠體(B, E)和具不正常結(jié)構(gòu)的葉綠體(C, F)。 A, B, C圖標尺為10 μm，D, E圖標尺為1 μm，F(xiàn)圖標尺為1 μm。Cp－葉綠體; Thy－類囊體; OB－嗜鋨體。

Fig. 3. Transmission electron microscopy (TEM) analysis of Dongjin andleaves at the seedling stage.

2.3 葉綠體的超微結(jié)構(gòu)觀察

為進一步探究葉片白條紋形成的原因，我們利用透射電鏡觀察了Dongjin和苗期葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，突變體中，少數(shù)細胞中的葉綠體與野生型無顯著差異(圖3-A、B)，但大部分葉肉細胞觀察不到葉綠體(圖3-C)，表現(xiàn)出空泡狀結(jié)構(gòu)，而突變體的葉綠體結(jié)構(gòu)也觀察到兩種類型(圖3-E、F)，一種含有豐富的類囊體片層結(jié)構(gòu)，與野生型相比無明顯差異(圖3-D、E)，另一種葉綠體細胞中無類囊體片層結(jié)構(gòu)(圖3-F); 這一結(jié)果與白條紋突變性狀(白綠相間)一致。

平均值±標準差, n=3。**P<0.01(t測驗)。

Fig. 4. Quantitative RT-PCR analyses of genes associated with chloroplast development and photosynthetic system in wild-type Dongjin andmutant at the seedling stage.

平均值±標準差, n=3。**P<0.01(t測驗)。

Fig. 5. Quantitative RT-PCR analyses of genes associated with chlorophyll biogenesis in wild-type Dongjin andmutant at the seedling stage.

2.4 突變體中葉綠體發(fā)育及光合系統(tǒng)相關(guān)基因的表達分析

葉綠體是植物進行光合作用的場所，為明確的白條紋癥狀是否影響葉綠體發(fā)育及光合系統(tǒng)相關(guān)基因的表達，我們進行了qRT-PCR分析(圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體中，編碼轉(zhuǎn)運RNA聚合酶的族基因和的表達顯著上調(diào)；編碼1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的基因表達下調(diào)；同時編碼NADH脫氫酶的基因家族和均顯著下調(diào)，而編碼光系統(tǒng)Ⅱ和Ⅰ蛋白復合物的、和表達量下調(diào)。這表明白條紋這一突變性狀影響了葉綠體發(fā)育，同時抑制了光合系統(tǒng)相關(guān)基因的表達，這與透射電鏡觀察結(jié)果一致。

表2 野生型Dongjin與st13突變體正反交組合的F2分離比

2.5 突變體中葉綠素合成相關(guān)基因的表達分析

為探究葉綠體發(fā)育缺陷是否影響葉綠素合成，我們分析了葉綠素合成相關(guān)基因的表達(圖5)。與野生型相比，葉綠素合成途徑中的(編碼谷氨酸-tRNA還原酶)、(編碼谷氨酸-1-半縮醛氨基轉(zhuǎn)移酶)、(編碼原脫氨酶)、(編碼尿卟啉原Ⅲ脫羧酶)、(編碼糞卟啉Ⅲ氧化酶)、(編碼螯合酶I亞基)、(編碼鎂離子原卟啉Ⅸ甲基轉(zhuǎn)移酶)、(NADPH-原葉綠素酸酯氧化還原酶)、(編碼葉綠素合成酶)和(編碼葉綠素a氧化酶)表達量均顯著上調(diào)。這表明突變體的葉綠素合成受到影響。

A－基因位點初定位到第3條染色體長臂的InDel標記I3-21和I3-22之間；B－基因位點精細定位到標記P3-14和S-24之間；C－定位區(qū)間位于BAC克隆OJ1519_A12、OSJNBa0004G03和OSJNBa0091E13之間94 kb的物理區(qū)間。

Fig. 6. Fine mapping of.

2.6 遺傳分析

為了確定突變性狀的遺傳特性，我們配制了野生型和突變體的正反交雜交組合，無論突變體用作母本還是父本，相應的F1植株葉片顏色均表現(xiàn)為正常綠色，其自交后代F2群體表型出現(xiàn)明顯分離，且正常綠色與突變體植株數(shù)比值符合3∶1(表2)。這說明該性狀是由一對隱性核基因控制的。

表3 目標區(qū)域內(nèi)有多態(tài)的InDel標記

表4 94 kb區(qū)間內(nèi)的預測基因及其可能的功能

2.7 突變性狀的基因定位及候選基因

將突變體與秈稻品種南京11進行雜交，挑取其F2群體分離出的白條紋單株235株及F2:3群體分離的白條紋單株2000株作為定位群體，利用本實驗室均勻分布在12條染色體上的InDel標記將基因初定位在第3染色體長臂的I3-21標記(87.4 cM)與I3-22標記(91.1 cM)之間(圖6-A)。為進行精細定位，利用Primer premier 5.0軟件，開發(fā)出兩親本之間有多態(tài)的引物6對(表3)，最終將基因定位在標記P3-14與標記S-24之間，位于BAC OSJNBa0004G03和OSJNBa0091E13上，兩者相距94 kb(圖6-B、C)。利用水稻表達譜數(shù)據(jù)庫(http:// ricexpro.dna.affrc.go.jp/index.html)預測此區(qū)間內(nèi)含有8個開放閱讀框(ORF)，其功能預測見表4。

3 討論

葉綠體的發(fā)育是在細胞核和細胞質(zhì)基因的協(xié)同調(diào)控下完成的，這個過程分為3個步驟: 第一步是葉原基分化為分生組織，激活質(zhì)體復制和質(zhì)體DNA的合成；第二步是葉綠體遺傳系統(tǒng)建立，分生細胞增大，葉綠體翻譯和轉(zhuǎn)錄活性大大增加；第三步是葉綠體分化形成，開始轉(zhuǎn)錄光合作用元件[27]。光反應相關(guān)蛋白對葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能的完整起著重要的作用，和編碼PSⅠ合成相關(guān)亞基，編碼PSⅡ核心復合物[28-29]，突變體中，這三個基因的表達下調(diào)。光系統(tǒng)復合物形成過程中，類囊體也在形成，突變體的葉綠體細胞中存在大量無類囊體的空泡狀結(jié)構(gòu)，類囊體膜無法正常形成，葉綠體的分化階段受到影響，葉綠體發(fā)育不良。編碼轉(zhuǎn)運RNA聚合酶的族基因功能缺失后，植株色素含量減少，質(zhì)體內(nèi)膜系統(tǒng)發(fā)育不完整[21]，而突變體中，表達量與野生型比無顯著差異，和表達量上升，可能tRNA編碼產(chǎn)物大量積累，導致tRNA聚合酶消耗量減少，其編碼基因表達上調(diào)。突變體中，，和均顯著下調(diào)，從而導致葉綠體內(nèi)能量代謝失衡。突變體的葉綠體發(fā)育受損，導致色素含量降低。突變體中編碼Mg-原卟啉Ⅸ螯合酶的Ⅰ亞基的基因發(fā)生突變，導致出現(xiàn)淺黃綠葉的表型[7]，在突變體中，此基因表達上調(diào)，同時突變體中編碼葉綠素a加氧酶的基因[13]在突變體中表達上調(diào)，其他葉綠素生物合成途徑中的基因、、、、、、和表達上調(diào)，推測可能是調(diào)控葉綠體發(fā)育的關(guān)鍵基因。

水稻中已克隆14個白條紋或白化基因，有的表現(xiàn)出白化致死，如[30]、[31]、[32]、[16]、[33]，有的屬于溫度依賴型，如[6]、、[34]、[35]、[15]等，有的表現(xiàn)出白化轉(zhuǎn)綠，如[36]等。本研究中，突變體在苗期表現(xiàn)為葉片白條紋，分蘗期轉(zhuǎn)綠，與以往報道的水稻白化轉(zhuǎn)綠突變體相比具有相似的表型，但該突變體主要農(nóng)藝性狀如株高、單株有效穗數(shù)、穗長、千粒重和結(jié)實率都顯著降低，說明基因具有一因多效。通過對×南京11(秈稻品種)的F2和F2:3群體進行定位，最終將基因定位在第3條染色體長臂94 kb區(qū)間內(nèi)，此區(qū)間內(nèi)預測到8個候選基因，突變體可能是由一個新的葉色基因突變引起的。在該區(qū)間內(nèi)，有5個假定的蛋白，其他三個都是有功能注釋的蛋白。Os03g0604200編碼尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶，在擬南芥中，此酶催化細胞壁中UDP-葡萄糖不可逆的氧化為UDP-葡萄醛酸[37]，在水稻中此基因未見報道。Os03g0603700基因編碼A22A肽酶，在植物中報道較少。Os03g0603600編碼甘油磷酸二酯酶，在哺乳動物中涉及信號轉(zhuǎn)導、神經(jīng)分化及發(fā)育和細胞骨架調(diào)控等[38]，植物中未見報道。因此，需要進一步研究開展測序、表達分析及轉(zhuǎn)基因互補等研究以確定的候選基因，為闡明基因的功能奠定基礎(chǔ)。

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Phenotypic Analysis and Gene Mapping of a White Stripe Mutantin Rice

SUN Liting1,3, LIN Tianzi1,3, WANG Yunlong1, NIU Mei1, HU Tingting1, LIU Shijia1, WANG Yihua1, WAN Jianmin1,2,*

(1State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University/Key Laboratory of Biology, Genetics and Breeding of japonica Rice in Mid-lower Yangtze River, Ministry of Agriculture/The Yangtze River Valley Hybrid Rice Collaboration Innovation Center/Jiangsu Collaboration Innovation Center for Modern Crop Production, Nanjing 210095, China;2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3Zhenjiang Agricultural Research Institute, Jurong 212400, China;*Corresponding author, E-mail:wanjm@njau.edu.cn, wanjianmin@caas.cn)

【Objective】Rice leaf color mutation identification and cloning of related genes is helpful to research photosynthesis and further understand the mechanism of chloroplast development and pigment synthesis pathway, providing theoretical basis for the breeding of rice with high photosynthetic efficiency.【Method】A somaclonal mutant (designated as,) was isolated from tissue-cultured progenies of arice variety Dongjin. The main agronomic traits of wild type andwere determined at maturity, and the pigment contents and ultrastructure of chloroplast were observed at the seedling stage. Dongjin andwere reciprocally crossed to observe the phenotype of F1and genetic analysis was carried out. An F2population and F2:3population derived from the cross× Nanjing11 (anrice variety) were used for gene mapping of. Quantitative RT-PCR was carried out to analyze the relative expression of genes associated with chloroplast development and chlorophyll biogenesis in the wild-type Dongjin andmutant. 【Result】Compared to the wild type, the plant height, number of effective panicles, panicle length, seed-setting rate, and 1000-grain weight were all significantly reduced in the mutant. In agreement with leaf color, the pigment content ofmutant was reduced at the seedling stage but rose to almost the same level as the wild type at the tillering stage. With a transmission electron microscopy, defective chloroplasts with no thylakoid were observed in themutant. Genetic analysis indicated the mutant phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene.was restricted to an interval between the InDel (insertion/deletion) markers I3-21 and I3-22 on chromosome 3. Six InDel markers were further developed and thegene was narrowed down to a 94-kb region, containing eight putative open reading frames. 【Conclusion】These eight candidate genes encode three putative proteins and five functional proteins respectively, while none of them have been reported in rice. Thus,was an unreported gene in rice. Relative to wild type, the expression levels of genes associated with chloroplast development, chlorophyll biosynthesis, and photosynthetic system were significantly altered in the mutant. So we hypothesized thatmight be the key gene for regulating chloroplast development.

rice; white stripe mutant; chloroplast; fine mapping

10.16819/j.1001-7216.2017.6165

Q343.5; S511.01

A

1001-7216(2017)04-0355-09

2016-12-20；

國家重點研發(fā)項目七大農(nóng)作物育種專項(2016YFD0100101-08); 國家863計劃資助項目(2014AA10A603-15); 江蘇省科技支撐計劃資助項目(BE2014394, BE2015363); 江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金資助課題[CX(16)1029]。

修改稿收到日期：2017-02-07。