RCP與G蛋白偶聯(lián)在靜壓力促血管平滑肌細胞增殖中的作用

張曉一，王 珍，郭 峰，劉玉環(huán)，楊 麗，陽 芳，秦旭平

(1.長治醫(yī)學院藥學系，山西 長治 046000；2.南華大學藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001)

RCP與G蛋白偶聯(lián)在靜壓力促血管平滑肌細胞增殖中的作用

張曉一1，王 珍2，郭 峰2，劉玉環(huán)2，楊 麗2，陽 芳2，秦旭平2

(1.長治醫(yī)學院藥學系，山西 長治 046000；2.南華大學藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001)

目的 探討受體組分蛋白(RCP)在靜壓力促血管平滑肌細胞(VSMC)增殖信號跨膜轉導中的作用。方法 以鼠源性A10血管平滑肌細胞(A10VSMC)作為研究對象，用靜壓力處理細胞，噻唑藍比色法(MTT)檢測細胞的活性；Western blot 檢測增殖細胞核抗原(PCNA)、RCP和G蛋白的表達；RT-PCR檢測RCP mRNA表達水平；免疫共沉淀檢測G蛋白和RCP間相互作用。結果 靜壓力呈壓力和時間依賴性地增加A10VSMC活性、PCNA蛋白表達和RCP表達，并在120 mmHg靜壓力和6 h達到最大。靜壓力在增加細胞 p-Akt表達水平(P<0.05)的同時，減少RCP與Gαs的相互作用，增加RCP與Gβ的作用，但對Gγ不明確。結論 靜壓力可使VSMC增殖和RCP表達增加，其作用可能涉及到細胞G蛋白信號轉導機制。

受體組分蛋白；靜壓力；血管平滑肌細胞；增殖；G蛋白；信號轉導

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖在高血壓血管重構、冠狀動脈粥樣硬化、冠狀動脈搭橋術、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術后血管再狹窄的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用。引起平滑肌細胞增殖的因素很多，包括機械力、生長因子、細胞因子、多肽和核酸代謝產(chǎn)物等[1-2]。其中，血壓升高所產(chǎn)生的異常機械力作用于血管壁，引起VSMC肥大、增生和細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，是導致VSMC增殖并誘發(fā)血管重構的重要原因之一[3]。在血管內(nèi)，血壓和血流對血管壁產(chǎn)生的機械力按不同方向分為剪應力、靜壓力、牽張力。剪應力是血液流動所產(chǎn)生的摩擦力，靜壓力是血液在血管內(nèi)由于重力所造成的壓力，而牽張力是心臟周期性搏動所產(chǎn)生的具有一定頻率的張力[4]。由于VSMC不直接與剪應力接觸，所以，VSMC的功能主要受靜壓力和牽張力的調(diào)控。靜壓力對VSMC功能調(diào)控作用研究甚少，且具體信號通路不完全清楚[5]。

降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)，可由感覺神經(jīng)末梢和組織旁分泌，是目前發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)最強的舒血管活性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，高壓大鼠和原發(fā)性高血壓患者體內(nèi)CGRP合成和分泌減少是導致血壓持續(xù)增高的重要原因[6]。由于CGRP通過其受體發(fā)揮作用，故闡明CGRP受體在血壓調(diào)節(jié)中的信號轉導實屬必要。目前認為，CGRP受體主要有3種成分構成，包括降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor-like receptor, CLR)、受體活性修飾蛋白-1(receptor activity modifying protein 1, RAMP1)和降鈣素基因相關肽受體組分蛋白(calcitonin gene-related peptide receptor component protein, RCP)[7]。CLR是7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白，CGRP攜帶的信息是通過磷酸化CLR而傳遞進入胞內(nèi)，進而進行下游的生物應答，RAMP1是CLR的一個分子伴侶蛋白，與CLR的膜分布有關，而RCP在膜內(nèi)側，起作用可能與信號轉導有關，也有認為RCP可能不僅僅只轉導CGRP的信息，還可能與G蛋白偶聯(lián)在轉導其他細胞外信號中發(fā)揮作用[8]。故本文探索RCP在靜壓力誘導VSMC增殖信號跨膜轉導中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 RCP山羊多克隆抗體、β-actin鼠單克隆抗體、3種G蛋白亞型兔多克隆抗體，均購自美國Santa Cruz公司；增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA) 鼠單克隆抗體(英國Abcam公司)；CGRP(美國Sigma公司)；胎牛血清(美國紐約Gibco公司產(chǎn)品)。

1.2 儀器 Forma 3111 CO2培養(yǎng)箱(美國 Thermo公司)；壓力培養(yǎng)箱(南華大學自主研制)；PE2400 PCR儀(美國Perking 公司)；Western blot裝置(北京六一儀器廠)；酶聯(lián)免疫檢測儀Elx-800型(Bio-Tek公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠血管平滑肌細胞培養(yǎng) 鼠源性A10血管平滑肌細胞株(A10VSMC)購自上海眾華生物公司(來源于美國ATCC細胞庫)。細胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM細胞培養(yǎng)液吹散制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度37 ℃，濕度95%)。每隔2～3 d換培養(yǎng)液1次，待細胞80%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。取對數(shù)生長期細胞，并待細胞長滿至整個細胞瓶70%左右時，換成含1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞同步化，然后分別加入不同的處理因素進行實驗。整個實驗根據(jù)處理因素，以靜止期細胞零壓力或零時間為對照組，其他處理因素為處理組，其中CGRP處理組為陽性藥物對照組，在各實驗過程中具體說明。

1.3.2 MTT法檢測VSMC的活性 A10細胞以密度為5×103個種植在96孔板，貼壁24 h，然后換為無血清培養(yǎng)基24 h同步化，以不同壓力、不同時間處理A10VSMC。然后，每孔加入20 μL濃度為50 g·L-1MTT溶液，置于CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育4 h后，輕輕吸掉液體，每孔加入150 μL DMSO，室溫搖床上搖動10 min，使用酶標儀測量波長為570 nm的吸光度。根據(jù)公式計算細胞存活率，存活率/%=A增殖組/A對照組×100%。

1.3.3 Western blot法檢測蛋白表達 于冰上用5 mL 4℃預冷的PBS洗滌培養(yǎng)瓶中的細胞，棄去洗滌液，重復3次。加入60 μL含PMSF的裂解液裂解10 min，用BCA蛋白定量分析試劑盒進行總蛋白定量。取含50 μg蛋白至1.5 mL的EP管中，加入5×SDS上樣緩沖液，于沸水中煮10 min使蛋白變性后，上樣。用12%分離膠5%濃縮膠進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，轉移至PDVF膜上，用適量5%脫脂牛奶封閉1 h。TBST洗掉牛奶后，加入適當濃度的一抗，4℃孵育過夜，次日，用TBST在室溫下脫色搖床上洗膜3次，每次10 min。再加入適當濃度的二抗室溫孵育1～2 h后，再用TBST清洗3次，每次10 min，然后進行化學發(fā)光法顯色。根據(jù)熒光強度確定壓片時間，取出膠片，分別向顯影盒和定影盒中倒入適量顯影液和定影液，將膠片放入顯影液中，緩慢搖動，5～10 s后取出，放入定影液中約10 min后，晾干并保存。將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶和凈光密度值。

1.3.4 RT-PCR法檢測RCP mRNA的表達 按TRIzol試劑操作說明提取A10VSMC的總RNA， 按照逆轉錄試劑盒說明書在PCR儀上逆轉錄后，所得的cDNA可直接進行PCR反應或-20℃保存。由上海生工DNA合成大鼠RCP和GAPDH的引物并作適當修飾，以避免引物自身形成發(fā)夾結構及引物二聚體合成，并經(jīng)ULTRAPAGE方式純化。RCP上游：5′-CGGGATCCCGAGGCAACATGGAAGTGAAGG-3′，下游：5′-GCTCTAGAGCTGTCTATGCAGGCTCCTCCT-3′； GAPDH：上游：5′-GAACTTGAACGCCATCACCTA-3′， 下游：5′-GTGTGCAGGAGAGCTTCAA TC-3′ 。反應體系：Taq Master Mix(2×) 12.5 μL， PCR 上、下游引物各1 μL，無核酸酶水9.5 μL，cDNA 1 μL。反應條件：預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火30 s(RCP：64 ℃，GAPDH：55 ℃)，延伸72 ℃ 30 s，進行30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。然后，于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯影并用灰度掃描目標條帶的積分吸光度值(IA)與內(nèi)標IA比值的半定量法，分析目的基因的表達變化。

1.3.5 免疫共沉淀法檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用 將對數(shù)生長期的A10VSMC消化接種于 6孔板中，每孔加入2 mL含有 1×105個細胞的細胞懸液。然后，按照免疫共沉淀試劑盒步驟操作。簡化步驟包括通過抗體固化、免疫共沉淀、免疫復合物的洗脫，向Pierce Spin Column 中加入30 μL Elution Buffer，室溫孵育30 min，離心收集洗脫物，用RCP和G蛋白抗體做Western blot檢測。

2 結果

2.1 靜壓力誘導VSMC的增殖 不同靜壓力處理A10VSMC不同時間，Western blot檢測PCNA蛋白表達水平和MTT法檢測細胞活性。結果顯示，在同一6 h時間點，與對照組相比，VSMC的活性隨著靜壓力的增加而逐漸增加，在120 mmHg的靜壓力下達到最高(P<0.01，F(xiàn)ig 1A)；Western blot法也顯示，PCNA蛋白表達水平隨著靜壓力的增加而逐漸增加，在120 mmHg的壓力下達到最大(P<0.01，F(xiàn)ig 1B)。在同一120 mmHg靜壓力下，與對照組相比，VSMC的活性隨著時間的延長逐漸增加，在6 h達到了最高并處于平臺期(P<0.01，F(xiàn)ig 1C)；Western blot結果顯示，PCNA蛋白表達在6 h達到最大并處于平臺期(P<0.01，F(xiàn)ig 1D)。我們選擇靜壓力為120 mmHg處理A10VSMC 6 h用于后續(xù)實驗。

Fig 1 Effect of static pressure on A10VSMC viability and PCNA expression (±s, n=3)

Dose-effect relationship of static pressure on cell viability(A) and PCNA (B).*P<0.05,**P<0.01vs0 mmHg. Time-effect relationship of static pressure on cell viability (C) and PCNA (D).*P<0.05,**P<0.01vs0 h. On the y-axis, 1 represents the OD value in control group (0 mmHg or 0 h).

2.2 靜壓力上調(diào)VSMC中RCP蛋白和mRNA 為了檢測靜壓力對RCP的表達是否有影響，我們用不同靜壓力處理A10VSMC不同時間，檢測RCP mRNA和蛋白表達。結果顯示，在6 h時間點，與0 mmHg壓力組相比，RCP蛋白表達和mRNA隨著靜壓力的增加而增加，并在120 mmHg的壓力下達到最大(P<0.01，F(xiàn)ig 2A、2B)。在120 mmHg靜壓力下，與0 h組相比，RCP蛋白表達和mRNA水平隨著時間的延長逐漸上調(diào)，在6 h達到了最高并處于平臺期(P<0.01，F(xiàn)ig 2C、2D)。這些結果表明，RCP的表達與靜壓力成劑量和時間依賴關系，與細胞增殖呈正相關，提示RCP參與了靜壓力誘導的A10VSMC增殖。

2.3 CGRP抑制靜壓力誘導的VSMC增殖 為了進一步確認RCP的表達是否對靜壓力誘導平滑肌細胞增殖有影響。采用終濃度為10 nmol·L-1的CGRP孵育細胞12 h，然后用120 mmHg的壓力處理6 h。結果顯示，與no-CGRP組比較，在靜壓力作用下，細胞活性明顯降低(P<0.05，F(xiàn)ig 3A)；PCNA蛋白表達也明顯減少(P<0.05，F(xiàn)ig 3B)。這說明CGRP誘導的RCP表達減弱了靜壓力誘導的VSMC增殖作用，RCP的表達限制了靜壓力誘導VSMC的過分增殖。

2.4 靜壓力對PI3K/Akt信號通路及RCP與G蛋白的相互作用的影響 為了解靜壓力導致的A10VSMC增殖是否與G蛋白和PI3K/Akt信號通路有關，以靜止期細胞(Control)組和CGRP組(CGRP受體激動劑，藥物對照)為對照，用120 mmHg靜壓力分別處理細胞5、30 min和1、3、6 h。如Fig 4所示，與Control組相比，p-Akt的表達在施壓后30 min降低，但隨后表達增強(Fig 4A)；同時，在5 min時間點，Gαs與RCP的偶合明顯減少(Fig 4B)，RCP與Gβ的偶合增加(Fig 4C)，但RCP與Gγ亞型的偶合作用不明顯(Fig 4D)。另外也發(fā)現(xiàn)，Akt的表達在施壓后1 h增加，提示靜壓力解離了Gαs與RCP的偶合，可能與激活PI3K/Akt信號通路有關；與對照組的靜止期細胞相比，給予10 nmol·L-1的CGRP孵育細胞30 min，Gαs、Gβγ與RCP偶合作用均減少(Fig 4B～4D)。

Fig 2 Effect of static pressure on expression of RCP (±s, n=3)

Dose-effect relationship of static pressure on the expression of RCP protein(A) and mRNA (B).*P<0.05,**P<0.01vs0 mmHg. Time-effect relationship of static pressure on the expression of RCP protein (C) and mRNA (D).*P<0.05,**P<0.01vs0 h.

Fig 3 Effect of CGRP on A10VSMC proliferation induced by static pressure (±s, n=3 )

Cell viability (A) and PCNA (B).**P<0.01vs0 mmHg (control);#P<0.05vsno-CGRP group.

Fig 4 Expression of Akt and interaction of RCP and G proteins induced by static pressure

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，靜壓力能夠促進VSMC的增殖，也可誘導RCP的表達增加， RCP與Gαs蛋白的相互作用可能在介導靜壓力激活PI3K/Akt信號使VSMC增殖通路中起重要作用。同時，RCP的增加，也可能增加VSMC對CGRP的敏感性，通過代償性地抑制了靜壓力誘導的VSMC過度增殖；靜壓力促VSMC增殖的同時，減弱了RCP與Gαs蛋白的結合，但增加了與Gβ結合，說明在靜止期的VSMC中，RCP起到了束縛Gαs蛋白的作用。文獻報道，管腔內(nèi)血壓和血流產(chǎn)生的機械力在調(diào)節(jié)血管平滑肌形態(tài)和生長方面有著重要的作用，其壓力的信號轉導機制一直是人們關心的問題[9]。本實驗結果顯示，靜壓力能夠使靜止期VSMC活性和蛋白增殖抗原表達增加，說明除過量血管活性物質(zhì)(如血管緊張素II等)外，血壓引起的壓力增高也是導致血管重構的一個因素[10]。體內(nèi)CGRP分泌增加在抑制血壓升高方面起重要作用，這與本實驗結果CGRP能抑制靜壓力增高導致的細胞增殖完全一致，說明CGRP抑制高血壓血管重構作用與抑制VSMC增殖有關。令人感興趣的是在本實驗中，靜壓力能誘導RCP的表達增加，這是否提示RCP也參與了靜壓力誘導VSMC增殖的信號轉導值得探索。

眾所周知，G蛋白偶聯(lián)受體是以G蛋白亞單位Gαs和Gβγ結合與分離介導信號轉導為特征，大多數(shù)藥物的治療作用都與G蛋白偶聯(lián)受體有關[11-12]。機械力的信號轉導是否也與G蛋白有關，而且機械力能否調(diào)節(jié)RCP，目前仍不清楚。本實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組(靜止期細胞)比較，持續(xù)施加靜壓力，RCP與Gαs和Gγ的結合明顯減弱，而相應地與Gβ結合增加，這提示靜壓力減弱了RCP與Gαs或(和)Gγ的偶合作用，促進了Gαs和Gγ游離；同時也發(fā)現(xiàn)，Akt信號在施加靜壓力5、30 min時，表達降低，但1 h后，明顯增強，這進一步證明PI3K/Akt信號是導致VSMC增殖中的一個重要通路，持續(xù)機械力作用下，磷酸化的Akt在1 h后明顯增大[13]，這可能與蛋白表達的滯后效應有關，但為什么Akt在30 min時表達降低，仍需要進一步探討。本實驗結果說明PI3K/Akt信號介導了靜壓力誘導的VSMC增殖。由于前期實驗我們證實，CGRP對血管緊張素II誘導的VSMC增殖有抑制作用[14]，故在本實驗中，我們以CGRP為對照藥，與對照組(靜止期細胞)比較，CGRP組Gαs、Gβγ與RCP偶合作用均減少，說明CGRP對靜止期細胞有促增長作用，但這種機制可能與靜壓力激活PI3K/Akt信號促VSMC增殖機制不完全相同。需要說明的是，由于本實驗設計局限性，本實驗只能說明靜壓力能夠促進VSMC的增殖作用，同時也可誘導RCP的表達增加，要確切證明RCP與Gαs蛋白的相互作用介導了靜壓力激活PI3K/Akt信號通路使VSMC增殖，還必須在沉默RCP和(或)Gαs基因基礎上，進一步觀察PI3K/Akt信號的表達活性與細胞增殖的關系。

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Interacting of receptor component protein and G protein in static pressure-induced proliferation of VSMC

ZHANG Xiao-yi1,WANG Zhen2, GUO Feng2, LIU Yu-huan2, YANG Li2, YANG Fang2,QIN Xu-ping2
(1.DeptofPharmacy,ChangzhiMedicalCollege,ChangzhiShanxi046000,China;2.InstituteofPharmacyandPharmacology,UniversityofSouthChina,HengyangHunan421001,China)

Aim To explore the effect of receptor component protein (RCP) in the signal transduction of vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation induced by static pressure. Methods The mouse-derived vascular smooth muscle cell line (A10VSMC) was employed in the experiment. Cells were exposed to static pressure, and MTT assay was used to detect the cell viability. Western blot was used to determine the expressions of PCNA, RCP and p-Akt, RCP mRNA was tested by RT-PCR, and co-immunoprecipitation was used to test the interaction between RCP and G proteins. Results The cell viability, expressions of PCNA and RCP increased with the elevation of static pressure and reached their peaks at 120 mmHg, and after 6 hours they got a plateau. The static pressure significantly increased the level of p-Akt, meanwhile, the binding of RCP and Gαs significantly decreased. However, the binding of RCP and Gβ increased in response to static pressure after stimuli of static pressure, but Gγ was obscure. Conclusion Static pressure can induce VSMC proliferation and expression of RCP, which may involve G protein signal transduction model.

RCP; static pressure; vascular smooth muscle cells; proliferation; G protein; signal transduction

2017-05-07,

2017-06-06

國家自然科學基金資助項目(No 30572192, 81173060)；南華大學研究生科研創(chuàng)新項目(No 2011XCX13, 0223-0002-00031)

張曉一(1967- )，女，講師，研究方向：心血管藥理學，Tel: 0355-3151442，E-mail：zhangxiaoyi1225@aliyun.com； 秦旭平(1963- )，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：血管重構機制及藥物防治，通訊作者，Tel: 0734-8160781，E-mail: qinxp333@hotmail.com

時間：2017-7-7 11:05 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.050.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.025

A

1001-1978(2017)08-1170-06

R-332；R322.74；R329.24；R392.11；R977.6