大黃主要蒽醌類成分的閃式提取及HPLC檢測(cè)

李智平，劉發(fā)生，田青平，韓利文，劉可春，張愛平

1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西太原 030001；2.山東科學(xué)院生物研究所（山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），山東濟(jì)南250014

大黃主要蒽醌類成分的閃式提取及HPLC檢測(cè)

李智平1,2，劉發(fā)生1,2，田青平1，韓利文2，劉可春2，張愛平1

1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西太原 030001；2.山東科學(xué)院生物研究所（山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），山東濟(jì)南250014

目的建立簡(jiǎn)便的閃式提取法提取中藥大黃中蒽醌類成分，并用HPLC法測(cè)定其中5種主要游離蒽醌的含量，為大黃蒽醌類化合物高效提取和工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。方法建立閃式提取法提取大黃中蒽醌類成分，與常規(guī)的回流提取法進(jìn)行比較研究，采用C18色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，建立HPLC檢測(cè)方法，同時(shí)檢測(cè)五種蒽醌的含量，并比較兩種方法的提取效率。結(jié)果建立的HPLC法能夠同時(shí)檢測(cè)5種蒽醌成分，方法準(zhǔn)確、可靠。與回流提取方法比較，閃式提取法在短時(shí)間內(nèi)可以達(dá)到相近的提取率，顯示了閃式提取大黃蒽醌類化合物的優(yōu)勢(shì)。結(jié)論在相同實(shí)驗(yàn)條件下，閃式提取法顯示了快速簡(jiǎn)便、節(jié)能高效的特點(diǎn)，可為大黃蒽醌類有效成分成分的高效提取和工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

大黃；蒽醌；閃式提?。籋PLC；回流提取

大黃有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)及利濕退黃的功效[1]。大黃中提取分離得到的最主要的活性成分是蒽醌及其苷類等[2]。大黃的提取方法文獻(xiàn)已經(jīng)有很多報(bào)道，各種方法對(duì)大黃中蒽醌類成分的提取率都有不同的影響。傳統(tǒng)煎煮法提取由于受熱時(shí)間過長(zhǎng)，大黃蒽醌成分的提取率會(huì)降低，同時(shí)受熱會(huì)破壞物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而使其活性減弱[3]。熱回流法提法一般需要多次回流[4]，工藝過程相對(duì)復(fù)雜，提取還需用到有毒害危險(xiǎn)的化學(xué)試劑，如氯仿，乙醚等，限制了其在提取生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用。超聲法提取大黃粉末的粒度要求高[5]，也存在耗時(shí)長(zhǎng)的問題。閃式提取是一種新型的提取技術(shù)，在短時(shí)間內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)成分的快速提取[6]。該實(shí)驗(yàn)建立了閃式提取法對(duì)大黃蒽醌類成分進(jìn)行提取，并與回流提取進(jìn)行比較研究，為大黃蒽醌類成分的高效提取和工業(yè)生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)依據(jù)。

1 儀器和試藥

主要設(shè)備：閃式提取器（河南金鼐科技發(fā)展有限公司）。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化），真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），高效液相色譜儀(日本日立公司)。

對(duì)照品：大黃素，大黃酚，大黃酸，蘆薈大黃素和大黃素甲醚購于中國藥品生物制品檢定所，純度均＞98%。一般試劑：磷酸，乙醇、甲醇為市售分析純。大黃藥材購于濟(jì)南市建聯(lián)中藥店，由山東省科學(xué)院生物研究所劉可春研究員鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：迪馬C18色譜柱，以乙腈(A)－0.1%磷酸水溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～10 min，52%A；10～25 min，52%～82%A；25～30 min，82%～90%A；30～35 min，90%A)，流速：1mL/min，室溫，進(jìn)樣量：10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。 此條件下，樣品中的目標(biāo)物質(zhì)都得到充分的分離。

2.2 大黃粉末的提取

閃式提取：干燥的大黃藥材粉碎，過4號(hào)篩，稱取粉末5.0 g，準(zhǔn)確稱量，加入70%乙醇500 mL，放置在閃式提取儀上室溫提取1 min，提取功率為120 W，提取完畢后，平行進(jìn)行3次，減壓過濾，濃縮干燥即得大黃提取物。

回流提?。喝?號(hào)篩大黃藥材粉碎，精密稱取粉末5.0 g 3份，加入70%乙醇500 mL，置于回流裝置上85℃回流60 min，提取完畢后，減壓過濾，濃縮干燥，即得大黃提取物干燥物。

2.3 樣品溶液制備

2.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取2 mg左右五種對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇溶解并定容到10 mL的容量瓶，分別配成對(duì)照品儲(chǔ)備母液，0.22 μm微孔過濾后儲(chǔ)存于4℃的冰箱中，備用。

2.3.2 供試溶液的制備 分別取的兩種提取方法得到大黃干燥提取物100 mg左右，精確稱量，用甲醇溶解，置于25 mL容量瓶中定容，用0.22 μm微孔濾膜過濾后，即得兩種樣品供試溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.1”制得混合對(duì)照品溶液，按照“2.1”的條件，連續(xù)進(jìn)樣5針。分別測(cè)定得到各單體的峰面積，計(jì)算各成分5次的RSD。結(jié)果顯示，5種成分峰面積的精密度RSD分別為1.0%、0.3%、0.8%、1.3%、1.4%。

2.4.2 線性關(guān)系和線性范圍考察 將對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品混合儲(chǔ)備液用甲醇分別配制成個(gè)不同濃度梯度，再調(diào)整進(jìn)樣量。依次得到五種單體的不同進(jìn)樣含量峰面積，根據(jù)各成分含量與峰面積的關(guān)系，得到蘆薈大黃素（y=113.51x+8264），大黃酸（y=120.86x+25 111），大黃素（y=121.58x+158 76），大黃酚（y=177.2x+18995）和大黃素甲醚（y=19.601x+1 181.7）的線性回歸方程，回歸系數(shù)R都大于0.999，線性范圍在100～1 000 ng之間。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取大黃閃式得到的干燥提取物5份，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法分別制備成樣品供試品溶液，依次進(jìn)樣檢測(cè)，依次得到五種單體成分的峰面積，計(jì)算每種成分的RSD。結(jié)果顯示，5種成分RSD%分別為1.5%、2.3%、2.0%、2.1%、2.3%。

2.4.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取6份干燥提取樣品適量，分別精密加入對(duì)照品貯備液，設(shè)置低、高2個(gè)不同濃度，甲醇定容，再0.22 μm微孔濾膜過濾得到供試溶液，同時(shí)在上述色譜條件下測(cè)定，計(jì)算供試樣中五種蒽醌類化合物的回收率以及RSD值。五種單體的平均回收率(n=6)的結(jié)果分別為 102.1%、98.4%、101.9%、102.0%、98.7%，RSD 分別為1.8%、2.0%、1.7%、1.8%、2.2%。

2.5 大黃閃式提取樣品的測(cè)定

取“2.2”項(xiàng)下兩種方法制備得到的各3份提取物，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試溶液。兩種方法得到的供試溶液依次“2.1”色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。在上述色譜條件下測(cè)定5種成分的峰面積，結(jié)果顯示，五種物質(zhì)都在線性回歸方程的應(yīng)用范圍內(nèi)，可以代入線性回歸方程，并計(jì)算3次檢測(cè)含量，得到3次的均值。結(jié)果見表1。

表1 不同提取方法中5種蒽醌成分含量比較（n=3）

3 討論

閃式提取法是一種新型的提取方法，其依靠機(jī)械剪切力快速破碎，劇烈攪拌，超速動(dòng)態(tài)分子滲濾作用，強(qiáng)力振動(dòng)作用，從而加速物質(zhì)溶出[6]。在室溫及溶劑存在下數(shù)秒鐘內(nèi)能夠?qū)⑺幉牡慕M織粉末物料進(jìn)一步破碎至細(xì)微顆粒，并使有效成分迅速溶于溶劑中，提取時(shí)間一般在幾分鐘內(nèi)即可完成，比傳統(tǒng)提取方法快速、簡(jiǎn)便、完全、高效，且具有溶劑用量小特點(diǎn)，適用于工業(yè)化生產(chǎn)[7]。

該實(shí)驗(yàn)建立了用于同時(shí)檢測(cè)大黃提取物中5種蒽醌含量的HPLC方法，對(duì)游離蒽醌分離效果好，其他成分對(duì)檢測(cè)不造成干擾。HPLC檢測(cè)方法學(xué)通過精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率驗(yàn)證結(jié)果顯示，HPLC法對(duì)蒽醌類成分含量檢測(cè)的適用性良好，可用于檢測(cè)大黃蒽醌類物質(zhì)的含量。

該實(shí)驗(yàn)考察了閃式提取法和常規(guī)的回流提取法對(duì)大黃中5種蒽醌類成分的提取率的差別?；亓魈崛》ㄊ菂⒖贾袊幍?015版中對(duì)大黃蒽醌類提取方法，該法得到大黃蒽醌類提取率相對(duì)可靠。結(jié)果顯示，閃式提取在1 min左右的提取效率基本與回流提取用60 min提取效率相當(dāng)，同時(shí)具有節(jié)能的優(yōu)點(diǎn)，顯示了明顯優(yōu)勢(shì)，適合于工業(yè)生產(chǎn)。所以，在該實(shí)驗(yàn)條件下，閃式提取在提取大黃蒽醌類成分方面顯示了一定的優(yōu)勢(shì)，適合放大生產(chǎn)，這些結(jié)果為大黃蒽醌類有效成分成分的高效提取和工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典.一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:23.

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Flash Extraction and HPLC Test of Anthraquinones Component of Rhubarb

LI Zhi-ping1,2,LIU Fa-sheng1,2,TIAN Qing-ping1,HAN Li-wen2,LIU Ke-chun2,ZHANG Ai-ping1
1.College of Pharmacy of Shanxi Medical College,Taiyuan,Shanxi Province,030001 China;2.Biological Research Institute of Shandong Academy of Sciences&Key Laboratory of Drug Screening Technology of Shandong Academy of Sciences,Jinan,Shandong Province,250014 China

ObjectiveTo establish a simple flash extraction to extract the anthraquinones component of rhubarb and the content of 5 kinds of main free anthraquinones was measured by the HPLC method thus providing basis for the effective extraction and industrial production of anthraquinones component of rhubarb.MethodsThe anthraquinones component of rhubarb was extracted by the flash extraction,and compared with the routine reflux extraction,and the C18 chromatographic column was used and the acetonitrile-0.1%phosphoric acid was used as the mobile phase and the content of five kinds of anthraquinones was tested by the HPLC test method and the extraction effect was compared.ResultsFive kinds of anthraquinones could be tested by the HPLC,and the method was accurate and reliable,and the flash extraction could reach the similar extraction rate in a short time,which showed that the advantages of it in extraction of rhubarb anthraquinone analogues.ConclusionThe flash extraction is rapid,simple,energy-saving and effective under the same experimental conditions,which can provide theoretical basis for the effective extraction and industrial production of anthraquinones component of rhubarb.

Dahuang;Anthraquinone;Flash extraction;HPLC;Reflux extraction

R2

A

1672-5654（2017）06（a）-0121-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.16.121

2017-03-01）

山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)（2014ZZCX02105），山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016GSF121009）。

劉智平（1989-）,男，湖南邵陽人，碩士，研究方向：藥劑學(xué)。