17β-雌二醇對絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞生物活性的影響

宋立婷 朱東望 李佳珊 吳陳炫 蔣少云

17β-雌二醇對絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞生物活性的影響

宋立婷 朱東望 李佳珊 吳陳炫 蔣少云

目的：本研究旨在觀察雌激素對絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞細(xì)胞增殖和活性、成骨分化、骨保護(hù)素(osteoprotegerin)和核因子κB受體(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)的影響，為絕經(jīng)婦女的牙周和種植治療提供參考。方法：經(jīng)患者知情同意，收集女性志愿者(年齡63-72歲)的牙槽骨，進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲得牙槽成骨細(xì)胞。用不同劑量的17β-雌二醇(0.01nM、0.1nM和1nM)處理后，通過MTT和細(xì)胞計(jì)數(shù)、堿性磷酸酶活性、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)、von Kossa實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)分別檢測絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞的增殖和活性、成骨分化、OPG和RANKL表達(dá)水平。結(jié)果：17β-雌二醇處理后，絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖和活性、堿性磷酸酶活性、骨鈣素水平和礦化能力都明顯增高，且具有17β-雌二醇濃度依賴性。同時(shí)，隨17β-雌二醇劑量的增加，OPG表達(dá)升高，而RANKL的水平下降，OPG/RANKL比值明顯升高。結(jié)論：17β-雌二醇可以增強(qiáng)絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞的增殖和活性、促進(jìn)成骨、改善牙槽骨再生的微環(huán)境，為絕經(jīng)婦女的牙周骨再生治療提供了重要參考。

牙槽骨；成骨細(xì)胞；17β-雌二醇；絕經(jīng)

在正常情況下骨組織的形成和吸收處于一種平衡狀態(tài)，是成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、激素、細(xì)胞因子和生長因子等多種因素調(diào)節(jié)的結(jié)果。年齡相關(guān)的骨喪失是由于隨著年齡的增長，這種平衡因成骨細(xì)胞的增殖、分化、活性以及壽命降低，破骨細(xì)胞的活性增強(qiáng)所打破[1,2]。研究表明老年人顱骨以及胸椎、腰椎椎體的成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖和成骨潛能都有下降[3-5]。同時(shí)，骨微環(huán)境中存在著多種影響骨祖細(xì)胞聚集和分化的因素，比如激素，與絕經(jīng)婦女骨質(zhì)疏松的發(fā)生密切相關(guān)。根據(jù)以前的研究，與絕經(jīng)前相比，血清17β-雌二醇在絕經(jīng)期間降低85-90%[6]。在動物模型中，卵巢切除后干骺端松質(zhì)骨可減少73%[7]。而且雌激素可抑制成骨細(xì)胞、T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生核因子κB受體激動劑(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)[8,9]，促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)的產(chǎn)生[10,11]，導(dǎo)致RANKL/OPG比例改變，有利于骨吸收。

在我們前期研究中，已經(jīng)證明了絕經(jīng)婦女牙槽骨成骨細(xì)胞發(fā)生年齡相關(guān)的變化[1]，其增殖，分化和礦化能力明顯低于年輕成年婦女牙槽成骨細(xì)胞。同時(shí)，絕經(jīng)婦女的雌激素水平明顯降低。因而，本研究旨在探究雌激素是否可以克服絕經(jīng)婦女牙槽骨成骨細(xì)胞的年齡相關(guān)變化，從而為這類人群的牙科臨床治療提供參考。

1.材料和方法

1.1 研究對象 經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)，經(jīng)患者知情同意，對就診于口腔頜面外科且需手術(shù)患者(如牙槽骨修整術(shù)等)收取少許廢棄的牙槽骨。納入研究的患者為非吸煙者，身體基本健康以及收集牙槽骨的部位沒有炎癥和腫瘤。共需收集5個(gè)絕經(jīng)婦女牙槽骨(年齡63-72歲)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 獲得的牙槽骨樣本立即浸在無菌的Hank’s平衡鹽溶液(Gibco，美國)中清洗。將其分別置于60mm培養(yǎng)皿(Corning Costar，美國)中，加入α-MEM培養(yǎng)基(含2mmol/m l L-谷氨酰胺、10%胎牛血清、100U/m l青霉素G、100mg/m l硫酸鏈霉素和0.25mg/m l兩性霉素B) (Gibco，美國)。在細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)傳代。第2-3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分成四組，分別用17β-雌二醇(0nM，0.01nM，0.1nM，1nM)(Sigma，美國)處理。滅活胎牛血清以消除其中的成分對實(shí)驗(yàn)的影響。

1.3 細(xì)胞活力 將細(xì)胞以4×104/m l的密度接種于96孔板(Corning Costar，美國)中，每個(gè)樣樣本設(shè)置六個(gè)副孔。將0.5mg/m l 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethy l thiazol-2-y l)-2,5-dipheny ltetrazolium brom ide，MTT)(Sigma，美國)分別在1、3、5和7天加入到細(xì)胞中。37℃下培養(yǎng)4h。吸出上層液體，加入150μl二甲基亞砜(Sigma，美國)，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm測量各孔的吸光值。

1.4 細(xì)胞生長的測定 將細(xì)胞以2×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在24孔培養(yǎng)板中(Corning Inc，美國)中。24h后，用17β-雌二醇(0nM，0.01nM，0.1nM和1nM)處理細(xì)胞。每組設(shè)置四個(gè)重復(fù)孔。在1、3、5和7天的時(shí)候，用含有0.05%胰蛋白酶及0.02%EDTA的PBS收集細(xì)胞后，用Z2TMCou l t e r Coun t e r?細(xì)胞和粒子計(jì)數(shù)器(Be c kman Coulter，美國)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 堿性磷酸酶活性檢測 在成骨分化培養(yǎng)基(α-MEM 培養(yǎng)基，50mmol/m l抗壞血酸，10nmol/m l地塞米松和10mmol/m l β-甘油磷酸酯)中培養(yǎng)。每組都設(shè)置三個(gè)重復(fù)孔。細(xì)胞生長7天后，收集細(xì)胞并用PBS洗滌兩次，然后加入1% Triton X-100置于4℃裂解細(xì)胞。從每個(gè)裂解物中取出等分樣本，加入r-硝基苯酚磷酸鹽的2-氨基 -2-甲基 -1-丙醇緩沖液(Sigma，美國)，37℃避光孵育1h，加入0.5N NaOH終止反應(yīng)。通過分光光度計(jì)(Bio-tek，美國)讀405nm處的吸光度。堿性磷酸酶活性通過細(xì)胞蛋白含量均化后，表示為OD值/h.mg蛋白。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)分析 將6孔板(Corning，美國)的細(xì)胞用不同劑量17β-雌二醇處理14天后，使用Trizol試劑(Invitrogen，美國)提取總RNA，然后根據(jù)試劑盒說明書使用SuperScriptTMIII第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen，美國)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR?Prem ix實(shí)時(shí)PCR試劑盒(Invitrogen，美國)對骨鈣素(osteocalcin，OCN)的m RNA表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)。基因特異性引物是：OCN上游：ATGAGAGCCC TCACACTCCTCG，下游：GTCAGCCAACTC GTCACAGTCC；內(nèi)參GAPDH上游：GCACCG TCAAGGCTGAGAAC，下游：ATGGTGGTGA AGACGCCAGT。擴(kuò)增條件如下：預(yù)變性95℃5m in，變性95℃變性30s，退火58℃30s及延伸72℃30秒40個(gè)循環(huán)。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 收取上述培養(yǎng)的上清液，根據(jù)試劑盒說明書(Bender Medsystem，美國)檢測RANKL和OPG。將每個(gè)樣本加入指定的孔中各50μl并用蓋板蓋好。室溫孵育3h，將孔洗滌3次。然后，將底物加入孔中。避光室溫10m in后，加入終止溶液終止反應(yīng)。分光光度計(jì)(Bio-tek，美國)在450nm波長測定每個(gè)孔的吸光度值。

1.8 細(xì)胞礦化能力檢測 使用Von Kossa測定法評估細(xì)胞的礦化能力。每組設(shè)6個(gè)副孔，用10mg/m l硝酸銀溶液(Sigm a，美國)覆蓋固定細(xì)胞，UV光下照射1h。漂洗后，加入50mg/m l硫代硫酸鈉溶液(Sigma，美國)2m in，然后再次洗滌。磷酸鹽沉積物染成黑色。選擇每個(gè)孔中的四個(gè)視野計(jì)數(shù)染色的結(jié)節(jié)，結(jié)果用平均每孔染色結(jié)節(jié)數(shù)表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)兩次。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SAS V 8進(jìn)行方差分析檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，P<0.05認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 17β-雌二醇對絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞增殖和活性的影響 隨著體外培養(yǎng)時(shí)間延長，各組細(xì)胞增殖和活性逐漸增加。與空白對照相比，17β-雌二醇處理后絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞的增殖和活性顯著增加(P<0.05)，呈現(xiàn)出17β-雌二醇濃度依賴性(如圖1、圖2)。

圖1 MTT測定17β-雌二醇處理后絕經(jīng)婦女牙槽骨成骨細(xì)胞的細(xì)胞活性結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

圖2 計(jì)數(shù)細(xì)胞測定17β-雌二醇處理后絕經(jīng)婦女牙槽骨成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

2.2 17β-雌二醇對絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞成骨分化的影響 17β-雌二醇對絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞中ALP活性的影響結(jié)果顯示：17β-雌二醇可以增加絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞的ALP活性(P<0.05)(如圖3)。同時(shí)，隨著17β-雌二醇濃度的增加，ALP活性明顯增加。

圖3 17β-雌二醇處理后絕經(jīng)婦女牙槽骨成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

17β-雌二醇可以增加絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞中骨鈣素m RNA水平(P<0.05)，且具有濃度依賴性(如圖4)。

此外，檢測17β-雌二醇對絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞礦化的影響顯示：所有組中的絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞可形成礦化結(jié)節(jié)。與對照組相比，0.01nM 17β-雌二醇對絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞礦化能力無顯著影響，然而，0.1nM和1nM 17β-雌二醇則可明顯提高絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞的礦化能力(P<0.05)(如圖5)。

圖5 Von kossa測定17β-雌二醇處理后絕經(jīng)婦女牙槽骨成骨細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)數(shù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

2.3 17β-雌二醇對絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞的OPG和RANKL的影響 與對照相比，17β-雌二醇可以刺激絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞中OPG表達(dá)升高(P<0.05)(見圖6，空白對照：108.33±15.42pg/m l；0.01nM 17β-雌二醇：118.26±10.16pg/m l；0.1nM 17β-雌二醇：134.22±13.76pg/m l；1nM 17β-雌二醇：157.66±12.34 pg/m l)，但使RANKL表達(dá)降低(P<0.05)且具有濃度依賴性(見圖7，空白對照：76.41±8.22 pg/m l；0.01nM 17β-雌二醇：70.88±7.56 pg/m l；0.1nM 17β-雌二醇：65.32±5.44 pg/m l；1nM 17β-雌二醇：60.01±6.33pg/m l)。絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞經(jīng)17β-雌二醇處理后，OPG/RANKL的比值增加(空白對照：1.42±0.10；0.01nM 17β-雌二醇：1.67±0.10；0.1nM 17β-雌二醇：2.05±0.13；1nM 17β-雌二醇：2.63±0.15)。此外，隨著17β-雌二醇濃度的增加，OPG/RANKL比值增加越明顯(見圖8)。

3.討論

口腔健康是維護(hù)人體健康以及生命質(zhì)量的重要組成部分，晚年的幸福更加需要維護(hù)口腔健康[12]。據(jù)我們之前的一項(xiàng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，老年人牙周炎患病率高且嚴(yán)重，口腔衛(wèi)生保健認(rèn)知也不足，但大多都有意愿接受口腔衛(wèi)生教育和檢查及治療[13]。因此這激發(fā)我們應(yīng)更加關(guān)注老人牙周健康，提出針對他們特點(diǎn)的有效治療方法。

圖6 酶聯(lián)免疫吸附測定17β-雌二醇處理后絕經(jīng)婦女牙槽骨成骨細(xì)胞OPG水平結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

圖7 酶聯(lián)免疫吸附測定17β-雌二醇處理后絕經(jīng)婦女牙槽骨成骨細(xì)胞的RANKL水平結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

圖8 17β-雌二醇處理后絕經(jīng)婦女牙槽骨成骨細(xì)胞的OPG/RANKL比值結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

由于年齡的增長，婦女骨質(zhì)疏松癥或者其他骨流失疾病的發(fā)病率也增加。絕經(jīng)后婦女的雌激素水平顯著下降，這與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病有密切關(guān)系[14]。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，雌激素或激素替代物可用來防止骨的丟失[15]。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，與年輕成年女性相比，老年婦女的AOBs壽命短，細(xì)胞活力低，ALP活性降低，骨形成能力也下降[1]。因此我們猜想絕經(jīng)后婦女的雌激素缺乏可能在這些變化中起重要作用。

雌激素可以通過降低成骨細(xì)胞凋亡[16]以及體內(nèi)和體外抑制成骨細(xì)胞中的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來增加成骨細(xì)胞的壽命[17]。我們的研究結(jié)果顯示雌激素可以增強(qiáng)絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞的細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖，這與其他研究結(jié)果一致[16,17]。絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞的增殖能力下降與絕經(jīng)后的雌激素減少有關(guān)。

雌激素可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。卵巢切除的小鼠，雌激素的終生治療可完全阻止老齡小鼠脛骨骨干皮質(zhì)骨礦化密度以及厚度的降低[18]。經(jīng)皮給藥高劑量雌激素后的老年婦女證實(shí)：雌激素可以刺激骨骼生長終止后的骨形成[19]。在我們的研究中，數(shù)據(jù)顯示，雌激素可以克服絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性下降、骨鈣素的產(chǎn)生以及礦化能力的降低，這說明了絕經(jīng)后婦女的雌激素缺乏導(dǎo)致的絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞的年齡相關(guān)變化類似于其他骨骼骨中的成骨細(xì)胞。

堿性磷酸酶作為一種膜結(jié)合酶，在礦化過程中參與了羥基磷灰石晶體沉積的過程。骨鈣素在成骨細(xì)胞分化的晚期表達(dá)，與礦化有關(guān)。隨著年齡的增長，女性骨髓表達(dá)堿性磷酸酶的集落形成單位的數(shù)量明顯減少[20]。此外，從我們以前的數(shù)據(jù)可知，絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞中的堿性磷酸酶活性降低[1]。目前的數(shù)據(jù)顯示，雌激素增加了堿性磷酸酶和骨鈣素的水平，可以一定程度上解釋用雌激素治療后絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞礦化增加的機(jī)制。

雌激素可改變骨形成的微環(huán)境。RANKL通常由骨髓基質(zhì)/成骨細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞表達(dá)，可導(dǎo)致破骨細(xì)胞的聚集、活性增加以及破骨細(xì)胞凋亡減少[8,9]。OPG由成骨細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，可中和RANKL在骨微環(huán)境中的功能。OPG/ RANKL比率決定骨形成或吸收的方向：OPG/ RANKL比例增加會導(dǎo)致骨形成，否則發(fā)生骨吸收。因此，我們檢測了17β-雌二醇處理后OPG、RNAKL和OPG/RANKL比例的變化。如其它的研究所述[8-11]，我們的數(shù)據(jù)表明17β-雌二醇可以增加OPG的表達(dá)，抑制RANKL的表達(dá)，OPG/ RANKL比值增加。因此，老年婦女的雌激素缺乏導(dǎo)致了OPG/RANKL比例的改變，有利于骨吸收，終將導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。同樣雌激素的缺乏不利于牙槽骨的再生。我們的研究顯示：雌激素替代物可能有助于牙周的治療，例如在老年婦女的骨再生和骨植入中應(yīng)用，但這仍需要進(jìn)一步探索。

4.結(jié)論

17β-雌二醇不僅可以增強(qiáng)絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖、成骨分化和礦化能力，而且可以提高絕經(jīng)婦女牙槽成骨細(xì)胞的OPG/RANKL比例，為絕經(jīng)婦女牙周骨再生治療提供重要的參考。

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The effects of 17β-estradiol on the biological activity of alveolar osteoblasts in postmenopausal women

SONG Li-ting,ZHU Dong-wang,LI Jia-shan,WU Chen-xuan,JIANG Shao-yun
(Department of Periodontology, Hospital of Stomatology,School of Dentistry,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China)

Objective:This study was to observe the biological characteristics of alveolar osteoblasts in postmenopausal women after 17β-estradiol treatment,in order to elucidate the function of estrogen onalveolar osteoblasts in postmenopausal women.Methods:Alveolar osteoblasts from postmenopausal women donors(aged 63-72 years)were cultured in vitro. A fter treated w ith 17β-estradiol(0.01 nM,0.1 nM,1 nM),alveolar osteoblasts in postmenopausal women were evaluated the proliferation and viability,osteogenic differentiation,osteoprotegerin(OPG)and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand(RANKL)levels by using MTT and cell grow th assay,alkaline phosphatase assay,real-time polymerase chain reaction,von Kossa assay and enzyme-linked immunosorbent assay.Results:A fter treated w ith 17β-estradiol, alveolar osteoblasts in postmenopausal women showed obvious higher ability of cell proliferation and viability,alkaline phosphatase,osteocalcin and m ineralization,which increased in 17β-estradiol concentration-dependent manner.Meanwhile, the level of OPG increased and the level of RANKL decreased in 17β-estradiol dose-dependent manner,resulting in OPG/RANKL ratio increase.Conclusions:17β-estradiol could not only enhance osteoblasts proliferation and viability, osteogenic differentiation,but also improve the m icroenvironment of alveolar bone regeneration from postmenopausal women,which provides important information for bone regeneration of periodontal treatment in postmenopausal women.

alveolar bone;ssteoblasts;17β-estradiol;postmenopausal

R781.4

A

1672-2973(2017)03-0175-06

2017-01-26)

宋立婷 天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科 碩士生 天津 300070

朱東望 天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科 副主任醫(yī)師 天津 300070

李佳珊 天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科 碩士生 天津 300070

吳陳炫 天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科 主治醫(yī)師 天津 300070

蔣少云 通訊作者 天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科 主任醫(yī)師 教授 天津 300070