基于Plackett-Burman設計和響應面法優(yōu)化羊肝抗氧化肽的制備工藝

母應春，蘇偉，文飛，李靜雯，宋玉，齊琦，楊旭卉

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

基于Plackett-Burman設計和響應面法優(yōu)化羊肝抗氧化肽的制備工藝

母應春1，蘇偉1，文飛1，李靜雯1，宋玉1，齊琦2，楊旭卉1

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

以羊肝為原料，分別測定5種蛋白酶酶切羊肝所得的酶解液的羥基自由基清除率和肽得率。結果表明，風味蛋白酶羥自由基清除率（84.50%）和肽得率（22.49%）最好。在單因素試驗基礎上，以羥基自由基清除率為評價指標，采用響應面法優(yōu)化最佳酶解條件。結果表明，羊肝抗氧化肽制備的最佳酶解條件為料液比1∶3（g∶mL）、加酶量2 400 U/g、酶解溫度50℃、pH7.50、酶解時間2.8 h。在此優(yōu)化條件下，測得實際羥自由基清除率為93.70%，與模型理論值相接近。羊肝酶解產物中總氨基酸含量為57.23 g/100 g，其中疏水性氨基酸和必需氨基酸占總氨基酸含量分別為46.47%和41.63%，表明以風味蛋白酶酶解羊肝產物具有較高的抗氧化活性和營養(yǎng)價值。

羊肝；Plackett-Burman設計；響應面法；氨基酸；抗氧化肽

隨著人工合成抗氧化劑的使用，如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）和丁基羥基茴香醚（butyl hydroxy anisd，BHA），對機體雖能起到一定的抗氧化作用，但研究表明，人工合成抗氧化劑具有毒副作用[1]，因此利用酶解技術從動物內臟中制備安全、高效的天然抗氧化劑成為了研究熱點。酶解法制備肽因其反應時間短、反應條件溫和可控、水解效率高等優(yōu)點，廣泛應用于多肽的制備。

我國每年對羊肉的需求量達數百萬噸，隨著對羊肉需求量和羊肉加工企業(yè)的增多，羊肉加工過程不可避免的產生大量副產物，這些副產物常被加工成飼料或丟棄，不僅產品附加值低，而且污染環(huán)境。因此如何對羊肝進行深加工，提高其附加值是亟待解決的問題。羊肝為羊肉加工過程副產物之一。據報道羊肝中除含蛋白質外，還含有鐵、磷、鈣、尼克酸及維生素A等營養(yǎng)元素[2-3]。目前，對羊肉加工副產物已有相關研究，劉旺旺等[4]利用微生物發(fā)酵法研究了羊胎盤多肽的工藝；YANG H等[5]以羊骨膠原蛋白為原料，通過酶解得到了免疫活性肽；韓志慧等[2]以羊肝為原料，研究了羊肝羹的工藝；李黎等[3]以羊肝為原料，研究了明目羊肝口服液的關鍵工藝。而有關羊肝的酶解及抗氧化肽的制備方面的報道鮮見。

為提高羊肉加工過程中羊肝副產物資源利用率，本研究以羊肝為原料，采用風味蛋白酶酶解，在單因素試驗的基礎上，以羥自由基清除率為評價指標，進行Plackett-Burman主因素篩選試驗，再結合響應面法優(yōu)化制備羊肝抗氧化肽的酶解工藝，并測定酶解液中氨基酸的組成，以期為羊肝的深加工及提高羊肝資源加工利用率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肝（蛋白質含量為17.61%）：貴州晴隆縣海權清真肉羊食品加工有限責任公司提供；牛血清蛋白：上海索寶萊生物有限公司；風味蛋白酶（4萬U/g）、中性蛋白酶（40萬U/g）、堿性蛋白酶（40萬U/g）、木瓜蛋白酶（80萬U/g）、胰蛋白酶（4萬U/g）：廣西南寧龐博生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SpectraMax-190酶標儀：美國Molecular Devices公司；LGJ-10D冷凍干燥機：北京四環(huán)科學有限公司；TDL-20M臺式高速冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀表有限公司；KDN-08系列凱氏定氮儀：浙江托普科學儀器有限公司；PHS-06型酸度計：上海歐宇儀器有限公司；L-8900氨基酸分析儀：日本日立有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 羊肝肽粉的制備

1.3.2 酶解蛋白酶種類篩選

選擇風味蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對羊肝分別進行單酶酶解，并根據表1中的條件進行水解，根據5種酶對羊肝蛋白質水解物的·OH清除率和肽得率的影響確定適用的蛋白酶種類。5種蛋白酶酶解條件見表1。

表15 種蛋白酶酶解條件Table 1 Enzymolysis condition of 5 kinds of proteases

1.3.3 單因素試驗

研究pH值（6.0、7.0、7.5、8.0、9.0）、酶解溫度（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）、加酶量（800 U/g、1 600 U/g、2 400 U/g、3 200 U/g、4 000 U/g、4 800 U/g）、料液比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL））、酶解時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）對羊肝抗氧化肽制備工藝的影響。

1.3.4 Plackett-Burman試驗設計

Plackett-Burman設計因其能快速有效地從眾多因素中篩選出主因素而廣泛應用于因素的篩選試驗[6]。在單因素試驗基礎上，以·OH清除率為風味蛋白酶酶解制備羊肝抗氧化肽的響應值，對5個因素進行主效應因子的篩選，每個因素有高（+1）和低（-1）兩個水平，共12組試驗。試驗因素及水平見表2。

表2 Plackett-Burman試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.5 響應面試驗設計

選取酶解溫度（A）、pH（B）、酶解時間（C）為自變量，以·OH清除率為響應值，結合Box-Behnken中心組合試驗設計原理，進行3因素3水平響應面試驗。因素與水平編碼見表3。

表3 羊肝抗氧化肽制備的最佳酶解條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 3 Factors and levels of response surface experiments for hydrolytic conditions optimization of sheep liver antioxidant peptides preparation

1.3.6 測定方法

羊肝酶解產物肽得率測定：參照李亞嫻等[7-8]的方法，采用三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）+雙縮脲法測定酶解液中多肽含量。肽得率計算公式如下：

式中：V為羊肝酶解液離心后體積，mL；dil為羊肝酶解液稀釋倍數；m為羊肝原料取樣質量，g；A為酶解液多肽質量濃度，mg/mL；M為原料中蛋白含量，g。

羥自由基清除率測定：參照李桂峰等[9]的方法進行，羥自由基（·OH）清除率計算公式如下：

羊肝酶解液中氨基酸含量測定：參考文獻[10]的方法略微修改，稱取羊肝酶解液0.2mL于水解管中，加入6 mol/L HCl溶液5mL，充氮氣后，擰緊密封，110℃烘箱中水解24h，待放冷后，用蒸餾水無損轉移水解液至容量瓶中1/3處，加4.8 mL的NaOH溶液進行中和，用6 mol/L HCl調節(jié)pH值至2～3，再用蒸餾水定容至100 mL容量瓶，取適量濃度的水解液過0.45 μm濾膜至進樣瓶約1 mL，采用全自動氨基酸分析儀上樣測定。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

不同的蛋白酶由于作用位點及所結合的底物特性不同，對同一種底物所產生的酶解效果不同。5種蛋白酶對羊肝進行酶解，結果如圖1所示。

圖1 單酶酶解產物對·OH清除率和肽得率的影響Fig.1 Effect of enzymolysis products by single enzyme on·OH scavenging rate and peptide yield

由圖1可知，5種蛋白酶清除羥自由基能力和肽得率的大小依次為風味蛋白酶＞堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶。風味蛋白酶對羥基自由基的清除率為84.50%，肽得率為22.49%。因此，選擇風味蛋白酶進行后續(xù)試驗研究。

2.2 單因素試驗

2.2.1 酶解溫度對·OH清除率和肽得率的影響

圖2 酶解溫度對·OH清除率和肽得率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on·OH scavenging rate and peptide yield

由圖2可知，隨著溫度的上升，·OH清除率和肽得率均呈不斷升高趨勢，當溫度為50℃時，兩者均達到最大值，為91.85%和21.12%，此后兩者均開始下降。這是由于酶解溫度超過了該蛋白酶最適酶解溫度，致使酶結構發(fā)生變性，從而酶活力降低，清除率和肽得率從而開始下降。因此選擇酶解溫度為50℃。

2.2.2 酶解時間對·OH清除率和肽得率的影響

圖3 酶解時間對·OH清除率和肽得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on·OH scavenging rate and peptide yield

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，羊肝酶解液對·OH清除能力和肽得率不斷升高，酶解3 h后，·OH清除率和肽得率開始下降，并逐漸趨于平緩態(tài)勢?？赡苁怯捎谠诜磻捌冢富盍^高，蛋白酶與底物充分接觸，此后隨著酶解時間的延長，底物質量濃度減少，酶與底物的結合位點隨之減少，已被降解成活性的多肽進一步被降解成無活性的氨基酸而使得反應趨于緩慢，并達到一定動態(tài)平衡，同時酶的活力也有所降低[11-12]。因此酶解時間選擇3 h為宜。

2.2.3 pH值對·OH清除率和肽得率的影響

圖4pH值對·OH清除率和肽得率的影響Fig.4 Effect of pH on·OH scavenging rate and peptide yield

由圖4可知，在pH值為6.0～7.5時，羊肝酶解液對·OH的清除能力和肽得率隨pH的增大不斷升高；當pH值為7.5時，兩者達到最大值，為90.45%和20.87%，此后兩者開始下降，這可能是由于pH增大不適于風味蛋白酶的最佳pH作用條件，影響了酶活性部位有關基團的解離，從而反應速率下降[12]。因此pH值選擇7.5為宜。

2.2.4 加酶量對·OH清除率和肽得率的影響

圖5 加酶量對·OH清除率和肽得率的影響Fig.5 Effect of enzyme addition on·OH scavenging rate and peptide yield

由圖5可知，在加酶量為800～2 400 U/g范圍時，羊肝酶解液對·OH的清除率和肽得率隨著加酶量的增加不斷升高；當加酶量為2 400 U/g時，·OH清除率和肽得率達到最大值，為91.49%和19.01%，此后清除率變化趨于平緩，肽得率逐漸降低。這是由于在底物質量濃度一定條件下，酶添加量的增加有助于酶與底物充分結合，促使反應速率加快，當加酶量過多時，由于底物蛋白結合位點逐漸被占據，中間復合物也達到飽和狀態(tài)[13-14]，清除率趨于平緩，而肽得率降低可能是由于加酶量過多，使得具有活性的多肽進一步水解成無活性的氨基酸所致。因此，選擇加酶量為2 400 U/g為宜。

2.2.5 料液比對·OH清除率和肽得率的影響

圖6 料液比對·OH清除率和肽得率的影響Fig.6 Effect of material-liquid ratio on·OH scavenging rate and peptide yield

由圖6可知，料液比在1∶3、1∶4（g∶mL）時，羊肝酶解液對·OH的清除率和肽得率變化相差不大，并且料液比過大，會增加抗氧化肽制備后期的濃縮及水電成本。因此選擇料液比為1∶3進行后續(xù)試驗。

2.3 Plackett-Burman試驗關鍵因素篩選分析

在單因素試驗基礎上，以·OH清除率為主要評價指標，對料液比、pH、酶解溫度、酶解時間和加酶量進行Plackett-Burman因素篩選試驗設計及主效應分析，結果見表4、表5。

表4 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 4 Design and results Plackett-Burman experiments

表5 Plackett-Burman試驗設計回歸分析結果Table 5 Design and results of Plackett-Burman experiments

由表5可知，羊肝酶解產物清除羥自由基能力的因素影響大小依次為B（pH）＞D（酶解時間）＞C（酶解溫度）＞E（加酶量）＞A（料液比），其中pH對羊肝酶解產物清除羥自由基能力的影響達極顯著（P=0.000 5＜0.01），而酶解溫度和酶解時間對響應值的影響為顯著水平（P＜0.05），因此選擇pH、酶解溫度和酶解時間這3個顯著因素進行下一步響應面試驗設計及結果分析。對于E（加酶量）和A（料液比）等非顯著性因素，在后續(xù)試驗中均選取單因素試驗中的最優(yōu)水平，即加酶量2 400 U/g，料液比為1∶3（g∶mL）。

2.4 風味蛋白酶酶解羊肝的響應面試驗及結果

2.4.1 響應面試驗設計及結果分析

在單因素結果和Plackett-Burman因素篩選試驗基礎上，選取酶解溫度、pH和酶解時間為自變量，以·OH清除率為主要響應值，進行3因素3水平響應面試驗設計，結果見表6，方差顯著性分析見表7。

利用Design-Expert V 8.0.6軟件對表6數據進行回歸分析，得到以羥自由基清除率（Y）為響應值的二次多項式回歸方程為：

表6 Box-Behnken試驗設計與結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

由表7可知，回歸模型的P值＜0.000 1，說明模型達極顯著水平，模型的復相關系數R2=0.988 1，說明試驗值與擬合值之間具有高度相關性，調整決定系數R2Adj=0.972 8，說明該模型能解釋97.28%羊肝風味蛋白酶酶解產物以羥自由基清除率為響應值的變化。失擬項P值=0.5692＞0.05，說明差異不顯著，表明模型的方程對數據擬合的較好，能較好的反映各自變量與響應值之間的關系。因此，利用該回歸方程能較好的對試驗結果進行擬合和預測分析。

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

模型的一次項C、交互項AC以及二次項A2、B2和C2差異均為極顯著（P＜0.01），一次項A差異顯著（P＜0.05）。由表7中各因素的P值可知，3個因素對羥自由基清除率影響大小依次為酶解時間＞酶解溫度＞pH。

2.4.2 各因素之間交互作用的響應面直觀圖分析

在方差分析結果基礎上，利用Design-Expert V 8.0.6軟件對酶解溫度、pH和酶解時間進行交互作用分析，結果如圖7所示。響應面圖可以直觀地表示出因素交互作用對響應值的影響，而等高線的形狀可以反映出交互作用的強弱大小，圓形表示兩交互作用不顯著，橢圓形表示兩者交互作用顯著[15-16]。

圖7 酶解溫度、pH、酶解時間交互作用對羊肝酶解產物·OH清除率的影響的響應面與等高線Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between enzymolysis temperature,pH and time on the·OH scavenging rate of sheep liver enzymolysis products

由圖7可知，酶解溫度和pH、pH和酶解時間的等高線形狀近似圓形，說明酶解溫度和pH、pH和酶解時間之間的交互作用不顯著。

利用Design-ExpertV8.0.6軟件對羊肝酶解制備抗氧化肽工藝進行優(yōu)化預測，得到最佳制備工藝條件為料液比1∶3（g∶mL）、加酶量2 400 U/g、酶解溫度49.8℃、pH7.51、酶解時間2.78 h，在此酶解工藝條件下，羥自由基清除率的預測值為93.76%。

2.4.3 最佳工藝條件的驗證

為了進一步驗證模型預測的最佳工藝條件的準確性，同時考慮實際操作條件，將酶解工藝條件修正為料液比1∶3（g∶mL）、加酶量2 400 U/g、酶解溫度50℃、pH7.50、酶解時間2.8 h。在上述最佳工藝條件下，進行3次驗證試驗，得到羥自由基清除率為93.86%、93.91%、93.32%，平均清除率為93.70%，與模型理論值相接近。說明利用該模型能較好的預測羊肝抗氧化肽制備的工藝過程。

2.5 氨基酸組成分析

氨基酸的組成在一定程度上影響酶解物的生物活性。由表8可知，羊肝風味蛋白酶酶解液中含有甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和異亮氨酸等疏水性氨基酸[17]和必需氨基酸，占總氨基酸含量分別為46.47%和41.63%。研究表明，疏水性氨基酸在脂相中具有良好的溶解性，從而保證了酶解物具有較強的抗氧化活性[17]。此外，酶解液中還含有對某些二價過渡金屬離子（Fe2+、Cu2+）具有較強螯合金屬能力的組氨酸（His）和酸性氨基酸（Asp、Glu），能有效抑制羥自由基的生成，從而達到抗氧化的功效[1，18]，其占總氨基酸含量的29.89%。羊肝酶解液中疏水性氨基酸和較強金屬螯合能力氨基酸的存在，為其具有較強抗氧化活性提供了可能。

表8 羊肝酶解液氨基酸結果分析Table 8 Result analysis of amino acid of sheep liver enzymatic hydrolysis solution g/100 g

3 結論

在羥自由基清除率和肽得率為評價指標的蛋白酶篩選試驗下，得到酶解羊肝的最佳蛋白酶為風味蛋白酶。在單因素基礎上，對酶解溫度、酶解時間、pH、加酶量和料液比5個因素進行Plackett-Burman因素篩選試驗分析，得到對羥自由基清除率影響顯著的三個主效應因素：酶解溫度、pH、酶解時間。通過分析，得到羊肝抗氧化肽的最佳酶解條件為料液比1∶3（g∶mL）、加酶量2 400 U/g、酶解溫度50℃、pH 7.50、酶解時間2.8 h。在此最佳條件下，得到羊肝酶解產物清除羥自由基的清除率為93.70%。氨基酸結果表明，羊肝酶解液含有疏水性氨基酸和較強螯合金屬離子能力的組氨酸（His）和酸性氨基酸（Asp，Glu），占總氨基酸含量分別為46.47%和29.89%。試驗研究表明，該抗氧化肽制備工藝條件可行，以風味蛋白酶酶解羊肝產物具有較強的抗氧化活性，對羊肝的資源利用及開發(fā)提供了新的思路，也為羊肝的深加工提供了理論依據。

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Optimization of preparation technology of antioxidant peptides from sheep liver by Plackett-Burman design and response surface methodology

MU Yingchun1,SU Wei1,WEN Fei1,LI Jingwen1,SONG Yu1,QI Qi2,YANG Xuhui1
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.College of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Using the sheep liver as raw material,the hydroxyl free radical scavenging rate and peptide yield of enzymatic hydrolysis solution was obtained from sheep liver,the activity of five protease were determined.The enzyme screening results showed that hydroxyl free radical scavenging rate(84.50%)and peptide yield(22.49%)ofenzymatic hydrolysissolution byflavor protease were the optimal.On the basisofsingle factor experiments, with hydroxyl free radical scavenging rate as evaluation index,the optimum enzymolysis conditions were optimized by response surface method.The results showed that the optimum hydrolytic conditions of sheep liver antioxidant peptides preparation were material-liquid ratio 1∶3(g∶ml),enzyme addition 2 400 U/g,enzymolysis temperature 50℃,pH 7.50 and enzymolysis time 2.8 h.Under the conditions,the actual hydroxyl free radical scavenging rate was 93.70%,which was close to the model theoretical value.The total amino acid content in the sheep liver enzymolysis products was 57.23 g/100 g,in which the contents of hydrophobic amino acid and essential amino acid were 46.47%and 41.63%,respectively.It indicated that sheep liver enzymolysis products by flavor protease had high antioxidant activity and nutritional value.

sheep liver;Plackett-Burman design;response surface methodology;amino acid;antioxidant peptides

TS251.95

0254-5071（2017）07-0161-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.035

2017-03-30

黔西南州科技計劃重點項目（2016-1-117）；貴州大學研究生創(chuàng)新基金項目（研理工2016057）

母應春（1974-），女，副教授，碩士，研究方向為食品生物技術。