• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    番茄環(huán)紋斑點病毒TZSV實時熒光定量PCR檢測方法的建立

    2017-07-29 16:52徐弢鄭雪張曉林陳永對穆野陳勇
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年7期
    關(guān)鍵詞:檢測方法

    徐弢+鄭雪+張曉林+陳永對+穆野+陳勇+鄭寬瑜+趙立華+劉小燭+張潔

    摘要:本研究根據(jù)番茄環(huán)紋斑點病毒(Tomato zonate spot virus, TZSV)保守N基因(GenBank登錄號: 13YV639)設(shè)計一對特異性引物,通過優(yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)體系,構(gòu)建了TZSV的SYBR Green RT-qPCR檢測方法。該方法穩(wěn)定可靠,組內(nèi)和組間的變異系數(shù)都小于2%;標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和相關(guān)系數(shù)分別為-3.39和0.996,擴(kuò)增效率為97.44%;最低能檢測到1.07×104 copies/μL的陽性質(zhì)粒,靈敏度為常規(guī)PCR的1 000倍。同時利用構(gòu)建的RT-qPCR方法檢測TSWV、TNSaV、PCSV和TZSV四種病毒,只有TZSV有特異擴(kuò)增曲線,表明該方法特異性良好。本研究構(gòu)建的RT-qPCR方法能夠為TZSV的早期預(yù)警與動態(tài)監(jiān)測提供可靠的技術(shù)支撐。

    關(guān)鍵詞:番茄環(huán)紋斑點病毒;實時熒光定量 PCR;檢測方法

    中圖分類號:S41-30:Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識號:A 文章編號:1001-4942(2017)07-0139-06

    Abstract The real-time PCR specific primers were designed according to the coat protein N gene sequence (GenBank accession number 13YV639) of Tomato zonate spot virus (TZSV). By optimizing the reaction conditions and reaction system, the SYBR Green real-time PCR method was established to detect the TZSV. This method was stable and reliable, and the CV between and among groups were both less than 2%. The slope and correlation coefficient of the standard curve were -3.39 and 0.996 respectively, and the amplification efficiency was 97.44%. The positive plasmid of 1.07×104 copies/μL could be detected, and the sensitivity was 1 000 times of conventional PCR. When TSWV, TNSaV, PCSV and TZSV were detected by the method, only TZSV had a specific amplification curve, which indicated that the method was specific. This research would provide technical supports for the early warning and dynamic monitoring of TZSV.

    Keywords Tomato zonate spot virus; Real-time fluorescence quantitative PCR; Detection method

    番茄環(huán)紋斑點病毒(Tomato zonate spot virus, TZSV)屬于布尼亞科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)。2008年,TZSV首次在云南辣椒上發(fā)現(xiàn)[1],隨后在鳶尾上也有報道[2]。該病毒是RNA病毒,其基因組由三條RNA鏈組成:ssRNA-L、ssRNA-M和ssRNA-S。其中,ssRNA-L是反向負(fù)義鏈,編碼依賴RNA的RNA酶;ssRNA-M編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSm;ssRNA-S編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSs。感染TZSV后的植物,新葉上首先出現(xiàn)黃色同心環(huán)紋或環(huán)形帶狀褪綠斑點,之后由黃斑轉(zhuǎn)變?yōu)榭莅?,葉片出現(xiàn)黃化、凋零,造成整葉或半葉呈紅褐色壞死;受病植株還會出現(xiàn)矮化、頂芽萎蔫下垂、葉片皺縮退綠等癥狀,嚴(yán)重者在幾周內(nèi)就會死亡從而導(dǎo)致絕收[1,3],對云南地區(qū)的辣椒、番茄、煙草等經(jīng)濟(jì)作物造成嚴(yán)重?fù)p失[1,3-5]。目前,TZSV只在我國云南紅河、文山、石林等地有報道,是云南地區(qū)的優(yōu)勢種[1,4],還未擴(kuò)散至其他省市地區(qū),因此對TZSV的預(yù)防尤為重要。

    TZSV主要是由薊馬傳播。本課題組前期調(diào)查發(fā)現(xiàn),發(fā)病區(qū)西花薊馬(Franiklinella ocicdentalis)是優(yōu)勢種群,此外還發(fā)現(xiàn)有棕櫚薊馬(T. palmi)、梳缺花薊馬(F. shculetzi )[4,6],推測這三種薊馬均能傳播該病毒。目前對于TZSV病害尚無有效的防治手段,建立TZSV的早期診斷技術(shù),加強對TZSV的預(yù)警與監(jiān)測,在早期能及時發(fā)現(xiàn)并及早采取有效控制措施,對延緩病情的蔓延具有重要意義。目前,酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)和常規(guī)PCR技術(shù)是病毒病的主要檢測手段。但這兩種檢測技術(shù)都存在不足:前者檢測靈敏度低,特異性差;后者不能對病毒準(zhǔn)確定量分析。實時熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)技術(shù)既能準(zhǔn)確快速檢測病毒,還可對病毒進(jìn)行定量分析[7,8]。與TaqMan RT-qPCR相比,基于SYBR Green Ⅰ的RT-qPCR測定具有成本低、易于設(shè)計、更靈敏和產(chǎn)生線性圖等優(yōu)點[9]。迄今為止還沒有將基于N基因的SYBR Green RT-qPCR技術(shù)用于TZSV分子診斷的報道。本研究針對TZSV的N基因設(shè)計用于RT-qPCR檢測的引物,構(gòu)建了TZSV RT-qPCR檢測方法,擬為TZSV的流行檢測提供技術(shù)手段。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    辣椒為遵辣1號,種子由貴州省遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供,栽培于玻璃溫室中,培養(yǎng)條件:溫度24~26℃,濕度60%,光周期16 h。辣椒褪綠斑病毒(Pepper chlorotic spot virus, PCSV) 、番茄壞死斑點相關(guān)病毒(Tomato necrotic spot-associated virus, TNSaV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)和番茄環(huán)紋斑點病毒(Tomato zonate spot virus, TZSV)由本實驗室保存。

    Tripure Isolation Reagent RNA提取液和FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)試劑盒購自Roche(德國)(以下簡稱MIX);RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Trans)、質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Trans)、dNTP和Taq酶均購自TaKaRa(日本);超微量紫外可見分光光度計(Thermo Nandrop 2000)購自美國。

    1.2 病毒接種

    將保存于-80℃冰箱的TZSV、PCSV、TSWV和TNSaV接種于幼嫩的辣椒葉片上。步驟如下:采集發(fā)病葉,加入接種緩沖液研磨直至汁液溢出,用棉簽蘸取少量病樣汁液,在灑了少許金剛砂的待接種辣椒葉面上摩擦2~3次,15~20 min后用清水沖洗葉片。

    1.3 引物設(shè)計與合成

    根據(jù)GenBank中登錄的TZSV N基因序列(登錄號:13YV639),設(shè)計TZSV N基因的特異性引物TZSV-Q-3F:5′-ATGAGGAGAACAAGGCTAA-3′、TZSV-Q-3R:5′-GAATGTCAGTCTGTAGCA-3′,并送Invitrogen公司合成。RT-PCR及實時熒光定量PCR均可采用此引物。

    1.4 病毒RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

    稱取約0.1 g感染TZSV的辣椒葉片,根據(jù)TriPure Isolation Reagent提取液說明書提取植物總RNA,溶于30 μL RNase-free Water中。用超微量紫外可見分光光度計檢測其在260、280 nm處的吸光度,評估RNA質(zhì)量。將質(zhì)量合格的RNA于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Trans)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.5 目的基因擴(kuò)增

    利用設(shè)計的引物,以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴(kuò)增TZSV N基因。

    PCR體系:5 μL cDNA,2 μL引物(濃度10 μmol/L,反向和正向各1 μL),36.5 μL水,1 μL dNTP(2.5 mmol/L),0.5 μL Taq酶(5 U/μL)和5 μL 10×PCR Buffer(Mg2+ Plus)。

    PCR擴(kuò)增條件:94℃ 預(yù)變性4 min;94℃ 30 s,62℃ 15 s,72℃ 15 s,30個循環(huán);72℃延伸5 min。

    PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,紫外凝膠成像系統(tǒng)(Genegenius,美國)拍照觀察,并將目的片段膠回收測序。

    1.6 實時熒光定量PCR方法的建立

    1.6.1 TZSV病毒質(zhì)粒的制備 將膠回收后的產(chǎn)物用pMD18-T載體連接轉(zhuǎn)入大腸桿菌,37℃培養(yǎng)12 h,提取質(zhì)粒DNA。利用超微量紫外可見分光光度計(Thermo Nandrop 2000)檢測質(zhì)粒濃度(OD260/OD280和OD260/OD230),并計算拷貝數(shù)。再將質(zhì)粒梯度稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4和10-5,以此作為TZSV陽性檢測標(biāo)準(zhǔn)品。

    1.6.2 熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件 以TZSV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA為模板,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系為:1 μL模板、上下游引物各1 μL(濃度為10 μmol/L)、10 μL MIX和8 μL RNase-free Water。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 min;95℃ 15 s,60℃ 60 s,40個循環(huán);熔解曲線條件為:95℃ 15 s,60℃ 60 s,95℃ 15 s。

    1.6.3 重復(fù)性試驗 以4組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA(濃度梯度10-2、10-3、10-4和10-5)為模板,同一濃度做3次重復(fù),分析組內(nèi)差異;以4組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA(濃度梯度10-2、10-3、10-4和10-5)為模板重復(fù)3次獨立試驗,分析不同批次試驗之間的重復(fù)性。

    1.6.4 靈敏度試驗 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA稀釋9個濃度梯度(10-2~10-10),用實時熒光定量PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增,以檢測實時熒光定量PCR的靈敏度。

    1.6.5 特異性試驗 將含有TSWV、TNSaV、PCSV、TZSV病毒的辣椒葉片各稱取0.1 g,分別提取總RNA后,采用上述構(gòu)建的RT-qPCR技術(shù)檢測,以驗證所構(gòu)建的RT-qPCR方法的特異性。

    1.6.6 實時熒光定量PCR的初步運用 分別用DOT-ELISA、RT-PCR 和RT-qPCR檢測實驗室摩擦接毒辣椒樣品,比較三種方法的差異,以檢驗構(gòu)建的RT-qPCR方法的實用性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 目的基因獲得及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA的制備

    利用特異引物擴(kuò)增TZSV的N基因片段(圖1),膠回收后連接到pMD18-T質(zhì)粒上,轉(zhuǎn)入大腸桿菌后測序。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對,一致性為98%,序列全長164 bp。

    提取大腸桿菌中的質(zhì)粒DNA,用超微量紫外可見分光光度計(Thermo Nandrop 2000)檢測質(zhì)粒濃度及質(zhì)量(表1),濃度為163.4 ng/μL,純度符合RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求。根據(jù)公式計算出標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)為1.07×1012 copies/μL。

    2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA(1.07×1011 ~1.07×107 copies/μL)為模板進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增,得到RT-qPCR的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Y= -3.39X+23.10(R2=0.996)。計算可得擴(kuò)增效率為97.44%,且標(biāo)準(zhǔn)曲線中Ct值和質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖2、3)。

    2.3 重復(fù)性試驗

    以1.07×1010 ~1.07×107 copies/μL 4個稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA進(jìn)行實時熒光定量PCR,同一個試驗中,每個稀釋度重復(fù)3次,組內(nèi)3次結(jié)果(表2)表明,4組不同稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA Ct值的變異系數(shù)為0.20%~0.48%;再以同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行3次獨立的重復(fù)試驗,結(jié)果(表3)表明,組間變異系數(shù)小于2%。組內(nèi)組間變異系數(shù)均在可變范圍內(nèi),說明該方法穩(wěn)定可靠。

    2.4 靈敏度試驗

    分別用RT-qPCR與常規(guī)PCR檢測稀釋不同倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(1.07×1010 ~1.07×102 copies/μL),發(fā)現(xiàn)常規(guī)PCR檢測范圍為1.07×1010 ~1.07×107 copies/μL (圖4),而RT-qPCR在1.07×104 copies/μL仍能得到良好的擴(kuò)增曲線(圖5),說明RT-qPCR的靈敏度比常規(guī)PCR高103倍左右。

    2.5 特異性試驗

    為驗證本方法的特異性,利用RT-qPCR分別檢測辣椒中的TSWV、TNSaV、PCSV和TZSV。結(jié)果表明,TSWV、TNSaV和PCSV都未出現(xiàn)良好的擴(kuò)增曲線,只有TZSV出現(xiàn)良好的擴(kuò)增曲線(圖6),表明本研究所構(gòu)建的檢測方法具有良好的特異性。

    2.6 熒光定量PCR的初步運用

    分別用DOT-ELISA、RT-PCR 和RT-qPCR檢測實驗室摩擦接毒辣椒樣品,結(jié)果表明,檢測的6份樣品中,DOT-ELISA和RT-PCR檢測出2個陽性樣品,而RT-qPCR檢測出4個樣品呈陽性(表4),說明RT-qPCR靈敏度高于DOT-ELISA和RT-PCR。

    3 討論與結(jié)論

    隨著社會科技的發(fā)展,病毒檢測手段也越來越多,如血清免疫學(xué)和生物學(xué)技術(shù)。血清學(xué)包括Immuno Strip和ELISA法;生物學(xué)技術(shù)主要利用特異性引物或者簡并性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增[10,11],之后再利用分子克隆技術(shù)進(jìn)行測序、序列比對分析。鄭寬瑜等[12]通過構(gòu)建TZSV NSs血清,應(yīng)用ELISA法檢測植物中的TZSV。血清學(xué)雖能快速檢測病毒,但這種方法缺點明顯。張等[13]發(fā)現(xiàn), INSV感染的文心蘭(Oncidium luridum)樣品ELISA檢測結(jié)果為陰性,但RT-PCR檢測結(jié)果為陽性,表明植物中INSV分布不均勻,應(yīng)用ELISA 檢測會造成誤差,ELISA 法不能準(zhǔn)確檢測低濃度的INSV。

    實時熒光定量PCR是近年來比較流行的檢測手段,由于其靈敏度高、特異性強的特點越來越受到關(guān)注,已廣泛運用于醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、海關(guān)檢疫等領(lǐng)域,如甘薯退綠矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)[14]、小反芻獸疫病毒(Pestedes petits ruminants virus,PPRV)[15]、禽腦脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus,AEV)的檢測[16]。實時熒光定量PCR包括探針類和染料類兩種,探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加;染料類如SYBR Green Ⅰ則是利用與雙鏈DNA小溝結(jié)合發(fā)光的理化特征指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。前者由于增加了探針的識別步驟,特異性更高,但后者操作簡便易行,成本較低。

    實時熒光定量PCR與常規(guī)PCR相比具有許多優(yōu)點。首先,實時熒光定量PCR使用新的溫度控制機制,顯著減少擴(kuò)增時間。其次,常規(guī)PCR擴(kuò)增后電泳和染色步驟耗時、污染環(huán)境,對人體有害。第三,實時熒光定量PCR方法數(shù)據(jù)分析快速且具有良好的再現(xiàn)性,可以同時進(jìn)行96個樣品的數(shù)據(jù)分析,高效快速。本試驗根據(jù)TZSV N基因的保守區(qū)設(shè)計特異性引物,構(gòu)建了TZSV N基因的實時熒光定量PCR檢測方法。該方法的靈敏度、重復(fù)性、特異性良好,能用于檢測實驗室接毒辣椒樣品。該檢測方法的構(gòu)建將為早期TZSV的傳播、蔓延提供可靠的預(yù)測預(yù)報手段。

    參 考 文 獻(xiàn):

    [1]Dong J H, Cheng X F, Yin Y Y, et al. Characterization of Tomato zonate spot virus, a new Tospovirus in China[J]. Archives of Virology, 2008, 153(5): 855-864.

    [2]李秋芳,智龍,李穆,等. 云南鳶尾上發(fā)現(xiàn)番茄環(huán)紋斑點病毒[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2014, 29(2):167-172.

    [3]趙繞芬,王小兵. 番茄環(huán)紋斑點病毒病的發(fā)生與防治[J]. 長江蔬菜, 2012(15):41-42.

    [4]尹躍艷,董家紅,方琦,等. 番茄環(huán)紋斑點病的發(fā)生流行特點初步研究[C]//中國植物保護(hù)學(xué)會2008年學(xué)術(shù)年會. 2008.

    [5]盧訓(xùn),丁銘,方琦,等. 侵染云南煙草的番茄環(huán)紋斑點病毒N基因的分子變異分析[J]. 植物病理學(xué)報, 2012, 42(2):195-201.

    [6]鄭雪,陳永對,吳闊,等. 2014年云南番茄、辣椒上番茄斑萎病毒屬病毒與傳毒薊馬的發(fā)生特點[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2015, 46(3):428-432.

    [7]Kokkinos C D, Clark C A. Real-time PCR assays for detection and quantification of sweetpotato viruses [Erratum: 2007 Mar. v. 91, no. 3, p. unnumbered.][J]. Plant Disease, 2006, 90(6): 783-788.

    [8]Cui Y U, Yang C Y, Zhang S Y, et al. Development and comparative studies of several PCR for detecting Arabis mosaic virus[J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2008, 38(4): 388-393.

    [9]Schmittgen T D, Zakrajsek B A, Mills A G, et al. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of endpoint and real-time methods[J]. Analytical Biochemistry, 2000, 285(2): 194-204.

    [10]Mumford R A, Barker I, Wood K R. An improved method for the detection of Tospoviruses using the polymerase chain reaction[J]. Journal of Virological Methods, 1996, 57(1): 109-115.

    [11]Okuda M, Hanada K. RT-PCR for detecting five distinct Tospovirus species using degenerate primers and dsRNA template[J]. Journal of Virological Methods, 2001, 96(2): 149-156.

    [12]鄭寬瑜,董家紅,尹躍艷,等. 番茄環(huán)紋斑點病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSs的原核表達(dá)及多抗血清制備[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2015, 28(1):168-171.

    [13]張巧萍,丁元明,李旻,等. 盆栽文心蘭上的鳳仙花壞死斑病毒的檢測與分子鑒定[J]. 植物檢疫, 2008, 22(6):348-351.

    [14]王麗,王振東,喬奇,等. 甘薯褪綠矮化病毒西非株系實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 植物病理學(xué)報, 2014, 44(5):461-468.

    [15]Abera T, Thangavelu A. Development of a two-step SYBR Green I based real time RT-PCR assay for detecting and quantifying peste des petits ruminants virus in clinical samples[J]. Journal of Virological Methods, 2014, 209: 25-29.

    [16]Liu Q, Yang Z, Hao H, et al. Development of a SYBR Green real-time RT-PCR assay for the detection of Avian encephalomyelitis virus[J]. Journal of Virological Methods, 2014, 206(7): 46-50.

    猜你喜歡
    檢測方法
    宮頸內(nèi)人乳頭瘤病毒的研究進(jìn)展
    小兒氨酚黃那敏顆粒有關(guān)物質(zhì)對氯苯乙酰胺檢測方法的建立
    粉狀速凝劑氯離子含量檢測方法
    韩国精品一区二区三区| 久久女婷五月综合色啪小说| 免费高清在线观看视频在线观看| 午夜激情久久久久久久| 亚洲欧美清纯卡通| 国产日韩欧美亚洲二区| 午夜福利在线免费观看网站| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久热在线av| 免费看av在线观看网站| 国产不卡av网站在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 一区在线观看完整版| 中文字幕最新亚洲高清| a 毛片基地| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久青草综合色| 天堂俺去俺来也www色官网| 人妻 亚洲 视频| 欧美日韩综合久久久久久| 在线观看免费午夜福利视频| 色视频在线一区二区三区| 秋霞在线观看毛片| 国产91精品成人一区二区三区 | 免费看不卡的av| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 免费不卡黄色视频| 人妻人人澡人人爽人人| 搡老岳熟女国产| 99国产综合亚洲精品| 又大又黄又爽视频免费| 男男h啪啪无遮挡| 中文字幕制服av| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美成人午夜精品| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久ye,这里只有精品| 老司机在亚洲福利影院| 国产午夜精品一二区理论片| 超色免费av| 久久久精品94久久精品| 一区二区三区激情视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 成年人黄色毛片网站| 国产成人av激情在线播放| 麻豆乱淫一区二区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 后天国语完整版免费观看| 久久久久久久久免费视频了| 晚上一个人看的免费电影| 18禁国产床啪视频网站| 欧美日韩视频精品一区| 国产99久久九九免费精品| 国产一级毛片在线| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 在线观看免费午夜福利视频| 人妻人人澡人人爽人人| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产精品av久久久久免费| 操美女的视频在线观看| 好男人视频免费观看在线| 老熟女久久久| 免费观看人在逋| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 老司机影院成人| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品久久久久久精品电影小说| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 欧美精品一区二区大全| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产亚洲av高清不卡| 尾随美女入室| 波多野结衣一区麻豆| 看免费av毛片| 国产野战对白在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产男人的电影天堂91| 一级黄片播放器| 久久天堂一区二区三区四区| 青草久久国产| 国产成人免费无遮挡视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美激情极品国产一区二区三区| 又大又黄又爽视频免费| 又黄又粗又硬又大视频| 考比视频在线观看| 国产精品一国产av| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲国产精品国产精品| 人成视频在线观看免费观看| 人人澡人人妻人| 国产成人欧美| 五月开心婷婷网| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 免费在线观看完整版高清| 在线观看免费日韩欧美大片| 午夜福利视频精品| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久免费观看电影| 黄色怎么调成土黄色| 久久久久久久大尺度免费视频| 女性生殖器流出的白浆| av又黄又爽大尺度在线免费看| 一本大道久久a久久精品| 国产在线观看jvid| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美另类一区| 中文字幕亚洲精品专区| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 亚洲久久久国产精品| 观看av在线不卡| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产免费又黄又爽又色| 久久精品成人免费网站| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久人人97超碰香蕉20202| 视频区欧美日本亚洲| bbb黄色大片| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲欧美色中文字幕在线| 永久免费av网站大全| 激情五月婷婷亚洲| 国产成人欧美| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美另类一区| 国产深夜福利视频在线观看| av网站免费在线观看视频| 久久影院123| 国产成人欧美| 满18在线观看网站| 久久久精品94久久精品| 老司机靠b影院| 久久精品人人爽人人爽视色| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久久精品区二区三区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产精品国产av在线观看| 麻豆国产av国片精品| 精品少妇内射三级| av视频免费观看在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲精品av麻豆狂野| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲黑人精品在线| 国精品久久久久久国模美| av在线app专区| 久久99一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 老汉色∧v一级毛片| 欧美日韩综合久久久久久| 午夜久久久在线观看| 亚洲av综合色区一区| 午夜福利免费观看在线| 精品欧美一区二区三区在线| 国产成人欧美| 老鸭窝网址在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 国产野战对白在线观看| 午夜av观看不卡| 丰满少妇做爰视频| 精品一品国产午夜福利视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 在线精品无人区一区二区三| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲精品在线美女| 天堂中文最新版在线下载| 伦理电影免费视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲人成电影观看| 美国免费a级毛片| 久热这里只有精品99| 中文字幕人妻熟女乱码| 少妇 在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲五月色婷婷综合| 国产一区二区激情短视频 | 国产精品熟女久久久久浪| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产成人精品久久二区二区免费| 久久天堂一区二区三区四区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美成狂野欧美在线观看| 咕卡用的链子| av在线老鸭窝| 亚洲国产欧美一区二区综合| 免费一级毛片在线播放高清视频 | tube8黄色片| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 99re6热这里在线精品视频| 女人精品久久久久毛片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲黑人精品在线| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲精品国产色婷婷电影| av天堂在线播放| 日韩一本色道免费dvd| 高清不卡的av网站| 久久毛片免费看一区二区三区| 一区二区av电影网| 国产亚洲一区二区精品| 国产成人精品无人区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 精品亚洲成国产av| 欧美日韩视频精品一区| 秋霞在线观看毛片| 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲国产精品一区二区三区在线| 午夜福利视频精品| 99国产精品免费福利视频| 国产成人欧美在线观看 | 少妇的丰满在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 永久免费av网站大全| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲久久久国产精品| 成人三级做爰电影| 亚洲国产精品国产精品| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产精品一二三区在线看| 国产伦人伦偷精品视频| 精品高清国产在线一区| 在线精品无人区一区二区三| 国产精品一区二区在线不卡| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲中文字幕日韩| 男的添女的下面高潮视频| 色播在线永久视频| 黄色一级大片看看| 男女边吃奶边做爰视频| 午夜影院在线不卡| 亚洲国产av影院在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产成人精品久久久久久| 一区二区三区四区激情视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 搡老乐熟女国产| 波多野结衣av一区二区av| 日本av免费视频播放| a 毛片基地| 99国产综合亚洲精品| 天堂8中文在线网| 国产真人三级小视频在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 午夜激情av网站| 欧美日韩综合久久久久久| 黄色怎么调成土黄色| 欧美黑人精品巨大| 成年女人毛片免费观看观看9 | 只有这里有精品99| 久久久久网色| 51午夜福利影视在线观看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 午夜免费男女啪啪视频观看| 2018国产大陆天天弄谢| 午夜影院在线不卡| 一本色道久久久久久精品综合| 精品少妇内射三级| 五月开心婷婷网| 亚洲国产精品一区三区| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 午夜免费成人在线视频| 99热国产这里只有精品6| 无限看片的www在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 9热在线视频观看99| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品久久久人人做人人爽| 中国美女看黄片| 日日夜夜操网爽| 日韩视频在线欧美| cao死你这个sao货| 两个人看的免费小视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 这个男人来自地球电影免费观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 老司机影院毛片| 久久久久视频综合| 水蜜桃什么品种好| 亚洲男人天堂网一区| 成人黄色视频免费在线看| 一区二区三区四区激情视频| 国产淫语在线视频| 一本色道久久久久久精品综合| 成年av动漫网址| 青草久久国产| 激情视频va一区二区三区| 日韩人妻精品一区2区三区| 婷婷色综合www| 日本黄色日本黄色录像| 国产精品一区二区在线不卡| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲综合色网址| av天堂在线播放| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美日韩福利视频一区二区| 午夜精品国产一区二区电影| 精品熟女少妇八av免费久了| 午夜精品国产一区二区电影| 美女主播在线视频| 飞空精品影院首页| 亚洲人成电影免费在线| 18禁观看日本| bbb黄色大片| 悠悠久久av| 91国产中文字幕| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久99一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| 亚洲九九香蕉| 我要看黄色一级片免费的| 国产高清不卡午夜福利| 男男h啪啪无遮挡| 九草在线视频观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 十八禁网站网址无遮挡| 黄色a级毛片大全视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美另类一区| 亚洲精品一二三| 高清av免费在线| 欧美在线黄色| 可以免费在线观看a视频的电影网站| videos熟女内射| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 自线自在国产av| 亚洲天堂av无毛| 久久久精品区二区三区| 国产精品一国产av| 美女视频免费永久观看网站| 久久九九热精品免费| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲av欧美aⅴ国产| 手机成人av网站| 大话2 男鬼变身卡| 国产片特级美女逼逼视频| 黄频高清免费视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲av日韩在线播放| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 性高湖久久久久久久久免费观看| 黄色毛片三级朝国网站| 国产免费现黄频在线看| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产精品av久久久久免费| 咕卡用的链子| 大话2 男鬼变身卡| 曰老女人黄片| 男女边摸边吃奶| 午夜激情av网站| a级毛片在线看网站| 狂野欧美激情性bbbbbb| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产亚洲av高清不卡| 欧美日韩一级在线毛片| 国产真人三级小视频在线观看| tube8黄色片| 久久精品久久久久久久性| 久久久精品免费免费高清| 女性生殖器流出的白浆| 伊人亚洲综合成人网| 91精品国产国语对白视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲伊人久久精品综合| 国产在线一区二区三区精| 久久99精品国语久久久| 下体分泌物呈黄色| 丝袜美腿诱惑在线| 丰满少妇做爰视频| 天天添夜夜摸| 9191精品国产免费久久| 久久鲁丝午夜福利片| 天堂8中文在线网| 精品一区二区三卡| 大码成人一级视频| 日本五十路高清| 成人手机av| 麻豆乱淫一区二区| 免费高清在线观看视频在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产黄色免费在线视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲,欧美,日韩| 成年女人毛片免费观看观看9 | 麻豆av在线久日| 免费日韩欧美在线观看| 成在线人永久免费视频| 日日爽夜夜爽网站| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 婷婷色综合www| 精品人妻在线不人妻| 波多野结衣一区麻豆| 午夜91福利影院| 一区二区日韩欧美中文字幕| 男人操女人黄网站| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产淫语在线视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 好男人视频免费观看在线| 亚洲国产看品久久| 午夜av观看不卡| 色播在线永久视频| 国产主播在线观看一区二区 | 99热全是精品| 看十八女毛片水多多多| 一边亲一边摸免费视频| 晚上一个人看的免费电影| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产精品国产三级国产专区5o| 一级毛片电影观看| 岛国毛片在线播放| 男人爽女人下面视频在线观看| 99热网站在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| av在线app专区| 婷婷成人精品国产| 欧美成人午夜精品| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美精品亚洲一区二区| 国产片特级美女逼逼视频| 18禁观看日本| 国产极品粉嫩免费观看在线| 中文字幕制服av| 69精品国产乱码久久久| 免费在线观看影片大全网站 | 老司机深夜福利视频在线观看 | 精品久久久久久电影网| 午夜免费成人在线视频| 看十八女毛片水多多多| 黄色a级毛片大全视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 亚洲欧美一区二区三区久久| 色94色欧美一区二区| 国产成人精品久久二区二区免费| 性高湖久久久久久久久免费观看| 丁香六月欧美| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 国产日韩欧美在线精品| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品欧美一区二区三区在线| 少妇精品久久久久久久| 女人精品久久久久毛片| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产成人91sexporn| 99久久人妻综合| 日本wwww免费看| 韩国精品一区二区三区| 亚洲av男天堂| 无遮挡黄片免费观看| 精品欧美一区二区三区在线| 一区福利在线观看| 性少妇av在线| av福利片在线| cao死你这个sao货| 欧美激情 高清一区二区三区| 精品福利观看| 99国产精品99久久久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 美女大奶头黄色视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 黄色一级大片看看| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 日本黄色日本黄色录像| 国产精品国产三级专区第一集| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久精品成人免费网站| 午夜两性在线视频| 欧美精品一区二区免费开放| 国产日韩欧美视频二区| 天堂中文最新版在线下载| 脱女人内裤的视频| 久久亚洲精品不卡| 午夜老司机福利片| 亚洲中文字幕日韩| 一级片免费观看大全| 99九九在线精品视频| 国产伦理片在线播放av一区| 国产精品人妻久久久影院| 久久久久久久大尺度免费视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美人与善性xxx| 黑人猛操日本美女一级片| 天天影视国产精品| 国产成人免费观看mmmm| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 制服诱惑二区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 亚洲精品一二三| 美女扒开内裤让男人捅视频| videos熟女内射| 国产一区二区在线观看av| 国产xxxxx性猛交| 久久久久精品国产欧美久久久 | 精品国产乱码久久久久久男人| 97人妻天天添夜夜摸| 国产一区二区三区av在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 多毛熟女@视频| 女人久久www免费人成看片| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 黄片小视频在线播放| 看免费av毛片| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 日韩一区二区三区影片| 亚洲欧洲国产日韩| 精品人妻在线不人妻| 美女福利国产在线| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 999精品在线视频| 大码成人一级视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 美女午夜性视频免费| 亚洲情色 制服丝袜| 丝袜美腿诱惑在线| 激情视频va一区二区三区| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 国产男人的电影天堂91| 深夜精品福利| 亚洲av片天天在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 好男人电影高清在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 中文欧美无线码| 久久久国产欧美日韩av| av天堂久久9| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 久久久久久久大尺度免费视频| 婷婷丁香在线五月| 岛国毛片在线播放| 曰老女人黄片| 欧美日韩一级在线毛片| 久热这里只有精品99| av国产精品久久久久影院| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产一级毛片在线| 啦啦啦在线观看免费高清www| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 香蕉国产在线看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久久久久精品精品| 满18在线观看网站| 中文字幕制服av| 亚洲欧洲日产国产| 女性生殖器流出的白浆| 久久国产精品影院| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 精品一品国产午夜福利视频| 在线观看免费高清a一片| 一级片免费观看大全| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品一二三区在线看| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 日本一区二区免费在线视频| 搡老岳熟女国产| av国产精品久久久久影院| 美女大奶头黄色视频| 亚洲精品一区蜜桃| 国产成人av激情在线播放| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 在线观看www视频免费| 成年女人毛片免费观看观看9 | av天堂久久9| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 蜜桃国产av成人99| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲av电影在线进入| 日韩 亚洲 欧美在线| 性少妇av在线| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲国产av新网站| av视频免费观看在线观看| 无限看片的www在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产在线观看jvid| 免费在线观看日本一区| 国产成人精品久久久久久| 国产高清视频在线播放一区 |