豬重要感染病毒蛋白的二級結(jié)構(gòu)、抗原表位分析及三聯(lián)表位多肽疫苗的重組預測

劉 祥， 陳 琛， 陳春琳， 吳三橋

(陜西理工大學 中德天然產(chǎn)物研究所 陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心， 漢中 723001)

豬重要感染病毒蛋白的二級結(jié)構(gòu)、抗原表位分析及三聯(lián)表位多肽疫苗的重組預測

劉 祥， 陳 琛， 陳春琳， 吳三橋

(陜西理工大學 中德天然產(chǎn)物研究所 陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心， 漢中 723001)

為設計豬重要感染病毒的蛋白表位多肽疫苗，選取豬感染病毒的候選疫苗蛋白：豬繁殖與呼吸綜合征病毒的GP5蛋白，豬圓環(huán)病毒2型的CAP蛋白，豬瘟病毒的E2蛋白。綜合ABCpred和BepiPred方案，預測候選蛋白的B細胞表位；利用神經(jīng)網(wǎng)絡與量化矩陣法預測蛋白的CTL表位；采用MHC-Ⅱ類分子結(jié)合肽在線程序預測蛋白的Th表位。使用SOPMA方法與DNASTAR軟件分析候選蛋白的二級結(jié)構(gòu)，進一步驗證B/T細胞表位預測結(jié)果的準確性。然后，通過Protean程序重組拼接獲得的B/T細胞抗原表位。結(jié)果顯示GP5蛋白具有4個優(yōu)勢B細胞表位，CAP、E2蛋白分別具有5個B細胞表位；GP5、CAP與E2蛋白各具有1個CTL表位；GP5、E2蛋白分別具有2個Th表位，CAP蛋白存在1個Th表位。二級結(jié)構(gòu)分析顯示預測獲得的B/T細胞表位均處于蛋白易于產(chǎn)生表位的暴露表面、無規(guī)則卷曲與轉(zhuǎn)角等位置，驗證了B/T細胞表位預測結(jié)果的準確性。Protean程序重組拼接獲得優(yōu)勢的B/T細胞抗原表位。最終設計獲得抗原性較好的豬病毒三聯(lián)表位多肽，為豬易感病毒的多聯(lián)疫苗開發(fā)奠定基礎。

豬病毒；表位疫苗；二級結(jié)構(gòu)分析；抗原分析

豬呼吸道疾病是誘發(fā)豬死亡的重要原因之一，主要癥狀為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、生長緩慢等，給豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[1]。感染的病毒主要為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)[2]，豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)[3]以及豬瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)[4]。針對豬病毒感染的治療尚無高效藥物，主要為抗病毒劑如干擾素、白細胞介導素、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)移因子等，治療成本高[5]。研究發(fā)現(xiàn)豬病毒疾病防治根本途徑為免疫制劑[6]。目前，人們針對豬病毒蛋白開展了一些研究，證實PRRSV、PCV2與CSFV病毒抗原性較好的蛋白分別為GP5、CAP和E2[7-9]，并進行了免疫功能的驗證，發(fā)現(xiàn)這些蛋白是很好的候選蛋白疫苗，但均處于研究的初步階段，商業(yè)化較少見[10]。而且豬病毒感染往往是混合型，給防治帶來一定難度，有必要開發(fā)新型的蛋白疫苗。

表位疫苗是近年發(fā)展起來的一種新型疫苗，具有安全、穩(wěn)定、產(chǎn)量高、免疫效果好，以及可人為設計等優(yōu)點。在腫瘤、肝炎、流感等疾病防治上均有研究[11]，是疫苗研究的新方向。然而，表位疫苗在豬病毒感染的防治上尚未展開。我們期望通過生物信息學方法，將豬病毒候選蛋白疫苗進行B/T細胞表位預測、重組拼接，以期設計安全、免疫簡潔與高效的豬病毒蛋白表位多肽重組疫苗，進而實現(xiàn)豬單次免疫就可有效抵御3種病毒的感染。

1 材料與方法

1.1 材料

選取豬繁殖與呼吸綜合征病毒，豬圓環(huán)病毒2型，以及豬瘟病毒的候選蛋白疫苗，分別為GP5、CAP與E2，其NCBI網(wǎng)站公布的氨基酸序列登錄號分別為ACJ23261.1、AAW79866.1、NP_777498.1。

1.2 方法

1.2.1 B細胞表位預測 采用BepiPred和ABCpred方法聯(lián)合預測B細胞表位。最終B細胞表位為兩種方案共有的氨基酸序列[12]。

1.2.2 T細胞表位預測 細胞毒性T細胞(CTL)抗原表位采用量化矩陣與人工神經(jīng)網(wǎng)絡法預測，選擇HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205分子結(jié)合肽，通過CTLpred程序預測。輔助T細胞(Th)抗原表位預測選擇結(jié)合肽類型為DRB1-0101、DRB1-0102和DRB1-0301，預測的軟件為：http://www.imtech.res.in/raghava/propred/[13]。

1.2.3 蛋白二級結(jié)構(gòu)預測 蛋白二級結(jié)構(gòu)采用SOPMA方法與DNASTAR軟件進行聯(lián)合預測，從而檢測獲得各個蛋白B/T細胞表位信息。目的是驗證獲得的B/T細胞表位是否處于蛋白抗原性較好的肽段位置。

1.2.4 重組表位疫苗的設計 將各個蛋白預測獲得的B/T細胞表位，按照B細胞表位、CTL細胞表位及Th細胞表位順序進行編號，每個表位之間通過4個甘氨酸(GGGG)進行柔性連接，以盡量減少各自表位間的相互干擾。然后，通過DNASTAR軟件分析表位的不同排列方式，以各表位相對獨立且具有較好抗原性參數(shù)的組合方式，作為重組表位多肽的氨基酸序列。最后，將多肽序列翻譯為核酸序列，獲得重組表位多肽的核酸序列。

2 結(jié)果

2.1 B細胞表位預測

綜合BepiPred和ABCpred兩種方法預測B細胞表位。BepiPred方法預測蛋白B細胞表位結(jié)果如表1所示；ABCpred方法預測結(jié)果見表2。綜合BepiPred和ABCpred兩種方案的共同序列區(qū)段，最終獲得豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白優(yōu)勢B細胞表位區(qū)段為：32～36，98～101，164～168，184～192；豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白B細胞表位區(qū)段為：60～65，79～88，109～116，164～168，172～180；豬瘟病毒E2蛋白B細胞表位區(qū)段為：25～32，89～97，142～147，156～163，270～285。

表1 BepiPred方法預測蛋白B細胞表位的肽段位置

表2 ABCpred方法預測蛋白B細胞表位的肽段位置

2.2 T細胞表位預測2.2.1 CTL細胞表位預測 CTL抗原表位預測采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡與量化矩陣法，分子結(jié)合肽選擇HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205，結(jié)果見表3。綜合多肽共有的區(qū)段，獲得豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白的優(yōu)勢CTL細胞表位區(qū)段為119～127的ALICFVIRL；豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白CTL細胞表位區(qū)段為22～29的ILRRRPWL；豬瘟病毒E2蛋白CTL細胞表位區(qū)段為349～357的ALLGGRYVL。

2.2.2 Th細胞表位預測 采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡與量化矩陣法預測Th抗原表位，預測結(jié)合多肽種類選擇DRB1*0101、DRB1*0102、DRB1*0301，結(jié)果見表4。綜合多肽共有的區(qū)段，獲得豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白優(yōu)勢Th細胞表位區(qū)段為28～36的LVNASNNNS，以及125～133的IRLAKNCMS；豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白Th細胞表位區(qū)段為185～193的LRLQTAGNV；豬瘟病毒E2蛋白Th細胞表位區(qū)段為227～232的LVNETG；以及348～354的VALLGGR。

表3蛋白CTL抗原表位預測

表4 蛋白Th抗原表位預測

2.3 蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

為檢測獲得的3種蛋白B細胞與T細胞表位的準確性，利用DNASTAR軟件和SOPMA方法對蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預測，驗證獲得的蛋白B/T細胞抗原表位是否處于易于產(chǎn)生抗體的無規(guī)則卷曲、暴露表面及轉(zhuǎn)角等位置。使用DNASTAR程序，從蛋白的親水性、可柔性、表面可極性與抗原指數(shù)方面，預測的3種蛋白抗原性結(jié)果如圖1～3所示。應用SOPMA方法預測3種蛋白的二級結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖4～6所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)預測的3種蛋白B/T細胞表位均處于抗原性較好的區(qū)段，支持預測的B/T細胞抗原表位的合理性。

2.4 表位多肽疫苗的重組

將預測獲得的3種細菌各自的B/T細胞表位，分別按照B細胞表位、CTL表位、Th表位順序進行編號，再通過Protean程序分析線性表位的各種排列方式，以重組的多表位間相對獨立，抗原性參數(shù)較好為標準；并且各多肽間柔性接頭氨基酸采用4個甘氨酸(GGGG)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白表位排列順序為：epitope4-epitope6-epitope7-epitope3-epitope5-epitope2-epitope1；豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白表位排列順序為：epitope1-epitope3-epitope4-epitope6-epitope7-epitope2-epitope5；豬瘟病毒E2蛋白表位排列順序為：epitope3-epitope4-epitope6-epitope7-epitope1-epitope8-epitope5-epitope2。再將3種菌各自預測完成的串聯(lián)表位進一步拼合，并采用Protean程序進行分析，獲得抗原性參數(shù)較好的重組表位多肽，如圖7所示。至此，設計獲得豬重要感染病毒的三聯(lián)表位疫苗多肽的序列為：SAATPLTRVGGGGLVNASNNNSGGGGIRLAKNCMSGGGGGGKVEGGGGALICFVIRLGGGGTAGYGGGGSNNNSGGGGTTVKTPGGGGSPITQGDRGGGGKPVLDGGGGILRRRPWLGGGGLRLQTAGNVGGGGFLPPGGGSNPGGGGDYFQPNNKRGGGGVSPTTLGGGGRRDKPFPHGGGGALLGGRYVLGGGGLVNETGGGGGGLTTTWKEGGGGVALLGGRGGGGERLGPMPCRPKEIVSSGGGGPSTEEMGDD(下劃線表示接頭氨基酸序列)；翻譯成核酸序列為：TCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTGGTGGCGGTGGCCTCGTCAACGCCAGCAACAACAACAGCGGTGGCGGTGGCATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCGGTGGCGGTGGCGGAGGTAAGGTTGAGGGTGGCGGTGGCGCGCTGATTTGCTTTGTCATTAGGCTTGGTGGCGGTGGCACCGCCGGATATGGTGGCGGTGGCAGCAACAACAACAGCGGTGGCGGTGGCACCACAGTCAAAACGCCCGGTGGCGGTGGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGGTGGCGGTGGCAAACCTGTCCTAGATGGTGGCGGTGGCATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGGTGGCGGTGGCCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTAGGTGGCGGTGGCTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCGGTGGCGGTGGCGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAGGTGGCGGTGGCGTGAGCCCAACAACTCTGGGTGGCGGTGGCAGGAGAGACAAGCCCTTTCCGCACGGTGGCGGTGGCGCACTGTTAGGAGGAAGATATGTCCTGGGTGGCGGTGGCTTGGTAAATGAGACAGGTGGTGGCGGTGGCGGTCTCACCACCACCTGGAAAGAAGGTGGCGGTGGCGTAGCACTGTTAGGAGGAAGAGGTGGCGGTGGCGAAAGACTGGGCCCTATGCCATGCAGACCCAAAGAGATTGTCTCTAGTGGTGGCGGTGGCCCATCAACTGAGGAAATGGGAGATGAC(下劃線為接頭氨基酸的核酸序列)。

圖1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白表位分子的抗原性分析

Fig 1 Antigenicity analysis of PRRSV GP5 protein epitopes molecular

圖2 豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白表位分子的抗原性分析

圖3 豬瘟病毒E2蛋白表位分子的抗原性分析

圖4 DNASTAR軟件預測豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白二級結(jié)構(gòu)

c：無規(guī)則卷曲；e：β-片層；h：a-螺旋；t：β-轉(zhuǎn)角

圖5 DNASTAR軟件預測豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白二級結(jié)構(gòu)

c：無規(guī)則卷曲，e：β-片層，h：a-螺旋，t：β-轉(zhuǎn)角

圖6 DNASTAR軟件預測豬瘟病毒E2蛋白二級結(jié)構(gòu)

c：無規(guī)則卷曲；e：β-片層；h：a-螺旋；t：β-轉(zhuǎn)角

圖7 重組多表位分子的抗原性分析

3 討論

表位疫苗是利用體外表達或人工合成細菌、病毒蛋白結(jié)構(gòu)中具有免疫合性的片段而制成的疫苗[14]；具有安全、穩(wěn)定、免疫效果好，以及可人為設計等優(yōu)點。在艾滋病、腫瘤、肝炎、寄生蟲和流感等疾病防治上均有大量研究[11,15]。生物信息學可實現(xiàn)蛋白表位的預測、設計，增加試驗的針對性，為人們合成表位疫苗奠定基礎[16-17]。表位預測類型可分為線性表位與構(gòu)象型表位兩種[18]。線性表位基于蛋白的氨基酸一級結(jié)構(gòu)，準確度可達60 %；構(gòu)象型表位基于目標蛋白的三維結(jié)構(gòu)預測，對于未知結(jié)構(gòu)蛋白預測存在一定難度[19]?？傮w上，構(gòu)象型表位較線性表位研究缺乏，技術(shù)手段上也不成熟[20]，現(xiàn)行的表位預測大多針對線性表位。

目前，關(guān)于豬呼吸道病毒的表位疫苗研究尚處于起步階段。有人合成呼吸綜合征病毒GP5蛋白部分抗原，制備抗體進行豬病毒的檢測[21]；吳勝昔等設計獲得了免疫原性較好的豬圓環(huán)病毒CAP表位多肽[8]。然而這些初步設計的表位疫苗，僅針對單個病毒，且免疫功能研究缺乏，對于防治豬呼吸道病毒疾病具有局限性。本研究從豬呼吸道病毒主要感染病毒著手，設計了三聯(lián)表位多肽疫苗，有望進一步提高豬呼吸道病毒感染的防治效果。

B細胞表位是抗原被B細胞表面受體或抗體特異性識別并相互結(jié)合的多肽片段，其預測常見的方法主要應用BepiPred、ABCpred及DNASTAR軟件。BepiPred主要利用氨基酸的性質(zhì)和隱形馬爾可夫模型預測線性表位[22]；ABCpred是基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡算法，準確率達65.9%[23]。前期，我們通過兩種方法的結(jié)合，對豬鏈球菌蛋白和溶藻弧菌外膜蛋白U開展了B細胞表位預測[12-13]。本研究采用BepiPred和ABCpred聯(lián)合預測的方式，對3種病毒的蛋白進行了B細胞表位預測。

T細胞表位包含有CTL(細胞毒性T淋巴細胞)表位和Th(T輔助細胞)表位，分別是抗原中與MHC-Ⅰ、MHC-Ⅰ類分子結(jié)合的短肽[24-25]。CTL預測常采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡法結(jié)合量化矩陣法[26]，在細菌、病毒蛋白CTL抗原表位預測上研究廣泛[12, 27]。Th表位預測方法在病毒蛋白、細菌蛋白均實現(xiàn)了成功預測[13,28]。但在豬呼吸道病毒T細胞表位預測上尚未開展。本試驗借助于T細胞表位預測的成熟方法，預測獲得了CTL、Th細胞表位，為防治豬呼吸道病毒感染提供科學依據(jù)。

表位間的柔性連接接頭使得各表位間相對獨立，具有分子剛性[29]。采用較多的柔性接頭氨基酸序列有GGGG、GGGGS、KK與AAY[30-31]。本研究采用GGGG氨基酸接頭，并通過Protean程序?qū)Σ煌砦黄唇臃绞竭M行優(yōu)化，最終預測獲得抗原性較好的重組表位多肽，為豬易感病毒的多聯(lián)疫苗開發(fā)奠定基礎。

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The secondary structure, antigen epitope analysis and recombination prediction triple epitope peptide vaccine of porcine important infection virus protein

LIU Xiang, CHEN Chen, CHEN Chun-lin, WU San-qiao

(Chinese-German Joint Institute for Natural Product Research, Shaanxi University of Technology, Shaanxi Engineering Research Center of Tall Gastrodia Tuber and Medical Dogwood, Hanzhong 723001, China)

In order to design protein epitope polypeptide for important infectious virus of porcine, the candidate proteins vaccine of swine infection virus was selected. The selected proteins included GP5 protein of PRRSV (porcine reproductive and respiratory syndrome virus), CAP protein of PCV2 (porcine circovirus type 2), and E2 protein of CSFV (classical swine fever virus). ABCpred and BepiPred prediction programs were used to predict B cell epitopes, quantitative matrix, the artificial neural network was used to predict CTL cell epitopes, and an online server prediction was used to analysis MHC class Ⅱ peptide binding affinity. The secondary structure further verifying the accuracy of B/T cell epitopes was analyzed by SOPMA and DNASTAR software. The B/T cell epitopes were recomposed by protean program. The results showed that GP5 protein had 4 B cell epitopes, CAP and E2 had 5 B cell epitopes, and GP5, CAP and E2 protein had 1 CTL cell epitopes. GP5 and E2 protein had 2 Th cell epitopes, and CAP protein had 1 Th cell epitopes. The secondary structure showed that most of the B/T cell epitopes were located in the exposed surface, the random coil and the corner, which verified the prediction accuracy of B/T cell epitopes. The B/T cell epitopes were recomposed by protean program, and triple epitope vaccine of porcine virus holding better antigen was designed finally, and laid the foundation for the development of swine virus multi vaccine.

porcine virus; epitope vaccine; secondary structure analysis; antigenic analysis

2016-05-16；

2016-05-27

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項目(2016NY-088)；陜西理工大學校級科研項目(SLGKY16-13)

劉 祥，博士，講師，主要從事蛋白質(zhì)組學與免疫學研究，E-mail：liuxiang888525@163.com

S852.6

A

2095-1736(2017)03-0018-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.018