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    番茄環(huán)紋斑點病毒TZSV實時熒光定量PCR檢測方法的建立

    2017-07-29 16:52徐弢鄭雪張曉林陳永對穆野陳勇
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年7期
    關(guān)鍵詞:檢測方法

    徐弢+鄭雪+張曉林+陳永對+穆野+陳勇+鄭寬瑜+趙立華+劉小燭+張潔

    摘要:本研究根據(jù)番茄環(huán)紋斑點病毒(Tomato zonate spot virus, TZSV)保守N基因(GenBank登錄號: 13YV639)設(shè)計一對特異性引物,通過優(yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)體系,構(gòu)建了TZSV的SYBR Green RT-qPCR檢測方法。該方法穩(wěn)定可靠,組內(nèi)和組間的變異系數(shù)都小于2%;標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和相關(guān)系數(shù)分別為-3.39和0.996,擴(kuò)增效率為97.44%;最低能檢測到1.07×104 copies/μL的陽性質(zhì)粒,靈敏度為常規(guī)PCR的1 000倍。同時利用構(gòu)建的RT-qPCR方法檢測TSWV、TNSaV、PCSV和TZSV四種病毒,只有TZSV有特異擴(kuò)增曲線,表明該方法特異性良好。本研究構(gòu)建的RT-qPCR方法能夠為TZSV的早期預(yù)警與動態(tài)監(jiān)測提供可靠的技術(shù)支撐。

    關(guān)鍵詞:番茄環(huán)紋斑點病毒;實時熒光定量 PCR;檢測方法

    中圖分類號:S41-30:Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識號:A 文章編號:1001-4942(2017)07-0139-06

    Abstract The real-time PCR specific primers were designed according to the coat protein N gene sequence (GenBank accession number 13YV639) of Tomato zonate spot virus (TZSV). By optimizing the reaction conditions and reaction system, the SYBR Green real-time PCR method was established to detect the TZSV. This method was stable and reliable, and the CV between and among groups were both less than 2%. The slope and correlation coefficient of the standard curve were -3.39 and 0.996 respectively, and the amplification efficiency was 97.44%. The positive plasmid of 1.07×104 copies/μL could be detected, and the sensitivity was 1 000 times of conventional PCR. When TSWV, TNSaV, PCSV and TZSV were detected by the method, only TZSV had a specific amplification curve, which indicated that the method was specific. This research would provide technical supports for the early warning and dynamic monitoring of TZSV.

    Keywords Tomato zonate spot virus; Real-time fluorescence quantitative PCR; Detection method

    番茄環(huán)紋斑點病毒(Tomato zonate spot virus, TZSV)屬于布尼亞科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)。2008年,TZSV首次在云南辣椒上發(fā)現(xiàn)[1],隨后在鳶尾上也有報道[2]。該病毒是RNA病毒,其基因組由三條RNA鏈組成:ssRNA-L、ssRNA-M和ssRNA-S。其中,ssRNA-L是反向負(fù)義鏈,編碼依賴RNA的RNA酶;ssRNA-M編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSm;ssRNA-S編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSs。感染TZSV后的植物,新葉上首先出現(xiàn)黃色同心環(huán)紋或環(huán)形帶狀褪綠斑點,之后由黃斑轉(zhuǎn)變?yōu)榭莅?,葉片出現(xiàn)黃化、凋零,造成整葉或半葉呈紅褐色壞死;受病植株還會出現(xiàn)矮化、頂芽萎蔫下垂、葉片皺縮退綠等癥狀,嚴(yán)重者在幾周內(nèi)就會死亡從而導(dǎo)致絕收[1,3],對云南地區(qū)的辣椒、番茄、煙草等經(jīng)濟(jì)作物造成嚴(yán)重?fù)p失[1,3-5]。目前,TZSV只在我國云南紅河、文山、石林等地有報道,是云南地區(qū)的優(yōu)勢種[1,4],還未擴(kuò)散至其他省市地區(qū),因此對TZSV的預(yù)防尤為重要。

    TZSV主要是由薊馬傳播。本課題組前期調(diào)查發(fā)現(xiàn),發(fā)病區(qū)西花薊馬(Franiklinella ocicdentalis)是優(yōu)勢種群,此外還發(fā)現(xiàn)有棕櫚薊馬(T. palmi)、梳缺花薊馬(F. shculetzi )[4,6],推測這三種薊馬均能傳播該病毒。目前對于TZSV病害尚無有效的防治手段,建立TZSV的早期診斷技術(shù),加強對TZSV的預(yù)警與監(jiān)測,在早期能及時發(fā)現(xiàn)并及早采取有效控制措施,對延緩病情的蔓延具有重要意義。目前,酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)和常規(guī)PCR技術(shù)是病毒病的主要檢測手段。但這兩種檢測技術(shù)都存在不足:前者檢測靈敏度低,特異性差;后者不能對病毒準(zhǔn)確定量分析。實時熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)技術(shù)既能準(zhǔn)確快速檢測病毒,還可對病毒進(jìn)行定量分析[7,8]。與TaqMan RT-qPCR相比,基于SYBR Green Ⅰ的RT-qPCR測定具有成本低、易于設(shè)計、更靈敏和產(chǎn)生線性圖等優(yōu)點[9]。迄今為止還沒有將基于N基因的SYBR Green RT-qPCR技術(shù)用于TZSV分子診斷的報道。本研究針對TZSV的N基因設(shè)計用于RT-qPCR檢測的引物,構(gòu)建了TZSV RT-qPCR檢測方法,擬為TZSV的流行檢測提供技術(shù)手段。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    辣椒為遵辣1號,種子由貴州省遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供,栽培于玻璃溫室中,培養(yǎng)條件:溫度24~26℃,濕度60%,光周期16 h。辣椒褪綠斑病毒(Pepper chlorotic spot virus, PCSV) 、番茄壞死斑點相關(guān)病毒(Tomato necrotic spot-associated virus, TNSaV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)和番茄環(huán)紋斑點病毒(Tomato zonate spot virus, TZSV)由本實驗室保存。

    Tripure Isolation Reagent RNA提取液和FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)試劑盒購自Roche(德國)(以下簡稱MIX);RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Trans)、質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Trans)、dNTP和Taq酶均購自TaKaRa(日本);超微量紫外可見分光光度計(Thermo Nandrop 2000)購自美國。

    1.2 病毒接種

    將保存于-80℃冰箱的TZSV、PCSV、TSWV和TNSaV接種于幼嫩的辣椒葉片上。步驟如下:采集發(fā)病葉,加入接種緩沖液研磨直至汁液溢出,用棉簽蘸取少量病樣汁液,在灑了少許金剛砂的待接種辣椒葉面上摩擦2~3次,15~20 min后用清水沖洗葉片。

    1.3 引物設(shè)計與合成

    根據(jù)GenBank中登錄的TZSV N基因序列(登錄號:13YV639),設(shè)計TZSV N基因的特異性引物TZSV-Q-3F:5′-ATGAGGAGAACAAGGCTAA-3′、TZSV-Q-3R:5′-GAATGTCAGTCTGTAGCA-3′,并送Invitrogen公司合成。RT-PCR及實時熒光定量PCR均可采用此引物。

    1.4 病毒RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

    稱取約0.1 g感染TZSV的辣椒葉片,根據(jù)TriPure Isolation Reagent提取液說明書提取植物總RNA,溶于30 μL RNase-free Water中。用超微量紫外可見分光光度計檢測其在260、280 nm處的吸光度,評估RNA質(zhì)量。將質(zhì)量合格的RNA于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Trans)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.5 目的基因擴(kuò)增

    利用設(shè)計的引物,以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴(kuò)增TZSV N基因。

    PCR體系:5 μL cDNA,2 μL引物(濃度10 μmol/L,反向和正向各1 μL),36.5 μL水,1 μL dNTP(2.5 mmol/L),0.5 μL Taq酶(5 U/μL)和5 μL 10×PCR Buffer(Mg2+ Plus)。

    PCR擴(kuò)增條件:94℃ 預(yù)變性4 min;94℃ 30 s,62℃ 15 s,72℃ 15 s,30個循環(huán);72℃延伸5 min。

    PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,紫外凝膠成像系統(tǒng)(Genegenius,美國)拍照觀察,并將目的片段膠回收測序。

    1.6 實時熒光定量PCR方法的建立

    1.6.1 TZSV病毒質(zhì)粒的制備 將膠回收后的產(chǎn)物用pMD18-T載體連接轉(zhuǎn)入大腸桿菌,37℃培養(yǎng)12 h,提取質(zhì)粒DNA。利用超微量紫外可見分光光度計(Thermo Nandrop 2000)檢測質(zhì)粒濃度(OD260/OD280和OD260/OD230),并計算拷貝數(shù)。再將質(zhì)粒梯度稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4和10-5,以此作為TZSV陽性檢測標(biāo)準(zhǔn)品。

    1.6.2 熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件 以TZSV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA為模板,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系為:1 μL模板、上下游引物各1 μL(濃度為10 μmol/L)、10 μL MIX和8 μL RNase-free Water。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 min;95℃ 15 s,60℃ 60 s,40個循環(huán);熔解曲線條件為:95℃ 15 s,60℃ 60 s,95℃ 15 s。

    1.6.3 重復(fù)性試驗 以4組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA(濃度梯度10-2、10-3、10-4和10-5)為模板,同一濃度做3次重復(fù),分析組內(nèi)差異;以4組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA(濃度梯度10-2、10-3、10-4和10-5)為模板重復(fù)3次獨立試驗,分析不同批次試驗之間的重復(fù)性。

    1.6.4 靈敏度試驗 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA稀釋9個濃度梯度(10-2~10-10),用實時熒光定量PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增,以檢測實時熒光定量PCR的靈敏度。

    1.6.5 特異性試驗 將含有TSWV、TNSaV、PCSV、TZSV病毒的辣椒葉片各稱取0.1 g,分別提取總RNA后,采用上述構(gòu)建的RT-qPCR技術(shù)檢測,以驗證所構(gòu)建的RT-qPCR方法的特異性。

    1.6.6 實時熒光定量PCR的初步運用 分別用DOT-ELISA、RT-PCR 和RT-qPCR檢測實驗室摩擦接毒辣椒樣品,比較三種方法的差異,以檢驗構(gòu)建的RT-qPCR方法的實用性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 目的基因獲得及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA的制備

    利用特異引物擴(kuò)增TZSV的N基因片段(圖1),膠回收后連接到pMD18-T質(zhì)粒上,轉(zhuǎn)入大腸桿菌后測序。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對,一致性為98%,序列全長164 bp。

    提取大腸桿菌中的質(zhì)粒DNA,用超微量紫外可見分光光度計(Thermo Nandrop 2000)檢測質(zhì)粒濃度及質(zhì)量(表1),濃度為163.4 ng/μL,純度符合RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求。根據(jù)公式計算出標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)為1.07×1012 copies/μL。

    2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA(1.07×1011 ~1.07×107 copies/μL)為模板進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增,得到RT-qPCR的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Y= -3.39X+23.10(R2=0.996)。計算可得擴(kuò)增效率為97.44%,且標(biāo)準(zhǔn)曲線中Ct值和質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖2、3)。

    2.3 重復(fù)性試驗

    以1.07×1010 ~1.07×107 copies/μL 4個稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA進(jìn)行實時熒光定量PCR,同一個試驗中,每個稀釋度重復(fù)3次,組內(nèi)3次結(jié)果(表2)表明,4組不同稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA Ct值的變異系數(shù)為0.20%~0.48%;再以同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行3次獨立的重復(fù)試驗,結(jié)果(表3)表明,組間變異系數(shù)小于2%。組內(nèi)組間變異系數(shù)均在可變范圍內(nèi),說明該方法穩(wěn)定可靠。

    2.4 靈敏度試驗

    分別用RT-qPCR與常規(guī)PCR檢測稀釋不同倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(1.07×1010 ~1.07×102 copies/μL),發(fā)現(xiàn)常規(guī)PCR檢測范圍為1.07×1010 ~1.07×107 copies/μL (圖4),而RT-qPCR在1.07×104 copies/μL仍能得到良好的擴(kuò)增曲線(圖5),說明RT-qPCR的靈敏度比常規(guī)PCR高103倍左右。

    2.5 特異性試驗

    為驗證本方法的特異性,利用RT-qPCR分別檢測辣椒中的TSWV、TNSaV、PCSV和TZSV。結(jié)果表明,TSWV、TNSaV和PCSV都未出現(xiàn)良好的擴(kuò)增曲線,只有TZSV出現(xiàn)良好的擴(kuò)增曲線(圖6),表明本研究所構(gòu)建的檢測方法具有良好的特異性。

    2.6 熒光定量PCR的初步運用

    分別用DOT-ELISA、RT-PCR 和RT-qPCR檢測實驗室摩擦接毒辣椒樣品,結(jié)果表明,檢測的6份樣品中,DOT-ELISA和RT-PCR檢測出2個陽性樣品,而RT-qPCR檢測出4個樣品呈陽性(表4),說明RT-qPCR靈敏度高于DOT-ELISA和RT-PCR。

    3 討論與結(jié)論

    隨著社會科技的發(fā)展,病毒檢測手段也越來越多,如血清免疫學(xué)和生物學(xué)技術(shù)。血清學(xué)包括Immuno Strip和ELISA法;生物學(xué)技術(shù)主要利用特異性引物或者簡并性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增[10,11],之后再利用分子克隆技術(shù)進(jìn)行測序、序列比對分析。鄭寬瑜等[12]通過構(gòu)建TZSV NSs血清,應(yīng)用ELISA法檢測植物中的TZSV。血清學(xué)雖能快速檢測病毒,但這種方法缺點明顯。張等[13]發(fā)現(xiàn), INSV感染的文心蘭(Oncidium luridum)樣品ELISA檢測結(jié)果為陰性,但RT-PCR檢測結(jié)果為陽性,表明植物中INSV分布不均勻,應(yīng)用ELISA 檢測會造成誤差,ELISA 法不能準(zhǔn)確檢測低濃度的INSV。

    實時熒光定量PCR是近年來比較流行的檢測手段,由于其靈敏度高、特異性強的特點越來越受到關(guān)注,已廣泛運用于醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、海關(guān)檢疫等領(lǐng)域,如甘薯退綠矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)[14]、小反芻獸疫病毒(Pestedes petits ruminants virus,PPRV)[15]、禽腦脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus,AEV)的檢測[16]。實時熒光定量PCR包括探針類和染料類兩種,探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加;染料類如SYBR Green Ⅰ則是利用與雙鏈DNA小溝結(jié)合發(fā)光的理化特征指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。前者由于增加了探針的識別步驟,特異性更高,但后者操作簡便易行,成本較低。

    實時熒光定量PCR與常規(guī)PCR相比具有許多優(yōu)點。首先,實時熒光定量PCR使用新的溫度控制機制,顯著減少擴(kuò)增時間。其次,常規(guī)PCR擴(kuò)增后電泳和染色步驟耗時、污染環(huán)境,對人體有害。第三,實時熒光定量PCR方法數(shù)據(jù)分析快速且具有良好的再現(xiàn)性,可以同時進(jìn)行96個樣品的數(shù)據(jù)分析,高效快速。本試驗根據(jù)TZSV N基因的保守區(qū)設(shè)計特異性引物,構(gòu)建了TZSV N基因的實時熒光定量PCR檢測方法。該方法的靈敏度、重復(fù)性、特異性良好,能用于檢測實驗室接毒辣椒樣品。該檢測方法的構(gòu)建將為早期TZSV的傳播、蔓延提供可靠的預(yù)測預(yù)報手段。

    參 考 文 獻(xiàn):

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