大鯢皮膚泡制酒抗氧化作用研究

劉旭東，張玉超，楊亮，晏宏，吳紀(jì)國(guó)，韋圣江，趙雪峰，魏剛，4，*

（1.中國(guó)貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）有限責(zé)任公司茅臺(tái)學(xué)院，貴州仁懷564501；2.貴州省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，貴州貴陽(yáng)550001；3.正安縣畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展辦公室，貴州遵義563400；4.貴陽(yáng)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550001）

大鯢皮膚泡制酒抗氧化作用研究

劉旭東1，張玉超1，楊亮1，晏宏2，吳紀(jì)國(guó)3，韋圣江3，趙雪峰3，魏剛1，4，*

（1.中國(guó)貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）有限責(zé)任公司茅臺(tái)學(xué)院，貴州仁懷564501；2.貴州省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，貴州貴陽(yáng)550001；3.正安縣畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展辦公室，貴州遵義563400；4.貴陽(yáng)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550001）

大鯢（Andrias davidianus）是中國(guó)珍稀的兩棲動(dòng)物，體內(nèi)尤其是皮膚含有多種天然活性物質(zhì)，是制作功能性保健食品的理想材料，將貴州醬香型白酒和大鯢結(jié)合研發(fā)大鯢保健酒，具有經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。對(duì)大鯢皮膚泡制酒的抗氧化作用進(jìn)行研究。結(jié)果表明，泡制酒并未引起小鼠肝臟組織病理學(xué)改變，且肝臟組織中谷胱甘肽（GSH）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）的活性出現(xiàn)了顯著性上升（P＜0.05）；活性氧簇（ROS）、丙二醛（MDA）的含量出現(xiàn)了顯著性下降（P＜0.05）；8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）和白介素 1β（IL-1β）的含量均未出現(xiàn)顯著性變化。結(jié)果表明，大鯢皮膚泡制酒具有一定的抗氧化作用，為大鯢保健酒進(jìn)一步開(kāi)發(fā)增加了可行性。

大鯢；醬香型白酒；大鯢皮膚泡制酒；抗氧化

大鯢（Andrias davidianus）是世界上現(xiàn)存最大的兩棲類動(dòng)物，屬于我國(guó)Ⅱ級(jí)保護(hù)動(dòng)物，也是貴州省生物多樣性保護(hù)行動(dòng)計(jì)劃中的重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物。大鯢體內(nèi)尤其是皮膚含有多種天然活性物質(zhì)，包括多種氨基酸以及功能性成分，具有抗菌、抗氧化、抗疲勞等作用[1-4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，經(jīng)常食用大鯢可以聰明益智、延緩衰老、提高造血和免疫功能，對(duì)預(yù)防心腦血管系統(tǒng)疾病、惡性貧血和惡性腫瘤有很好的作用[5-8]，是農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化和特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)開(kāi)發(fā)物種，在貴州人工養(yǎng)殖規(guī)模不斷增加并已形成一定產(chǎn)量，是制作功能性保健產(chǎn)品的理想原材料。

白酒產(chǎn)業(yè)是貴州省支柱產(chǎn)業(yè)，隨著人們生活水平的提高，對(duì)于保健酒的關(guān)注度也不斷增加，但以大鯢為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)保健酒還未見(jiàn)報(bào)道。將貴州特色的醬香白酒和大鯢有效的結(jié)合，不僅具有經(jīng)濟(jì)效益，更具有社會(huì)效益。該研究以大鯢皮膚和醬香白酒為基礎(chǔ)，對(duì)大鯢皮膚泡制酒的抗氧化作用進(jìn)行研究，為大鯢保健酒開(kāi)發(fā)提供理論和數(shù)據(jù)支持，為開(kāi)發(fā)大鯢保健酒的可行性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用大鯢來(lái)自正安縣大鯢養(yǎng)殖場(chǎng)。去除大鯢肉和骨，將皮膚組織洗凈，切成約1 cm×1 cm的小片。將皮膚組織按照質(zhì)量體積比1∶10（g/mL）加入53%vol醬香型白酒中，靜置泡制30 d，制成10%的泡制酒，實(shí)驗(yàn)時(shí)使用白酒將10%母液倍比稀釋至2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%供使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)雄性昆明小鼠，體重20 g～22 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠飼養(yǎng)于華中師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境為每天12 h光照/12 h黑暗，允許自由進(jìn)食飲水。

1.3 主要試劑盒、試劑與儀器

ROS、MDA、GSH、SOD 檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所；8-OHdG檢測(cè)試劑盒：Kamiya Biomedical Company（加利福尼亞，美國(guó)）；TNF-α和IL-1β檢測(cè)試劑盒：eBioscience Company（加利福尼亞，美國(guó)）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

5415R低溫冷凍離心機(jī)：Eppendorf，德國(guó)；DNM-9602全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：北京普朗新技術(shù)有限公司；FLx 800熒光酶標(biāo)儀：Bio-Tek，美國(guó)。

1.4 實(shí)驗(yàn)流程

60只昆明小鼠隨機(jī)分為6組，分別為：空白對(duì)照組、白酒對(duì)照組、2.5%泡制酒灌胃組、1.25%泡制酒灌胃組、0.625%泡制酒灌胃組、0.3125%泡制酒灌胃組，以5 mL/（kg·d）[9]的劑量分別對(duì)各組小鼠進(jìn)行連續(xù)7 d的生理鹽水、53%vol醬香型白酒、2.5%泡制酒、1.25%泡制酒、0.625%泡制酒、0.312 5%泡制酒灌胃，在第8天收集小鼠肝臟組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定和組織病理學(xué)觀察。

1.5 肝組織病理切片制備

第7天灌胃結(jié)束24h之后，取小鼠肝組織置于4%的多聚甲醛中固定過(guò)夜，隨后將組織送至湖北百奧思生物科技有限公司進(jìn)行固定切片，然后進(jìn)行H&E染色，并在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.6 肝組織勻漿制備

第7天灌胃結(jié)束24 h之后，取小鼠肝組織置于勻漿器中，加入PBS（pH=7.5），將組織制成10%的組織勻漿，將組織勻漿于4℃，10 000 r/min離心10 min，收集上清液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，蛋白質(zhì)含量采用福林酚法測(cè)定[10]。

1.7 生化指標(biāo)的測(cè)定

取肝組織勻漿上清液，按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，進(jìn)行 ROS、MDA、GSH、SOD、8-OHdG、TNF-α 和IL-1β的測(cè)定。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS進(jìn)行單因素方差（ANOVA）分析，使用LSD檢驗(yàn)比較兩組數(shù)據(jù)間的差異性，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)水準(zhǔn)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用Origin 6.1統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟組織病理學(xué)觀察

肝臟組織切片H&E染色結(jié)果顯示見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠肝臟組織病理學(xué)觀察（H&E染色）Fig.1 Histological images of liver slices（stained with H&E）

圖1顯示空白對(duì)照組（a）、泡制酒組以（c-f）的肝臟組織細(xì)胞正常，肝索肝竇比例正常，而白酒組（b）肝竇輕度變窄，提示肝細(xì)胞可能出現(xiàn)了輕度水腫。

2.2 小鼠體重增長(zhǎng)變化

表1顯示了連續(xù)灌胃7 d后各組小鼠體重增長(zhǎng)量的情況。

由表1可知，7 d的連續(xù)灌胃后各組小鼠的體重均出現(xiàn)了增長(zhǎng)。空白對(duì)照組的體重增長(zhǎng)量最大，其他各組的增長(zhǎng)量和空白對(duì)照組比出現(xiàn)了顯著性的下降，但1.25%泡制酒組小鼠體重增長(zhǎng)量和白酒組相比有顯著性的上升。

2.3 肝臟組織中ROS水平測(cè)定

連續(xù)灌胃7 d后，小鼠肝臟組織中ROS的含量（以相對(duì)熒光量表示）如圖2所示。

表1 小鼠體重增長(zhǎng)量的情況Table 1 The bodyweight increased of mice

圖2 小鼠肝臟組織中ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度Fig.2 The ROS relative fluorescence of mice live

圖2結(jié)果顯示，連續(xù)灌胃7 d后白酒組小鼠肝臟組織中ROS含量和空白組相比出現(xiàn)了顯著性的上升；2.5%、1.25%、0.625%泡制酒組ROS的含量和白酒組及空白組相比均出現(xiàn)了顯著性的下降。

2.4 肝臟組織中MDA含量的測(cè)定

連續(xù)灌胃7 d后，小鼠肝臟組織中MDA的含量如圖3所示。

從圖3可以看出，連續(xù)灌胃7 d后，白酒組小鼠肝臟組織中MDA含量與空白對(duì)照組相比出現(xiàn)了顯著性的上升；0.625%小鼠肝臟組織中MDA含量與白酒組相比出現(xiàn)了顯著性的下降；而1.25%泡制酒組MDA的含量和白酒組及空白組相比均出現(xiàn)了極顯著性的下降。

2.5 肝臟組織中GSH含量測(cè)定

圖4顯示了連續(xù)灌胃7 d后各組小鼠肝臟組織中GSH的含量。

圖4結(jié)果顯示除白酒組和0.312 5%組外，0.625%組、1.25%組、2.5%組和白酒組及空白組相比肝臟組織中GSH的含量均出現(xiàn)了顯著性的上升。

2.6 肝臟組織中SOD活性的測(cè)定

圖5顯示7 d連續(xù)灌胃結(jié)束后小鼠肝臟組織中SOD的活性變化。

結(jié)果顯示1.25%組肝臟組織中SOD活性和白酒組及空白組相比均出現(xiàn)了極顯著性上升。

2.7 肝臟組織中TNF-α含量的測(cè)定

圖6顯示灌胃后各組小鼠肝臟組織內(nèi)TNF-α含量。

圖3 小鼠肝臟組織中MDA含量Fig.3 The concentration of MDA in mice live

圖4 小鼠肝臟組織中GSH含量Fig.4 The concentration of GSH in mice live

圖5 小鼠肝臟組織中SOD活性Fig.5 The SOD activities in mice live

圖6 小鼠肝臟組織中TNF-α含量Fig.6 The concentration of TNF-α in mice live

結(jié)果顯示各組小鼠肝組織中TNF-α含量無(wú)顯著性差異。

2.8 肝臟組織中IL-1β含量的測(cè)定

圖7顯示灌胃后各組小鼠肝臟組織內(nèi)IL-1β含量。

圖7 小鼠肝臟組織中IL-1β含量Fig.7 The concentration of IL-1β in mice live

結(jié)果顯示各組小鼠肝組織中IL-1β含量無(wú)顯著性差異。

2.9 肝臟組織中8-OHdG含量的測(cè)定

圖8顯示灌胃后各組小鼠肝臟組織內(nèi)8-OHdG含量。

圖8 小鼠肝臟8-OHdG含量Fig.8 The concentration of 8-OHdG in mice live

結(jié)果顯示各組小鼠肝組織中8-OHdG含量無(wú)顯著性差異。

3 結(jié)論與討論

大鯢在貴州省的人工養(yǎng)殖已形成一定規(guī)模，是制作功能性保健品的理想原材料。該研究將大鯢與貴州特色醬香白酒結(jié)合，對(duì)大鯢皮膚泡制酒的抗氧化作用進(jìn)行研究。機(jī)體代謝會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧基團(tuán)，正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體內(nèi)的氧化和抗氧化系統(tǒng)處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)以保護(hù)機(jī)體不受到活性氧基團(tuán)的損傷，當(dāng)平衡被打破，大量活性氧基團(tuán)積累，機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激。過(guò)量的活性氧基團(tuán)可以損傷體內(nèi)生物大分子如：蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA 等[11-13]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠連續(xù)一周進(jìn)行白酒灌胃后肝臟組織中活性氧簇ROS的含量和空白對(duì)照組相比顯著性升高，而0.625%、1.25%、2.5%大鯢皮膚泡制酒組和空白對(duì)照組及白酒組相比ROS含量均出現(xiàn)了顯著性的下降。丙二醛MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物[14]，經(jīng)過(guò)7 d連續(xù)灌胃，白酒組小鼠出現(xiàn)了肝臟組織的脂質(zhì)過(guò)氧化，MDA含量顯著性的上升，但0.625%泡制酒組和白酒組相比出現(xiàn)了顯著性的下降，1.25%泡制酒組和空白對(duì)照組及白酒組相比MDA含量均出現(xiàn)了顯著性的下降。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)一周飲用白酒后，小鼠肝臟組織出現(xiàn)了氧化損傷，而大鯢皮膚泡制酒體能夠降低ROS和MDA的含量，體現(xiàn)出了一定的解毒作用（和白酒組相比具有陽(yáng)性結(jié)果）及保健作用（和空白對(duì)照組相比有陽(yáng)性結(jié)果）。

谷胱甘肽GSH是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑[15]，0.625%、1.25%、2.5%大鯢泡制酒均可引起肝組織內(nèi)GSH的顯著性升高。超氧化物歧化酶SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛地存在于各種生物體[16]，1.25%泡制酒可以顯著的提高肝臟組織內(nèi)SOD的活性。以上結(jié)果顯示，大鯢泡制酒可以通過(guò)提高GSH含量以及SOD活性來(lái)進(jìn)行抗氧化的作用，降低連續(xù)飲酒引起的氧化應(yīng)激，以此來(lái)提高機(jī)體的抗氧化能力。

按照目前已有的氧化應(yīng)激分級(jí)模型假說(shuō)[17]，根據(jù)氧化應(yīng)激水平的強(qiáng)弱以及對(duì)生物體造成損傷的嚴(yán)重程度，氧化應(yīng)激可以分為多個(gè)層次。最低水平的氧化應(yīng)激，可以引起細(xì)胞的自我保護(hù)作用，細(xì)胞使用自身的抗氧化酶和還原性物質(zhì)來(lái)清除過(guò)量的ROS。隨著氧化應(yīng)激水平的提高，高水平的氧化應(yīng)激將會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，增加炎癥因子，例如：TNF-α和IL-1β的表達(dá)量。該研究表明連續(xù)飲用白酒和泡制酒一周均未引起肝臟組織炎癥反應(yīng)，連續(xù)飲用白酒雖引起肝臟組織氧化應(yīng)激，但是并未引起組織炎癥反應(yīng)。長(zhǎng)期連續(xù)飲用白酒是否能夠引發(fā)肝臟組織炎癥反應(yīng)，而泡制酒是否具有抗炎作用則需要后期進(jìn)一步研究。

8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）是活性氧自由基攻擊DNA分子中的鳥(niǎo)嘌呤堿基第8位碳原子而產(chǎn)生的一種氧化性加合物，目前是DNA氧化損傷中最常用的生物標(biāo)志物[18]。連續(xù)飲用白酒會(huì)導(dǎo)致肝臟組織中活性氧含量升高，大量的活性氧可能會(huì)導(dǎo)致肝臟組織DNA損傷。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明連續(xù)飲用一周白酒和泡制酒均未引起肝臟組織的DNA氧化損傷。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，醬香型白酒可以引起小鼠肝臟組織氧化損傷，ROS含量上升，脂質(zhì)出現(xiàn)過(guò)氧化。將大鯢皮膚在醬香型白酒中浸泡一段時(shí)間（本研究為30 d），制成大鯢皮膚泡制酒在0.625%和1.25%濃度不但可以顯著性的降低白酒引起的氧化應(yīng)激作用（和白酒組對(duì)比），同時(shí)也可以顯著性降低機(jī)體氧化水平（和空白對(duì)照組比），體現(xiàn)出了大鯢皮膚泡制酒具有一定解毒和保健作用。該研究為有效結(jié)合中國(guó)特色的大鯢和貴州醬香白酒而開(kāi)發(fā)出大鯢保健酒的可行性提供依據(jù)。后期將進(jìn)一步優(yōu)化泡制酒工藝，對(duì)其抗炎、抗疲勞、抗菌、抗病等方面的作用進(jìn)行研究。

[1] 李莉,王錫昌,劉源.中國(guó)養(yǎng)殖大鯢的食用、藥用價(jià)值及其開(kāi)發(fā)利用研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2012,33(9):454-458

[2] 黃世英,郭文韜,楊志偉,等.人工養(yǎng)殖大鯢肉營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(5):1023-1024

[3]金立成.娃娃魚(yú)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值市場(chǎng)前景與保護(hù)[J].農(nóng)業(yè)科技通訊,2003(4):26-27

[4] 楊玉鳳.大鯢的藥用價(jià)值及人工養(yǎng)殖[J].四川農(nóng)業(yè)科技,2003(9):29

[5] 張神虎.大鯢藥用價(jià)值及人工養(yǎng)殖[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2001(4):309-310

[6] 曲敏,閆欣,李偉,等.大鯢低聚糖肽對(duì)小鼠免疫功能調(diào)節(jié)作用的研究[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,27(1):42-44

[7] 郭潔,華棟.大鯢皮粉的抗炎鎮(zhèn)痛作用[J].河南中醫(yī),2013,33(6):881-883

[8] 黃正杰,崔建云,任發(fā)政,等.大鯢粗提物延緩秀麗線蟲(chóng)衰老的研究[J].食品工業(yè),2013,34(1):122-125

[9] Xu Y,Long L,Yang C,et al.Maotai Ameliorates Diethylnitrosamine-initiated Hepatocellular Carcinoma Formation in Mice[J].PLoS ONE,2014,9(4):e93599

[10]Lowry O H,Rosebrough N J,Farr A L,et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].J BiolChem,1951,193(1):265-275

[11]Liu X D,Zhang Y C,Li J Q,et al.Cognitive deficits and decreased locomotor activity induced by single-walled carbon nanotubes and neuroprotective effects of ascorbic acid[J].Int J Nanomedicine,2014,9:823-839

[12]Das M,Babu K,Reddy N P,et al.Oxidative damage of plasma proteins and lipids in epidemic dropsy patients:Alterations in antioxidant status[J].Biochim Biophys Acta,2005,1722(2):209-217

[13]SidorczukI M G,Brzoska M M,Jurczuk M,et al.Oxidative damage to proteins and DNA in rats exposed to cadmium and/or ethanol[J].Chem Biol Interact,2009,180(1):31-38

[14]馬萍,焦銘,劉旭東,等.農(nóng)藥毒死蜱對(duì)小鼠肺細(xì)胞氧化損傷的研究[J].華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013,47(2):246-249

[15]付宇,王慧玉,可塵娟,等.雙酚A對(duì)小鼠肝臟和腎臟的氧化損傷[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2012,7(4):360-366

[16]Ma P,Liu X D,Wu J L,et al.Cognitive deficits and anxiety induced by diisononyl phthalate in mice and the neuroprotective effects of melatonin[J].Sci Rep,2015,5:14676

[17]Xiao G G,Wang M Y,Li N,et al.Use of proteomics to demonstrate a hierarchical oxidative stress response to diesel exhaust particle chemicals in a macrophage cell line[J].J Biol Chem,2003,278(50):50781-50790

[18]Li J Q,Li L,Cheng H Q,et al.Application of vitamin E to antagonize SWCNTs-induced exacerbation of allergic asthma[J].Sci Rep,2014,4:4275

The Research on the Antioxidation of Andrias davidianus Skin Brewed Spirit

LIU Xu-dong1，ZHANG Yu-chao1，YANG Liang1，YAN Hong2，WU Ji-guo3，WEI Sheng-jiang3，ZHAO Xue-feng3，WEI Gang1，4，*
（1.Moutai University of Moutai Distillery（Group）Co.Ltd.，Renhuai 564501，Guizhou，China；2.Aquatic Product Technical Advice Station of Guizhou Province，Guiyang 550001，Guizhou，China；3.Developing Office of Animal Hansbadry of Zheng'an，Zunyi 563400，Guizhou，China；4.Guiyang University，Guiyang 550001，Guizhou，China）

Andrias davidianus is a precious kind of amphibian in China.Its body especially its skins are rich in various nature active products.So it is the ideal material for making functional health care products，combine Guizhou Maotai-flavour spirit with Andrias davidianus has great economic and social benefits.The study aimed at doing a primary research on the antioxidation of Andrias davidianus skin brewed spirit.The result showed that for the mouse of the gavage brewed spirit group，there was no pathological alteration on liver tissue while in which the content of GSH and the activity of SOD rose significantly.The contents of ROS and MDA showed significant decrease；the contents of 8-OHdG，TNF-α，IL-1β showed no significant variation.The results indicated that Andrias davidianus skin brewed spirit had antioxidation to a certain extent，so as to increase the feasibility of further development of Andrias davidianus health care spirit.

Andrias davidianus；Maotai-flavour spirit；Andrias davidianus skin brewed spirit；antioxidation

2016-09-01

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.041

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.31360144）；2015年大鯢產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金（黔財(cái)農(nóng)[2015]198號(hào)）

劉旭東（1989—），男（漢），碩士，主要從事環(huán)境及食品毒理學(xué)研究。

*通信作者：魏剛（1954—），男（漢），教授，博士，主要從事兩棲動(dòng)物保護(hù)與利用研究。