一株產(chǎn)α-淀粉酶芽孢桿菌的分離及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

依妮皮姑麗·麥麥提依明 ，艾麥爾江·麥提庫(kù)爾班 ，阿依安·布胡達(dá)西 ，迪力木拉提·木合塔爾 ，迪麗拜爾·托乎提

(新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院極端環(huán)境微生物多樣性實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054)

一株產(chǎn)α-淀粉酶芽孢桿菌的分離及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

依妮皮姑麗·麥麥提依明 ，艾麥爾江·麥提庫(kù)爾班 ，阿依安·布胡達(dá)西 ，迪力木拉提·木合塔爾 ，迪麗拜爾·托乎提

(新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院極端環(huán)境微生物多樣性實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054)

以篩選與鑒定尉犁縣黑湖產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌，并對(duì)篩選出的細(xì)菌進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化為研究目的，從43株細(xì)菌中篩選出淀粉酶高產(chǎn)菌株 HM-22，并對(duì)其進(jìn)行了菌株形態(tài)學(xué)鑒定、16S r DNA 分子鑒定以及產(chǎn)酶條件優(yōu)化。從尉犁縣黑湖采樣的30個(gè)水、土和泥樣樣品中分離篩選43株細(xì)菌，從中篩選出14株產(chǎn)淀粉酶的菌株，采用Yoo改良法對(duì)產(chǎn)透明圈較大的菌株進(jìn)行酶活力測(cè)定，從中篩選出了一株產(chǎn)酶活性較高的菌株HM-22。經(jīng)革蘭氏染色、菌落形態(tài)觀察、生理生化檢測(cè)和16S r DNA 序列比對(duì)鑒定該菌與Bacillustequilensis的相似性為99.8%，屬于芽孢桿菌屬。對(duì)菌株HM-22產(chǎn)酶條件進(jìn)行初步優(yōu)化確定其產(chǎn)酶的最佳條件是：該菌產(chǎn)淀粉酶最適溫度為40 ℃，最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為牛肉膏，最適反應(yīng)pH為6.0，最適產(chǎn)酶培養(yǎng)時(shí)間為24 h。優(yōu)化后菌株HM-22的酶活力從最初的的酶活力122.45 U/mL達(dá)到147.53 U/mL，酶活力提高了17%。該研究為從新疆鹽湖細(xì)菌中篩選淀粉酶活力較高的菌種資源及應(yīng)用提供了理論依據(jù)和參考。

尉犁縣黑湖；芽孢桿菌；α-淀粉酶；酶活力測(cè)定；產(chǎn)酶條件優(yōu)化

α-淀粉酶能分解淀粉為糊精、低聚糖和單糖類[1]。α-淀粉酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中[2]，在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用很廣泛[3]，是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑之一[4]，在洗滌劑工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、糧食加工、食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵和紡織品工業(yè)等行業(yè)中都有非常重要的應(yīng)用[5-6]。1894年，從真菌中鑒定和分離出淀粉酶，并用于酶制劑和添加劑中。之后，淀粉酶得到了廣泛的應(yīng)用，并吸引了研究人員的關(guān)注[7]。微生物優(yōu)選為淀粉酶的生產(chǎn)者，原因是與其他生產(chǎn)者植物和動(dòng)物相比，其有易處理、易培養(yǎng)和成本少的優(yōu)點(diǎn)[8-9]。自然界有許多微生物都能夠產(chǎn)淀粉酶，如根霉、曲霉、芽孢桿菌等[10]。目前，已報(bào)道的能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物種屬有不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter、微球菌屬M(fèi)icrococcus、黃隱球酵母Cryptococcusflavus、鹽單胞菌屬Halomonasmeridiana、青霉菌屬Penicillum、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、鏈霉菌屬Streptomyces、假單胞菌屬Pseudoalteromonas和桿菌屬Bacillus等[11-13]。淀粉酶的生產(chǎn)主要依靠微生物發(fā)酵，國(guó)外的研究已經(jīng)達(dá)到了產(chǎn)α-淀粉酶的調(diào)控基因的水平，還研究了與這些相關(guān)的基因克隆及轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)化等技術(shù)。把芽孢桿菌重組體的基因引入生產(chǎn)用的菌株體內(nèi)，使α-淀粉酶的產(chǎn)量提高了幾十倍到幾百倍，為選育高產(chǎn)α-淀粉酶菌株奠定了很好的基礎(chǔ)。目前投入商業(yè)化生產(chǎn)的α-淀粉酶生產(chǎn)菌株幾乎都是從自然界分離得到的野生型菌株，因此不斷從自然界中分離淀粉酶產(chǎn)生菌，探索并優(yōu)化其最佳產(chǎn)酶條件有重要意義[14]。為從新疆鹽湖細(xì)菌中篩選并獲得淀粉酶活力較高的菌種資源，并為其應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考，我們從新疆尉犁縣黑湖采集的水、土和泥樣中分離產(chǎn)淀粉酶的菌株，通過(guò)酶活力測(cè)定，篩選出較高活性的菌株，并進(jìn)行分類鑒定，利用液體發(fā)酵法對(duì)產(chǎn)α-淀粉酶培養(yǎng)基發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究，對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

采樣地點(diǎn)為新疆尉犁縣黑湖(86°47′40″E、41°14′09″N至86°52′10.7″E、41°13′11.7″N)。以湖心為出發(fā)點(diǎn)，圍繞湖心按不同距離東、南、西、北方向不同深層取表層下10、20、40、60 cm深度水樣、土樣和泥樣，水樣pH為5.26～6.90， 湖心周邊土樣pH為6.5～6.9，泥樣pH為6.0～6.9，鹽度為25%～28%，樣品點(diǎn)海拔高度為853～855 m。樣品裝入無(wú)菌試樣袋密封，保存溫度4 ℃。

1. 2 培養(yǎng)基

分離和保藏培養(yǎng)基：可溶性淀粉2 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉 10 g、蒸餾水1 000 m L，pH 7.0～7.2，固體加入15～20 g瓊脂，1×105Pa滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉2 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 000 m L，pH 7.0～7.2，1×105Pa滅菌30 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選 將活化的菌株點(diǎn)樣于分離和保藏培養(yǎng)基平板上，4 ℃恒溫培養(yǎng) 24 h左右，加入 Lugol 氏碘液，菌落周圍出現(xiàn)水解透明圈的為淀粉酶陽(yáng)性。牛津杯法進(jìn)行復(fù)篩，即取適量菌株上清液于牛津杯淀粉酶篩選平板上，加入Lugol 氏碘液，用游標(biāo)卡尺測(cè)定透明圈大小。

1.3.2 菌株培養(yǎng)和淀粉酶的提取 以5%的接種量接種到50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度37 ℃，搖床培養(yǎng)20 h，8 000 r/min，離心15 min，取上清液為淀粉酶粗提液。

1.3.3 淀粉酶活性的測(cè)定 發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min冷凍離心20 min，取上清液即為粗酶液。采用Yoo改良法[15]測(cè)定α-淀粉酶酶活力：取1 mg/mL可溶性淀粉溶液5 mL，在37 ℃水浴中預(yù)熱10 min，加入1 mL磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖液(pH 7.0)，加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的粗酶液1 mL，37 ℃水浴振蕩，精確反應(yīng)5 min后，用0.1 mol/L 硫酸5 mL終止反應(yīng)。取1 mL反應(yīng)液與5 mL稀碘液顯色，在620 nm處測(cè)定光密度。以1 mL水替1 mL反應(yīng)液為空白，以不加酶液(加同體積的緩沖液)的管為對(duì)照。酶活力根據(jù)以下公式計(jì)算：

酶活力(U)=(R0-R)× 50×D/R0

式中R0，R分別表示對(duì)照液和反應(yīng)液的吸光度，D為酶的稀釋倍數(shù)。酶活定義為在37 ℃，pH值7.0條件下，5 min內(nèi)水解l mg淀粉的酶量為一個(gè)活力單位。

1.3.4 形態(tài)學(xué)鑒定 通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)菌體形態(tài)進(jìn)行觀察。將菌株劃線接種于分離和保藏培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)1 d，觀察單菌落的形狀、大小、透明度、顏色、邊緣和表面特征。

1.3.5 菌株生理生化鑒定 參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[16]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[17]對(duì)篩選出的淀粉酶活力高的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)描述和生理生化鑒定。生理生化鑒定中，分別對(duì)目的菌株進(jìn)行硝酸鹽還原試驗(yàn)，淀粉水解試驗(yàn)，酪蛋白水解試驗(yàn)，酯酶水解試驗(yàn)，過(guò)氧化氫酶水解實(shí)驗(yàn)，耐高溫實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)，營(yíng)養(yǎng)型測(cè)定實(shí)驗(yàn)，明膠液化，觸酶實(shí)驗(yàn)，檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)，運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 16S r DNA的鑒定和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 利用傳統(tǒng)的CTAB法[18]提取DNA。提取分離出的菌株基因組DNA為模板，使用細(xì)菌通用引物27F(5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5′- GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，以目的菌株的基因組DNA為模板，對(duì)該菌株16S r DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為50 μL反應(yīng)體系，其中，預(yù)變性 94 ℃ 45 s，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 15 s，30個(gè)循環(huán)，延伸72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化和測(cè)序。將獲得的序列提交至EzTaxon-e數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似度比較(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)(Kim et al.,2012)。通過(guò)ClustalW1.6軟件包進(jìn)行多序列匹配排列(http://www.ebi.ac.uk/Tools/ clustalw1.6/)。采用MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)相關(guān)軟件刪除序列匹配排列中的插入和缺失，根據(jù)“Kimura雙參數(shù)”方式，通過(guò)序列數(shù)據(jù)計(jì)算進(jìn)化距離。選擇鄰近連接法(Neighbour-Joining)對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行估算，通過(guò)1 000次取樣確定。

1.3.7 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1) 最適培養(yǎng)時(shí)間。菌株活化后，以5%的接種量接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度為37 ℃，恒溫?fù)u床培養(yǎng)12、16、20、24、28、32、36 h后，制備粗酶液，然后用Yoo改良法測(cè)定每個(gè)時(shí)間段的α-淀粉酶活力，研究培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響并確定最適的培養(yǎng)時(shí)間。

2)最適pH值。菌株活化后，以5%的接種量分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度為37 ℃，恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，在pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的條件下用Yoo改良法測(cè)定不同反應(yīng)系統(tǒng)pH的α-淀粉酶活力，研究反應(yīng)系統(tǒng)pH對(duì)酶活力的影響并確定最適pH。

3) 最適溫度。菌株活化后，以5%的接種量分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度為37 ℃，恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，在溫度30、35、40、45、50 ℃的條件下用Yoo改良法測(cè)定不同反應(yīng)系統(tǒng)溫度的α-淀粉酶活力，研究反應(yīng)系統(tǒng)溫度對(duì)酶活力的影響并確定最適溫度。

4)最佳碳源。菌株活化后，以5%的接種量接種到碳源分別為可溶性淀粉、糊精、葡萄糖和蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度37 ℃，恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h后，制備粗酶液，用Yoo改良法測(cè)定每個(gè)不同碳源培養(yǎng)的菌株的α-淀粉酶活力，測(cè)定培養(yǎng)基碳源對(duì)酶活力的影響并確定最佳碳源。

5)最佳氮源。菌株活化后，以5%的接種量接種到碳源分別為牛肉膏、明膠、尿素和硫酸銨的發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度為37 ℃，恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h后，制備粗酶液，用Yoo改良法測(cè)定每個(gè)不同氮源培養(yǎng)的菌株的α-淀粉酶活力，測(cè)定培養(yǎng)基氮源對(duì)酶活力的影響并確定最佳氮源。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

通過(guò)菌株產(chǎn)透明圈初篩，從43株細(xì)菌中篩選獲得14株產(chǎn)淀粉酶菌株。其中HM-2、HM-22、HM-31的水解圈直徑大于2 cm，確定為復(fù)篩菌株。通過(guò)3次測(cè)酶活力，HM-2、HM-22和HM-31的平均酶活力分別為119.32、122.45和106.49 U·mL-1，可見(jiàn)，菌株HM-22 的α-淀粉酶酶活力最高。

2.2 菌株的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定

光學(xué)顯微鏡下，菌株 HM-22 呈短桿狀，端圓，單個(gè)排列。平板劃線培養(yǎng)1 d后，菌落呈扁形、直徑0.2 ～0.3 cm、表面干、邊緣不完整、稍有隆起、顏色為乳白色、不透明、革蘭氏陽(yáng)性菌。菌株HM-22形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定，見(jiàn)表1和表2。

表1 菌株HM-22的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of HM-22

表2 菌株HM-22的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical tests of HM-22

2.3 16S r DNA序列測(cè)定

使用細(xì)菌通用引物對(duì)HM-22的16S r DNA 序列進(jìn)行測(cè)序，PCR擴(kuò)增得到約1.5 kb的16S r DNA片段，將獲得的序列提交至EzTaxon-e 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)(Kim et al., 2012)，調(diào)出相似性最高相關(guān)菌株的16S rDNA 序列，與芽孢桿菌的同源性為99.8%，其中與菌株Bacillustequilensis(AYTO01000043)的相似性最高。將菌株HM-22的16S r DNA 序列與 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中部分細(xì)菌 16S r DNA 序列，通過(guò)ClustalW1.6軟件包進(jìn)行多序列匹配排列，應(yīng)用 MAGA6.06 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹( 圖 1) 。結(jié)果顯示，菌株 HM-22(KX866452)與芽孢桿菌屬中的細(xì)菌有較近的親緣關(guān)系，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化及分子鑒定結(jié)果初步確定該菌為芽孢桿菌Bacillustequilensis。

圖1 菌株HM-22的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain HM-22

2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 最佳產(chǎn)酶時(shí)間的確定 菌株 HM-22在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，用Yoo改良法分別在12、16、20、24、28、32、36 h時(shí)測(cè)定α-淀粉酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí)酶活力最高，為147.53 U/mL，菌株HM-22的最佳培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

圖2 菌株HM-22淀粉酶最佳產(chǎn)酶時(shí)間的確定結(jié)果Fig.2 The determination of optimal time in producing amylase by Bacterium HM-22

2.4.2 最適PH值 把反應(yīng)系統(tǒng)的緩沖液pH分別調(diào)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0接種菌株HM-22后，用Yoo改良法分別測(cè)定α-淀粉酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可看出， pH為6.0時(shí)，株菌HM-22的酶活力達(dá)到最高值，為147.53 U/mL。當(dāng)pH>6 時(shí)，酶活力明顯降低?？梢?jiàn)，該菌株對(duì)pH值有一定的耐受范圍，但較強(qiáng)的堿性環(huán)境不利于菌株產(chǎn)淀粉酶，酶活力的最適pH為6.0。

圖3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株HM-22產(chǎn)酶能力的影響Fig.3 The impact of initial pH on Bacterium HM-22 in producing amylase

2.4.3 最適溫度 將測(cè)定酶活力反應(yīng)系統(tǒng)的溫度分別調(diào)到30、35、40、45、50 ℃用Yoo改良法分別測(cè)定α-淀粉酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可看出，溫度為40 ℃時(shí)株菌HM-22 α-淀粉酶活力達(dá)到最高值，為147.53 U/mL。隨著溫度的升高酶活力逐漸降低，50 ℃時(shí)淀粉酶活性基本上失活，酶活力非常低，由此可以確定菌株HM-22 α-淀粉酶活力的最適溫度為40 ℃。

2.4.4 最適碳源 改變菌株的碳源，分別把可溶性淀粉、糊精、葡萄糖和蔗糖作為碳源培養(yǎng)菌株24 h后用Yoo改良法測(cè)定α-淀粉酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可看出，以可溶性淀粉為碳源時(shí)菌株HM-22的α-淀粉酶活力最高，為135.35 U/mL；以糊精作碳源時(shí)，菌株HM-22的α-淀粉酶活力下降為109.24 U/mL；以葡萄糖為碳源時(shí)，菌株HM-22的酶活力為65.1 U/mL；以蔗糖為碳源時(shí)，菌株HM-22的α-淀粉酶活力為121.82 U/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，可能是由于可溶性淀粉是淀粉酶的底物，能夠誘導(dǎo)淀粉酶的合成，導(dǎo)致菌株HM-22的最佳碳源是可溶性淀粉。

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株HM-22產(chǎn)酶活力的影響Fig.4 The impact of culture temperature on Bacterium HM-22 inproducing amylase

圖5 碳源對(duì)菌株HM-22產(chǎn)酶能力的影響Fig.5 The impact of carbon source on Bacterium HM-22 in producing amylase

2.4.5 最適氮源 改變菌株的氮源，分別把牛肉膏、明膠、尿素和硫酸銨作為氮源培養(yǎng)菌株24 h后用Yoo改良法測(cè)定α-淀粉酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可看出，以牛肉膏為氮源時(shí)菌株HM-22的α-淀粉酶活力最高，為132.54 U/mL，以明膠作氮源時(shí)菌株HM-22的α-淀粉酶活力下降為96.39 U/mL，以尿素為氮源時(shí)菌株HM-22的α-淀粉酶活力為39.92 U/mL，以硫酸銨為氮源時(shí)菌株HM-22的酶活力為46.18 U/mL。牛肉膏為氮源時(shí)酶活性最強(qiáng)，究其原因，是牛肉膏中含有生長(zhǎng)因子，有利于菌體的生長(zhǎng)，故菌株HM-22的最佳氮源是牛肉膏。

圖6 氮源對(duì)菌株HM-22產(chǎn)酶能力的影響Fig.6 The impact of nitrogen source on Bacterium HM-22 in producing amylase

3 結(jié)果與討論

本研究從新疆尉犁縣黑湖采樣的30個(gè)土樣、水樣和泥樣樣品中分離篩選出43株細(xì)菌，通過(guò)產(chǎn)淀粉酶透明圈大小初篩和牛津杯復(fù)篩從中篩選出14株產(chǎn)淀粉酶的菌株，采用Yoo改良法對(duì)產(chǎn)透明圈較大的菌株進(jìn)行酶活力測(cè)定，并篩選出了一株產(chǎn)酶活性較高的菌株HM-22。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S r DNA 分子鑒定HM-22(KX866452)與Bacillustequilensis的相似性為99.8%，初步鑒定為芽孢桿菌屬。對(duì)菌株HM-22產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化后得到最佳產(chǎn)酶條件：產(chǎn)淀粉酶最適溫度為40 ℃，最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為牛肉膏，最適反應(yīng)pH為6.0，最適產(chǎn)酶培養(yǎng)時(shí)間為24 h。優(yōu)化后HM-22菌株的酶活力達(dá)147.53 U/mL，提高了17%。該菌株如果再進(jìn)一步進(jìn)行誘變處理和重組表達(dá)[24]，酶活力還有提升的空間。

目前，不少芽孢桿菌應(yīng)用到工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境修復(fù)等各個(gè)領(lǐng)域，對(duì)人類與社會(huì)做出了巨大的貢獻(xiàn)[19-20]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，芽孢桿菌在抗癌試驗(yàn)中具有轉(zhuǎn)化產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的特性，其中有些轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可以抑制人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞和人乳腺細(xì)胞[21]，有些芽孢桿菌在生防功能方面也突顯重要的功能[22]。水解淀粉芽孢桿菌在自然界中分布十分廣泛[23]。雖然很多研究者從芽孢桿菌中分離出產(chǎn)淀粉酶菌株并進(jìn)行了性質(zhì)研究，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)生產(chǎn)對(duì)產(chǎn)酶菌株需求和酶性質(zhì)的要求。產(chǎn)淀粉酶菌種資源探索備受矚目，有更多的具有高活性的具應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)淀粉酶微生物被不斷分離，其各類功能和活性物質(zhì)必定會(huì)進(jìn)一步闡明，其應(yīng)用前景更加廣闊。為從新疆鹽湖細(xì)菌中篩選獲得淀粉酶活力較高的菌種資源，并為其應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考，本研究從新疆尉犁縣黑湖采集的水、土和泥樣中分離出產(chǎn)淀粉酶的菌株，通過(guò)酶活力測(cè)定，篩選出較高活性的菌株，進(jìn)行分類鑒定，利用液體發(fā)酵法對(duì)產(chǎn)α-淀粉酶培養(yǎng)基發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究，并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行了初步探討。從該地區(qū)芽孢桿菌中分離的淀粉酶優(yōu)化的最佳條件在氮源、碳源、pH、酶的反應(yīng)溫度以及產(chǎn)酶最佳時(shí)間等方面，和已報(bào)到的產(chǎn)酶條件相比，有一定的相似性和個(gè)別差異[14,24]，該研究為淀粉酶產(chǎn)生的不同優(yōu)化最佳條件提供重要參數(shù)。

[1] RAMESHKUMAR A，SIVASUDHA T. Optimization of nutritional constitute for enhanced α-amylase production by solid state fermentation technology[J]. International Journal of Microbiological Research,2011,2 (2)：143-148.

[2] SETHI BIJAY K, JANA ARIJIT, NANDA PRATIVA K, et al. Production of α-amylase by aspergillus terreus NCFT 4269.10 using pearl millet and its structural characterization[J]. Frontiers in Plant Science, 2016, 7：1-13.

[3] 岳壽松, 邊斐, 代運(yùn)章,等. 產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶芽孢桿菌SDYB-1的分子鑒定及酶學(xué)性能研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,11:54-59. YUE Shousong，BIAN Fei，DAI Yunzhang, et al. Molecular identification of protease and amylase secretingBacillussubtilisSDYB-1andcharacterizationsofenzymes[J].ShandongAgriculturalSciences, 2015, 11:54-59.

[4] 陳約慧, 陳穎聰, 劉冬冬,等. 一株高產(chǎn)淀粉酶的解淀粉芽胞桿菌的分離鑒定及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2011, 23(6):505-510.CHENYuehui,CHENYingcong,LIUDongdong,etal.Isolationandidentificationofawildamylase-producingbacteriumandoptimizationofitsfermentableconditions[J].ChineseJournalofMicroecology, 2011, 23(6):505-510.

[5] 陳相達(dá), 戴慧慧, 劉燕,等. 一株高產(chǎn)淀粉酶枯草芽孢桿菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 41(1):40-43.CHENXiangda,DAIHuihui,LIUYan,etal.ScreeningandidentificationofawildBacillussubtiliswith high amylase activity and optimization of its enzyme-producing conditions[J]. Journal of Wenzhou Medical College, 2011, 41(1):40-43.

[6] POHL S, HARWOOD C R. Heterologous protein secretion bybacillusspeciesfrom the cradle to the grave.[J]. Advances in Applied Microbiology, 2010, 73(10):1-25.

[7] RAUL D, BISWAS T, MUKHOPADHYAY S, et al. Production and partial purification of alpha amylase fromBacillussubtilis(MTCC 121) using solid state fermentation[J]. Biochemistry Research International, 2014(2): 1-5.

[8] RAJAGOPALAN G, KRISHNAN C. α-Amylase production from catabolite derepressedBacillussubtilis, KCC103 utilizing sugarcane bagasse hydrolysate[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(8):3044-3050.

[9] REDDY N S, NIMMAGADDA A, RAO K R S S. An overview of the microbial α-amylase family[J]. African Journal of Biotechnology, 2004, 2(12):645-648.

[10] 庫(kù)米拉·馬吉提, 王偉, 張曉燕,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)低溫淀粉酶的工藝條件[J]. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 35(6):478-483. KUMILA Majiti, WANG Wei, ZHANG Xiaoyan,et al. Optimization of cold temperature amylase ofBacillussubtilisby response surfas [J]. Journal of Xinjiang Agricultural University, 2012, 35(6):478-483.

[11] 陳吉?jiǎng)? 張蓉蓉, 楊季芳,等. 北冰洋產(chǎn)淀粉酶海洋細(xì)菌的篩選與鑒定及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(1):53-55. CHEN J G, ZHANG R R,YANG J F, et al. Screening and identification of amylase producing strain from Arctic Sea[J] . Journal of Anhui Agri, 2011, 39(1):53-55.

[12] PLOSS T N, REILMAN E, MONTEFERRANTE C G, et al. Homogeneity and heterogeneity in amylase production byBacillussubtilisunder different growth conditions[J]. Microbial Cell Factories, 2016, 15(1):1-16.

[13] CHAI K P, OTHMAN N F B, TEH A H, et al. Crystal structure ofAnoxybacillusα-amylase provides insights into maltose binding of a new glycosyl hydrolase subclass[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 1-10

[14] 闕祖俊, 劉趙玲, 李文婷,等. 一株α-淀粉酶生產(chǎn)菌的分離鑒定及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]. 浙江萬(wàn)里學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 23(5):83-89. QUE Zujun, LI Wenting, LIU Zhaoling,et al. Isolation and identification of an α-amylase-producing bacteria strain and optimization of its fermentation conditions[J]. Journal of Zhejiang Wanli University, 2010, 23(5):83-89.

[15] 李力. 高淀粉酶蛋白酶活力枯草芽孢桿菌的選育及酶基因陽(yáng)性克隆的篩選[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),2009. LI Li. Breeding ofBacillussubtiliswithhigh-activityofamylase,proteaseandscreeningofpositiveclonesofenzymegenes[D].Urumqi：XinjiangAgriculturalUniversity, 2009.

[16] 東秀珠,蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001.DONGXZ,CAIMY.Theidentificationmanualofsystematicbacteriology[M].Beijing:SciencePress, 2001.

[17] 布坎南,吉本斯.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè) [M]. 8版.北京:科學(xué)出版社, 1984.BUCHANANRE,GIBBONSNE.Bergey′smanualofdeterminativebacteriology[M]. 8thed.Beijing:SciencePress, 1984.

[18]delSALG,MANFIOLETTIG,SCHNEIDERC.Aone-tubeplasmidDNAmini-preparationsuitableforsequencing[J].NucleicAcidsRes, 1988,16(20):9878.

[19] 王曉閣. 枯草芽孢桿菌研究進(jìn)展與展望[J]. 中山大學(xué)研究生學(xué)刊(自然科學(xué)), 2012(3):14-23.WANGXiaoge.ResearchprogressandprospectofBacillussubtilis[J].SunYat-SenUniversity：JournalofTheGraduates(NaturalSciences、Medicine), 2012(3):14-23.

[20] 劉國(guó)紅, 林乃銓, 林營(yíng)志,等. 芽孢桿菌分類與應(yīng)用研究進(jìn)展[C]∥蘭州: 第三屆全國(guó)微生物資源學(xué)術(shù)暨國(guó)家微生物資源平臺(tái)運(yùn)行服務(wù)研討會(huì),2011:238.LIUGuohong,LINNaiquan,LINYingzhi,etal.AdvancesintaxonomyandapplicationofgenusBacillus[C]∥Lanzhou：The3rdNationalConferenceofMicrobialResources-PlatformServices,2011:238.

[21] 黃捷, 楊國(guó)新, 金東偉,等.巨大芽孢桿菌轉(zhuǎn)化雷帕霉素的研究 [C]∥ 蘭州: 第三屆全國(guó)微生物資源學(xué)術(shù)暨國(guó)家微生物資源平臺(tái)運(yùn)行服務(wù)研討會(huì), 2011:268.HUANGJie,YANGGuoxin,JINDongwei,etal.RapamycinbyBacillusmegaterium[C]∥ Lanzhou：The 3rd National Conference of Microbial Resources-Platform Services, 2011:268.

[22] 劉貫鋒, 朱育菁, 劉國(guó)紅,等. 芽孢桿菌分類學(xué)特征及其生防功能菌株的篩選[C]∥ 蘭州: 第三屆全國(guó)微生物資源學(xué)術(shù)暨國(guó)家微生物資源平臺(tái)運(yùn)行服務(wù)研討會(huì),2011:242. LIU Guanfeng, ZHOU Yujing, LIU Guowei, et al. Taxonoimic characteristics ofBacillusgenusandscreeningofbiocontrolstrains[C].Lanzhou：The3rdNationalConferenceofMicrobialResources-PlatformServices, 2011:242.

[23] 馬曉梅, 趙輝. 淀粉酶產(chǎn)生菌MSP13篩選及其產(chǎn)酶條件初步優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(11):177-181.MAXiaomei,ZHAOHui.Screeningofamylase-producingstrainMSP13andoptimizationoffermentationconditions.[J]FoodScience, 2015, 36(11):177-181.

[24] 胡博, 劉逸寒, 路福平,等. 枯草芽孢桿菌工程菌產(chǎn)耐酸性高溫α-淀粉酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].天津科技大學(xué)學(xué)報(bào),2012,6(27) :1-6.HUBo,LIUYihan,LUFuping,etal.Optimizationoffermentationconditionsforacid-resistantandheat-stableα-amylaseproductionwithengineeredstrainBacillussubtilis[J]. Journal of Tianjin University of Science and Technology, 2012, 6(27) :1-6.

Isolation of an α-amylase producing Bacillus and optimization of its fermentation conditions

MEMETIMIN Henipigul, METQURBAN Emerjan, BUGHDASH Ayan, MUHTAR Dilmurat, TOHTY Dilbar

(School of Life Science, Xinjing Normal University, Urumqi 830054, China)

The purpose of the study is to screen and identify amylase producing bacteria in the Black Lake in Yuli county, and to optimize the conditions of enzyme production. A high amylase producing strain HM-22 was screened from 43 strains of bacteria, has carried out morphological identification, molecular identification of 16S rDNA and optimization of enzyme production conditions were carried out. 43 strains of bacteria were isolated from 30 water, soil and mud samples in the Black Lake in Yuli County, and 14 strains producing amylase were screened out. The enzyme activity was determined by Yoo method, a strain with high enzyme activity was obtained and named as HM-22. By gram staining, colony morphology observation, physiological and biochemical tests, 16S rDNA sequence alignment and the similarity ofBacillustequilensiswas 99.8%, belonging to the genusBacillus. The optimization of enzyme production conditions of strain HM-22 was determined and the best condition for producing the enzyme is: the optimum temperature of amylase production was 40 ℃, the optimal carbon source is soluble starch, the optimal nitrogen source was beef extract, the optimum reaction pH was 6.0, the optimum culture time was 24 h. After optimization, the enzyme activity of strain HM-22 reached 147.53 U/mL from the initial activity of 122.45 U/mL, enzyme activity increased by 17%. The study provides a theoretical basis and reference for the screening of strains with high amylase activity in Xinjiang salt lake bacteria

Black Lake in Yuli County;Bacillus; alpha-amylase; enzyme activity determination; optimization of enzyme production conditions

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.04.020

2016-09-09 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31260002)

依妮皮姑麗·麥麥提依明(1988年生)，女；研究方向：極端環(huán)境微生物; E-mial:13669958015@163.com

迪麗拜爾·托乎提(1960年生)，女；研究方向：極端環(huán)境微生物; E-mial:dilbar.th@163.com

Q939.9

A

0529-6579(2017)04-0126-07