復(fù)健片干預(yù)實(shí)驗(yàn)性腦梗死大鼠腦組織明膠酶的表達(dá)及對星形細(xì)胞膠質(zhì)化的影響

王中琳，席加秋，付 強(qiáng)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

復(fù)健片干預(yù)實(shí)驗(yàn)性腦梗死大鼠腦組織明膠酶的表達(dá)及對星形細(xì)胞膠質(zhì)化的影響

王中琳1，席加秋2，付 強(qiáng)2

目的 觀察高、中、低三種劑量復(fù)健片治療實(shí)驗(yàn)性腦梗死大鼠過程中對腦組織基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬白酶-9(MMP-9)表達(dá)的變化，探討復(fù)健片對星形細(xì)胞膠質(zhì)化的影響。方法 用Tamura法對右側(cè)近端大腦中動脈進(jìn)行電凝術(shù)以制備MCAO大鼠模型。按隨機(jī)法將45只大鼠分為中藥組、模型組以及假手術(shù)組，中藥組又因復(fù)健片灌胃劑量的不同，分為中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組，其他兩組予等量的蒸餾水。以上各組均為9只。3組MCAO大鼠分別在給藥1周、2周、4周時(shí)處死后取腦組織，用酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠腦組織MMP-2、MMP-9的表達(dá)。結(jié)果 中藥組治療第2周和4周較1周比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與模型組同期比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中藥中劑量組較之同期高劑量組和低劑量組作用更為顯著，尤其以第4周時(shí)最為明顯。結(jié)論 復(fù)健片改善實(shí)驗(yàn)性腦梗死大鼠神經(jīng)修復(fù)的內(nèi)環(huán)境，激活其內(nèi)修復(fù)機(jī)制，通過上調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)而抑制星形細(xì)胞過度膠質(zhì)化，以促進(jìn)神經(jīng)功能的重塑，是復(fù)健片治療腦梗死的作用機(jī)制之一。

腦梗死；復(fù)健片；大腦中動脈結(jié)扎； 基質(zhì)金屬蛋白酶-9

腦梗死后的腦功能恢復(fù)，至今仍是中西醫(yī)臨床和基礎(chǔ)研究的重要課題。對于腦可塑性機(jī)制的研究，既往多注重通過調(diào)控神經(jīng)生長因子和神經(jīng)生長抑制因子的分子生物學(xué)機(jī)能狀態(tài)以尋求腦功能改善[1]，但對于缺血損傷后繼發(fā)膠質(zhì)瘢痕影響腦重塑的研究則相對較少，尤其對于中醫(yī)藥干預(yù)星形細(xì)胞的過度膠質(zhì)化，針對改善神經(jīng)損傷修復(fù)環(huán)境的研究則更需要進(jìn)一步加強(qiáng)?；诖耍菊n題對復(fù)健片能否調(diào)控明膠酶的表達(dá)從而影響膠質(zhì)瘢痕的形成進(jìn)行研究，中醫(yī)藥治療腦血管疾病提供理論基礎(chǔ)[2]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取45只健康清潔型雄性SD大鼠(統(tǒng)一由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證：SCXK魯20120001，為12周齡，體重300 g±20 g。檢疫后備用，自由進(jìn)水、攝食。

1.2 主要試劑 復(fù)健片由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥劑教研室提供，批號：20030115，由補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)通絡(luò)的藥物組成，每片含生藥2.25 g；戊巴比妥鈉購買自上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站；注射用青霉素鈉購買自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；氯代三苯基四氮唑(紅四氮唑，TTC)購自上海試劑三廠；基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)酶聯(lián)免疫試劑盒購買自美國Bionewtrans Pharmaciutical Biotechnology Co..Ltd公司。

1.3 主要儀器 (見表1)

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動物分組 選取大鼠45只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組(兩組均分設(shè)7 d、14 d、28 d組) 和中藥組(分為高、中、低3個(gè)劑量組，各劑量組又分設(shè)7 d、14 d、28 d組)。中藥高、中、低劑量三組及其余兩組大鼠樣本均為9只。

表1 主要儀器

1.4.2 動物造模 模型組和中藥組按Tamura[3]的方法對右側(cè)近端大腦中動脈進(jìn)行電凝術(shù)，制備實(shí)驗(yàn)性MCAO大鼠模型。若動物術(shù)后24 h內(nèi)出現(xiàn)：①左側(cè)肢體痛覺減退，痛刺激收縮現(xiàn)象消失；②行走時(shí)軀體向左側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈；③提尾時(shí)左上肢不能向前伸直，同時(shí)具備這三項(xiàng)條件即可視為造模成功，將不符合條件者排除，剩余的大鼠模型即可納入試驗(yàn)進(jìn)行分組[4]。假手術(shù)組大鼠進(jìn)行同樣的開顱術(shù)，但不凝閉大腦中動脈，維持其血供狀態(tài)，其余操作同模型組。

1.4.3 動物給藥及腦組織取材 造模成功后中藥組給予復(fù)健片灌胃，其中，高、中、低劑量組分別為12 g生藥(1 g·d)、9 g、6 g生藥/(kg·d)，模型組及假手術(shù)組分別給予等量蒸餾水30 mL/d灌胃，分別于給藥7 d、14 d、28 d時(shí)斷頸處死大鼠，開顱取梗死灶周圍腦組織，并于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.4.4 指標(biāo)檢測 (見圖1)

圖1 治療檢測步驟及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié) 果

模型組大鼠明膠酶檢測值在1周后同假手術(shù)組相比，有明顯的提高。模型組1周、2周、4周后明膠酶的測值沒有明顯的變化。中藥組分別在治療1周、2周、4周同組間較1周時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示隨著治療用藥時(shí)間的延長MMP-2、MMP-9活性逐漸增強(qiáng)；中藥組在治療1周后MMP-2、MMP-9活性與同期模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在2周及4周表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)；中藥組在治療2周和4周較1周時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥中劑量組較同期的高劑量組和低劑量組作用更為顯著(P<0.05)，在第4周時(shí)最為明顯。詳見表2。

表2 復(fù)健片對不同時(shí)相MCAO大鼠MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響(±s) μg/mL

3 討 論

缺血性卒中對神經(jīng)系統(tǒng)的破壞，造成了神經(jīng)軸突的損傷和脫髓鞘改變，并繼發(fā)產(chǎn)生膠質(zhì)瘢痕，這種主要由星形細(xì)胞過度增生形成的膠質(zhì)瘢痕，可“屏障”阻止神經(jīng)纖維的再生和向損傷區(qū)“靶的”的行進(jìn)，從而影響神經(jīng)功能的修復(fù)[5]。膠原作為瘢痕中阻礙軸突生長的主要成分可被膠原酶有效降解，其中Ⅳ型膠原酶發(fā)揮著主導(dǎo)作用，它的生物學(xué)活性類型主要有兩種，即MMP-2 和 MMP-9[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：運(yùn)用補(bǔ)益肝腎中藥復(fù)健片對MMP-2 和 MMP-9的活性進(jìn)行有效調(diào)控，可為軸突的生長和髓鞘再生營造有利的重塑環(huán)境，從而對腦功能的恢復(fù)產(chǎn)生一定的積極影響。

有臨床觀察證實(shí)，復(fù)健片治療腦梗死(中風(fēng)病)安全有效。復(fù)健片為著名中醫(yī)藥專家王新陸教授所創(chuàng)制，由制首烏、決明子、槲寄生、海馬、仙靈脾等藥物組成，功專補(bǔ)益肝腎，兼以祛風(fēng)通絡(luò)。方中何首烏，古人認(rèn)為“生用氣寒性斂，有毒；制熟氣溫，無毒”(《本草匯言》)，結(jié)合現(xiàn)代藥理研究，宜用其制者。本方以制首烏為君藥，其味甘澀兼具溫潤之性，而有補(bǔ)肝益腎、頤養(yǎng)精血之功。又因其“為調(diào)和氣血之圣藥”(《本草分經(jīng)》)，故治療中風(fēng)方中常用之。槲寄生味苦甘性平，“乃桑之精氣所結(jié)”(《神農(nóng)本草經(jīng)百種錄》)，功“助筋骨、益血脈”(《日華子本草》)。故亦善補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)健筋骨，并具驅(qū)風(fēng)通絡(luò)之力，而常用為偏枯風(fēng)痱諸證。決明子甘苦咸性涼，“益陰泄熱，大補(bǔ)肝腎之氣”(《本草經(jīng)疏》)，“益腎水，清肝火”(《本草便讀》)，故有調(diào)肝氣清熱明目，滋腎水潤腸通便之能，有利人之氣機(jī)暢和。二者共助首烏調(diào)補(bǔ)肝腎氣血而為臣藥。仙靈脾味甘而辛散溫通，補(bǔ)助腎陽，祛風(fēng)除濕，善“治一切冷風(fēng)勞氣，補(bǔ)腰膝，強(qiáng)心力……四肢不任，老人昏耄，中年健忘”(《日華子本草》)。復(fù)有性溫味甘咸之海馬，既善“暖水……消瘕塊”(《本草綱目》)，又能“調(diào)氣和血”(《品匯精要》)，以達(dá)溫壯精血，通和經(jīng)脈之功。諸藥和合而用，是為中風(fēng)肝腎虧虛證而設(shè)。

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同劑量組，以探討復(fù)健片影響MCAO大鼠星形細(xì)胞膠質(zhì)化程度的量效關(guān)系，實(shí)驗(yàn)研究顯示，灌胃2周后，中藥中劑量組較同期的高劑量組和低劑量組作用更為顯著，尤以第4周時(shí)最為明顯。表明在進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究時(shí)必須要重視量效關(guān)系的合理設(shè)計(jì)。

復(fù)健片治療腦梗死的作用機(jī)制之一：改善實(shí)驗(yàn)性腦梗死大鼠神經(jīng)修復(fù)的內(nèi)環(huán)境，激活其內(nèi)修復(fù)機(jī)制，通過上調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)而抑制星形細(xì)胞過度膠質(zhì)化，以促進(jìn)神經(jīng)功能的重塑。

[1] 黎彬如，龍佳佳.腦梗死后患者神經(jīng)功能恢復(fù)不良的危險(xiǎn)因素分析[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2015，18(8)：68-69.

[2] 韓萍，張娜，于春蕾，等.復(fù)健片干預(yù)神經(jīng)-免疫系統(tǒng)治療腦梗死的臨床療效[J].中國繼續(xù)醫(yī)學(xué)數(shù)育，2016，8(23)：188-190.

[3] Tamura A，Graham DI，Mc Culloch I， et al.Focal cerebral ischemia in the rat.Descreption of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion[J].J Cereb Blood Flow and Metab，1981，1：53.

[4] 胡懷強(qiáng)，王樹才，等.復(fù)健片對大腦中動脈閉塞大鼠腦組織Rho/ROCK 的調(diào)控作用[J].中華中醫(yī)藥雜志，2014，29(4)：1218-1220.

[5] Sofroniew MV.Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation[J].Trends Neurosci，2009，32(12)：638-647.

[6] 李兵，易良，徐倫山，等.MMP1 MMP2 MMP9 與TIMP-1 TIMP-2 檢測對腦膠質(zhì)瘤的診斷作用分析[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2013，16(23)：4-6.

(本文編輯王雅潔)

Effects of Fujian Tablet on the Expression of Gelatinase to the Astrocyte in Rats with Experimental Cerebral Infarction

Wang Zhonglin，Xi Jiaqiu，F(xiàn)u Qiang

The Affiliated Hosipital，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji’nan 250011，Shandong，China

Xi Jiaqiu (Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji'nan，Shandong，China)

Objective To observe the effect of high， medium and low doses of Fujian tablets (FJT) on the expression of matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 in brain tissue in rats with experimental cerebral infarction，and explore its effect on astrocytes. Methods The middle cerebral artery occlusion (MCAO) rat model was prepared by Tamura method in the right proximal middle cerebral artery. Forty-five rats were divided into FJT group (high dose FJT group， middle dose FJT group and low dose FJT group)， model group and sham operation group. Because of the different dosage of the Fujian tablet，the traditional Chinese medicine group was divided into the high dose group， middle dosegroup and low dose group， and the other two groups were given equal amount of distilled water. 9 rats in each group. The MCAO rats in three groups were sacrificed at 1 week， 2 weeks， 4 weeks.The expressions of MMP-9 and MMP-2 in brain tissue were detected by ELISA mothed.Results After 2 weeks and 4 weeks， There were significant differences in the expressions of MMP-9 and MMP-2 in brain tissue between FJT groups and model group (P<0.05).The expressions in middle dose FJT group were higher than that in high dose FJT group and low dose FJT group (P<0.05)， especially at fourth weeks.Conclusion FJT can up-regulated the expressions of MMP-2 and MMP-9，and inhibit the gliosis of astrocyte， promote the remodeling of neural function in in rats with experimental cerebral infarction.

cerebral infarction；Fujian tablet；middle cerebral artery occlusion；matrix metalloproteinase-9

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.ZR2011HM010)

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(濟(jì)南250011)；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)

席加秋，E-mail：zydoctor7@126.com

信息：王中琳，席加秋，付強(qiáng).復(fù)健片干預(yù)實(shí)驗(yàn)性腦梗死大鼠腦組織明膠酶的表達(dá)及對星形細(xì)胞膠質(zhì)化的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(12)：1441-1444.

R743.3 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.12.006

1672-1349(2017)12-1441-04

2016-12-18)