磁響應交聯糖化酶聚集體的制備及催化特性

張雙正，陳國,2,3，蘇鵬飛

（1華僑大學化工學院生物工程與技術系，福建 廈門 361021；2福建省生物化工技術重點實驗室（華僑大學），福建 廈門361021；3華僑大學分析測試中心，福建 廈門 361021）

磁響應交聯糖化酶聚集體的制備及催化特性

張雙正1，陳國1,2,3，蘇鵬飛1

（1華僑大學化工學院生物工程與技術系，福建 廈門 361021；2福建省生物化工技術重點實驗室（華僑大學），福建 廈門361021；3華僑大學分析測試中心，福建 廈門 361021）

提出了一種采用羧基磁性納米粒子制備雜化磁響應交聯酶聚集體（M-CLEAs）的方法。表面羧基修飾的約10 nm的磁性納米粒子與酶分子表面的氨基位點通過靜電相互作用，形成復合物，在磁場作用下可將磁性納米粒子-酶復合物從溶液中分離，經戊二醛交聯即形成M-CLEAs。傳統的表面氨基修飾的磁性納米粒子與酶需在沉淀劑作用下，從溶液中分離，而后采用戊二醛共交聯，而本方法無須沉淀劑，過程更為簡化。以糖化酶為對象，對該過程的影響因素（交聯時間、pH、酶濃度、戊二醛濃度等條件）進行了探索，并對制得的M-CLEAs的酶學性質進行了較為詳細考察。結果表明，最優(yōu)制備條件為：酶濃度 1 mg·ml-1，磁流體濃度 10 mg·ml-1，戊二醛濃度0.25%(質量體積比)，在pH 6.0下交聯反應6 h，最終載酶量可達80 mg·g-1、比活為50 U·mg-1。制得的固定化酶pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性均顯著改善，可實現糖化酶重復使用10次，仍保留接近60%的酶活。

生物催化；酶；固定化；磁交聯酶聚集體；制備方法；糖化酶；酶學特性

引 言

酶是一種反應條件溫和、環(huán)境友好的生物催化劑，具有高效催化、高特異性和高選擇性等優(yōu)點，但其較低的熱穩(wěn)定性和難回收的特點限制了其在工業(yè)上的應用。通過酶固定化可有效提高酶的穩(wěn)定性，并增加酶的重復使用次數[1]。交聯酶聚集體（CLEAs）是由Sheldon等發(fā)展出來的一種無載體酶固定化技術，具有對酶純度要求低、無須載體、單位體積活性高、空間效率高、操作簡便等優(yōu)點，表現出良好的應用前景[2-3]。然而，CLEAs 在離心和過濾回收的過程中，存在機械強度較差、易破碎、回收煩瑣等問題[4-5]。在制備CLEAs的過程中，加入磁性納米粒子（MNP），形成雜化的磁響應交聯酶聚集體（M-CLEAs），可實現交聯酶聚集體在磁場下快速回收利用[6-8]。吳星濤等[9]將3-氨丙基三乙氧基硅烷處理后的穩(wěn)定磁性鐵氧化物顆粒加入葡萄糖苷酶酶液，以1,4-二氧六環(huán)作沉降劑和戊二醛作交聯劑制備了磁性交聯β-葡萄糖苷酶聚集體。Sojitra等[10]采用同樣的磁性納米粒子，與淀粉酶、果膠酶和纖維素酶混合后，直接采用戊二醛交聯，制備了磁響應的交聯三酶聚集體并用于果汁澄清。Liu等[11]采用同樣的方法，使用硫酸銨作沉淀劑，對淀粉酶進行固定化并用于分析淀粉酶的抑制物。Kumar等[12]采用同樣的磁性納米粒子，通過異丙醇先將漆酶沉淀在磁性粒子表面，然后戊二醛交聯制得漆酶CLEAs，用于染整污水的脫色。同樣的氨基修飾的磁性納米粒子亦被用于脂肪酶[13]、青霉素G?；D移酶[14]、纖維素酶[15]和糖化酶[16]等的固定化。目前，所有的磁響應交聯酶聚集體的制備均是采用氨基修飾的磁性納米粒子，在沉淀劑作用下與酶共沉淀后，通過交聯劑作用，將磁性粒子表面氨基與酶表面氨基共交聯后形成M-CLEAs。

本研究提出一種采用羧基修飾的磁性納米粒子直接與酶相互作用，在磁場作用下使酶快速從溶液中分離，然后直接進行交聯制備M-CLEAs。該方法可以不使用沉淀劑，省略沉淀后的離心和過濾操作，可大大簡化M-CLEAs的制備過程。本文將以糖化酶[17]為對象，對這一固定化酶過程進行研究。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

六水合三氯化鐵（FeCl3·6H2O）、四水合氯化亞鐵（FeCl2·4H2O）、油酸、氨水、高錳酸鉀、戊二醛、氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸、乙醇等購于廣東汕頭西隴化工有限公司，均為分析純；糖化酶購于湖南鴻鷹翔生物工程股份有限公司；實驗用水為去離子水。

1.2 羧基磁性納米粒子的制備

參考本實驗室制備方法[18-19]。稱取FeCl3·6H2O 8.1 g溶于142.5 ml去離子水，轉移到三口燒瓶中，攪拌加熱至70℃。稱取FeCl2·4H2O 4.4 g溶于10 ml去離子水中，過濾后取7.5 ml加入三口燒瓶。在400 r·min-1劇烈攪拌條件下，快速加入 18 ml濃氨水（250 g·L-1），1 min后，逐滴加入4.66 g油酸，70℃下繼續(xù)攪拌1 h。反應結束后，得黑色溶膠狀溶液，磁分離后從反應體系中獲得膠狀沉淀。用無水乙醇洗滌 2次除去多余的油酸，再用去離子水洗滌至pH=7。然后加入160 ml濃度為10 mg·ml-1的高錳酸鉀溶液，寧波新芝超聲波清洗儀 SB-3200DT（180 W）超聲振蕩8 h（每超聲20 min停20 min），磁分離后用去離子水洗滌3次，得磁流體。真空冷凍干燥40 h，得到表面修飾有羧基的磁性納米粒子粉末。

1.3 M-CLEAs的制備

在10 ml試樣瓶中加入3 ml的 2 mg·ml-1的糖化酶酶液（濃度200 mmol·L-1、pH 5.0的醋酸鹽緩沖液配制），及一定量的濃度為20 mg·ml-1的磁流體。在6℃搖床中，200 r·min-1轉速下振蕩20 min后，磁分離得聚集體，加入一定量的戊二醛（0.25%，質量體積比，后同），6℃下，150 r·min-1繼續(xù)振蕩6 h后，磁分離得固形物，去離子水洗滌數次后得到M-CLEAs，并加入醋酸緩沖液（200 mmol·L-1,pH5.0）重懸待用。

1.4 酶活測定方法

取一定量游離酶或固定化酶，分散在3 ml的醋酸緩沖液（200 mmol·L-1, pH5.0）中，加入5 ml的預糊化淀粉（20 g·L-1），60℃水浴振蕩5 min，加1 ml的2 mol·L-1氫氧化鈉溶液終止反應，DNS法測反應液中還原糖濃度（若為固定化酶需磁分離后測定），計算酶活。

1.5 載酶量、相對酶活、殘余酶活的計算

1.6 酶穩(wěn)定性及最適條件測定

1.6.1 最適pH和最適溫度 平行取6份10 mg的固定化糖化酶樣品或1 ml的游離糖化酶酶液（0.55 mg·ml-1），分別分散到 3 ml的醋酸緩沖液（200 mmol·L-1）中，加入 5 ml的預糊化淀粉（20 g·L-1），反應5 min后終止反應，計算酶活。測最適pH時，溫度設定為60℃，醋酸緩沖液pH分別為3.0、3.6、4.2、4.8、5.4、6.0；測最適溫度時，pH設定為4.8，反應溫度分別為30、40、50、60、70、80℃。

1.6.2 pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性 平行取6份10 mg固定化糖化酶或1 ml的游離糖化酶酶液(0.55 mg·ml-1)，分別分散到3 ml的醋酸緩沖液（200 mmol·L-1）中，一定溫度下放置5 h，然后在60℃下測其酶活。測pH穩(wěn)定性時，放置溫度設定為30℃，醋酸緩沖液pH分別為3.0、3.6、4.2、4.8、5.4、6.0；測溫度穩(wěn)定性時，pH設定為4.8，放置溫度分別為30、40、50、60、70、80℃。

考察儲存穩(wěn)定性時，將固定化糖化酶和游離糖化酶分別在30℃下放置1、2、4、6、8、10、15、20、25、30 d，然后將固定化糖化酶在pH 4.8和60℃測酶活，游離糖化酶在pH 4.2和60℃測酶活。

1.7 分析與表征

紅外分析使用 Shimadzu 8400S型傅里葉變換紅外儀，溴化鉀壓片法測定；熱重分析用DTG-60H型熱重分析儀在N2氛圍下，以10℃·min-1的加熱速度，加熱至1000℃測定。

2 實驗結果與討論

2.1 M-CLEAs的制備及表征

圖1 羧基修飾磁性納米粒子與酶的共交聯Fig.1 M-CLEAs prepared from carboxyl modified MNP and enzyme

文獻報道的磁響應聚集體的制備[2]一般采用表面氨基修飾的磁性納米粒子與酶混合，磁性納米粒子和酶相互作用力較弱，需加入沉淀劑輔助將磁性納米粒子和酶共沉淀，然后加入交聯劑共交聯形成雜化磁響應性酶聚集體（M-CLEAs）。戊二醛在酶分子表面的氨基之間、酶分子與磁性納米粒子表面的氨基之間、磁性納米粒子表面的氨基之間進行交聯，在形成的酶聚集體中磁性納米粒子參與了交聯反應。本研究提出的磁響應聚集體的制備機理如圖1所示，表面羧基修飾的磁性納米粒子與酶分子表面的氨基發(fā)生靜電相互作用，由于酶分子的尺寸（約10 nm）與磁性納米粒子的尺寸（約10 nm）相當，可發(fā)生如圖 1中一個磁性粒子與多個酶分子作用（Type1）或一個酶分子與多個磁性粒子作用（Type2）兩種情況的靜電吸附，無須加入沉淀劑，通過外磁場可直接將磁性納米粒子與酶分子的復合體從溶液中分離出來，之后加入的戊二醛僅在酶分子之間交聯，交聯的過程中將磁性納米粒子包覆在酶聚集體中形成M-CLEAs。在圖1的機理中，磁性納米粒子并未參與交聯反應。

圖2是對糖化酶及M-CLEAs的紅外分析，在3435 cm-1處為—OH的伸縮振動引起的強吸收峰，2961 cm-1和2926 cm-1處的峰是CH2的伸縮振動吸收峰，1655 cm-1是C O的伸縮振動吸收峰，1420 cm-1是酰胺鍵中的C—N伸縮振動的吸收峰，這些特征峰在譜帶a與b中均存在，為糖化酶中的特征峰，譜a中的465 cm-1和588 cm-1為Fe3O4的特征峰，由此可知糖化酶已成功與磁性納米粒子形成了復合物。圖3是M-CLEAs的熱重分析，熱失重峰分別在48.6、262.6、341.8、646.4和754.4℃。從初始至97.0℃的熱失重來自體系中的水；其后的兩個失重峰分別是通過吸附作用和戊二醛交聯作用結合在磁性納米粒子表面上的糖化酶，各為 9.0%和4.7%，共13.7%，最后兩個熱失重峰，共 10.0%的失重為磁性納米粒子表面的壬二酸，與已有研究一致[18-19]。M-CLEAs的總的熱失重為 28%，除去其中水、戊二醛和壬二酸的熱失重19%，酶的熱失重約為 9%，與后續(xù)通過交聯前后蛋白濃度差測定的固定化量接近。

圖2 M-CLEAs的紅外譜圖Fig.2 FT-IR spectra of M-CLEAs (a) and free glucoamylase(b)

圖3 M-CLEAs的熱重分析Fig.3 TGA analysis of M-CLEAs

2.2 M-CLEAs的制備條件考察

2.2.1 交聯時間對固定化的影響 圖4為交聯時間對酶負載量和固定化酶活性的影響，M-CLEAs制備條件不變，僅改變交聯時間。由圖可知，隨交聯時間延長，固定化糖化酶的載酶量基本不變，說明吸附階段糖化酶與磁性納米粒子結合已較穩(wěn)定，交聯階段對酶和粒子的相互作用影響較小。在6 h以前，酶活緩慢增加，其后，酶活快速下降，因此應保證交聯時間小于6 h。隨著固定化時間的延長，酶的交聯過于充分，使酶的柔性大大降低，因而降低了酶的活性。Liu等[11]研究0.5%的戊二醛交聯淀粉酶2 h得到較優(yōu)結果，本研究采用 0.25%的戊二醛交聯糖化酶6 h較優(yōu)。

圖4 交聯時間對載酶量和M-CLEAs活性的影響Fig.4 Effect of crosslinking time on enzyme loading (■) and activity (☆) of M-CLEAs

2.2.2 初始糖化酶濃度對固定化的影響 圖5為糖化酶濃度對固定化的影響，M-CLEAs制備條件不變，僅改變初始糖化酶濃度。載酶量隨著初始酶濃度增加而增加，在初始酶濃度為2.5 mg·ml-1時達到平衡，而固定化酶酶活在初始酶濃度達到 0.5 mg·ml-1即基本達到平衡。過高的載酶量對酶活增加并無優(yōu)勢，載酶量的增加反而可能導致底物傳遞限制和酶的柔性變差，進而使其比活下降。因此，控制載酶量對于固定化過程具有重要意義。

2.2.3 戊二醛濃度對固定化的影響 圖6反映了戊二醛濃度對固定化的影響，M-CLEAs制備條件不變，僅改變戊二醛濃度。固定化酶隨戊二醛濃度的增加，載酶量變化很小，但酶活在戊二醛濃度為0.4%時達最大，之后迅速降低。因為吸附在磁性納米粒子表面的酶分子是一定的，隨交聯劑的增加，過多的活性醛基導致酶分子與酶分子之間充分交聯，不僅產生空間結構障礙阻礙了底物與酶分子活性中心的接觸，而且使酶分子的柔性大大降低。這與前述延長交聯時間的作用類似，都導致了酶活性的快速下降。文獻[16, 20] 報道，制備α-淀粉酶的M-CLEAs時，戊二醛濃度為50 mmol·L-1最優(yōu)，其濃度約為0.5%，與本研究較為相近；使用二醛果膠作為交聯劑制備糖化酶M-CLEAs，二醛果膠濃度為1.5%時活性最高；可見交聯劑的種類與其使用濃度也密切相關。因此宜采取較低濃度戊二醛條件下控制交聯時間的策略制備M-CLEAs，但濃度過低的戊二醛會大大增加戊二醛交聯時間，對交聯效率和M-CLEAs的酶活均有不利影響。

圖5 交聯過程糖化酶濃度對載酶量和M-CLEAs活性的影響Fig.5 Effect of glucoamylase concentration on enzyme loading (■) and activity (☆) of M-CLEAs during cross-linking

圖6 交聯過程戊二醛濃度對載酶量和M-CLEAs活性的影響Fig.6 Effect of GA concentration on enzyme loading (■) and activity (☆) of M-CLEAs during cross-linking

2.2.4 pH對固定化的影響 圖7為pH對固定化的影響，M-CLEAs制備條件不變，僅改變交聯反應pH。由圖可知，隨pH增加，載酶量逐漸減少，而酶活逐漸增大至pH6.0后穩(wěn)定。糖化酶的等點電在pH4.5附近[21-22]，羧基磁性納米粒子等電點在pH2.0附近[18,23-24]，當pH處于2.0～4.0之間時，兩者表面所帶的整體電荷相反，有利于磁性納米粒子與酶的相互作用。在不同的pH環(huán)境下，酶分子表面電荷分布有差異，從而改變粒子表面的羧基與酶表面氨基結合的位點，因而對其酶活影響顯著[25]。

圖7 交聯過程pH對載酶量和M-CLEAs活性的影響Fig.7 Effect of cross-linking pH on enzyme loading (■) and activity (☆) of M-CLEAs

圖8 游離糖化酶和M-CLEAs的最適pHFig.8 Optimum pH of free enzyme (●) and M-CLEAs (■)

2.3 M-CLEAs的特性

2.3.1 最適pH和pH穩(wěn)定性 圖8比較了不同pH下游離糖化酶酶活和M-CLEAs的酶活。由圖可知，游離酶最適pH為4.8，而固定化酶最適pH為4.2，但固定化酶在pH3.0～5.5酶活變化不大，因此表現出較好的pH適應性，能應用于pH較寬的反應體系。與游離酶相比，M-CLEAs的最適pH有所下降，與Talekar等[20]采用戊二醛交聯制得的M-CLEAs趨勢相同，但與 Nadar等[16]采用大分子交聯劑制得的M-CLEAs趨勢相反。圖 9比較了游離糖化酶和M-CLEAs的 pH穩(wěn)定性，可以看出 M-CLEAs在pH3.0～4.8均較穩(wěn)定，pH穩(wěn)定性明顯優(yōu)于游離酶。

圖9 游離糖化酶和M-CLEAs的pH穩(wěn)定性Fig.9 pH stability of free enzyme (●) and M-CLEAs (■)

2.3.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 圖 10比較了溫度對游離糖化酶酶活和 M-CLEAs的酶活的影響。M-CLEAs的最適溫度為 70℃，而游離糖化酶的最適溫度為60℃。但由圖11游離糖化酶和M-CLEAs熱穩(wěn)定性的比較可知道，M-CLEAs在 70℃的熱穩(wěn)定性較差，游離糖化酶在60℃的熱穩(wěn)定性較差，均不適合在最適溫度下操作。相比游離酶，M-CLEAs在30～60℃的熱穩(wěn)定性均有較大的提高，因為載體和交聯劑一定程度增加了酶的剛性，使其不易變性，故提高了其在高溫下的穩(wěn)定性[26-29]。兼顧酶活和熱穩(wěn)定性，50℃應是 M-CLEAs的適宜的操作溫度。

圖10 游離糖化酶和M-CLEAs的最適溫度Fig.10 Optimum temperature of free enzyme (●) and M-CLEAs (■)

圖11 游離糖化酶和M-CLEAs的溫度穩(wěn)定性Fig.11 Thermal stability of free enzyme (●) and M-CLEAs (■)

圖12 游離糖化酶和M-CLEAs的儲存穩(wěn)定性Fig.12 Storage stability of free enzyme (●) and M-CLEAs (■)

圖13 M-CLEAs操作穩(wěn)定性Fig.13 Operation stability of M-CLEAs

2.3.3 儲存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性 圖 12為游離糖化酶和M-CLEAs的儲存穩(wěn)定性比較。相同條件下，糖化酶固定化之后的儲存穩(wěn)定性明顯提高，30℃下游離酶保存4 d后殘余酶活低于20%，而固定化酶在保存15 d后的殘余酶活仍高達85%。這是因為糖化酶經戊二醛交聯之后，構象發(fā)生改變，剛性增加，因而增加了其在室溫下的穩(wěn)定性。此外，4℃儲存穩(wěn)定性的研究表明，固定化糖化酶放置兩個月不會有明顯的變化，有較好的儲存穩(wěn)定性。圖 13為M-CLEC的操作穩(wěn)定性。由圖可知，M-CLEAs連續(xù)使用10次后，仍能保持接近60%的酶活，展現了較好的重復使用性能。

2.3.4 動力學參數 通過 Lineweaver-Burk線性擬合，計算酶反應的最大反應速率 Vmax及米氏常數Km，如表 1所示。糖化酶在固定化之后，Km值變大，說明固定化后酶與底物的親和性降低[30]。最大反應速率Vmax大大降低，因為糖化酶底物為分子量較大的糊化淀粉，M-CLEAs顆粒與底物之間的結合的位阻迅速增加，進而導致表觀反應速率的降低[5]。

表1 M-CLEAs與游離酶動力學參數的比較Table 1 Comparison of kinetic parameters of free glucoamylase and M-CLEAs

3 結 論

表面羧基修飾的磁性納米粒子在合適的pH作用下，可與酶表面的氨基發(fā)生較強的靜電相互作用，通過戊二醛的交聯，可以形成磁響應性交聯酶聚集體。以糖化酶為研究對象表明：pH 6.0、1 mg·ml-1的酶濃度，10 mg·ml-1的磁流體濃度，戊二醛濃度0.25%，交聯6 h，能夠獲得載酶量為80 mg·g-1、比活在50 U·mg-1左右的固定化糖化酶。與游離酶相比，形成的納米酶復合物的最適溫度、最適pH均發(fā)生了一定變化，穩(wěn)定性明顯提高，而且固定化后的糖化酶可以重復利用，但納米酶復合物 Km值較大，與底物的親和性較差。因此，本研究提供的羧基磁性納米粒子與酶先靜電吸附，磁場輔助沉淀，后共交聯制備磁響應性交聯酶聚集體，是一種有效的酶固定化方法。

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Preparation and characterization of magnetic cross-linked glucoamylase aggregates

ZHANG Shuangzheng1, CHEN Guo1,2,3, SU Pengfei1
(1Department of Bioengineering and Biotechnology, College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, Fujian,China;2Fujian Provincial Key Laboratory of Biochemical Technology (Huaqiao University), Xiamen 361021, Fujian, China;3Instrumental Analysis Center, Huaqiao University, Xiamen 361021, Fujian, China)

The paper presents a method for preparing hybrid magnetic cross-linked enzyme aggregates (M-CLEAs)using carboxyl magnetic nanoparticles (MNP). The magnetic nanoparticle-enzyme complexes induced by electrostatic interaction between carboxyl group of magnetic particle and amino group of enzyme were separated from the solution under magnetic field, and then were cross-linked by glutaraldehyde. The traditional method of M-CLEAs preparation from amino-modified magnetic nanoparticles and the enzyme need the precipitant to prompt the separation of enzyme and magnetic nanoparticle from the solution. The method here proposed does not need the precipitant, thereof the process is greatly simplified. In this paper, the factors of cross-linking time, pH,enzyme concentration and concentration of glutaraldehyde in M-CLEAs preparation process were studied, and then the enzymatic properties of M-CLEAs were also investigated in detail. The results showed that the optimum conditions were as follows： enzyme concentration of 1 mg·ml-1, magnetic fluid concentration of 10 mg·ml-1,glutaraldehyde concentration of 0.25% and crosslinking reaction at pH 6.0 for 6 h. The final enzyme loading reached 80 mg·g-1and the activity of M-CLEAs was 50 U·mg-1. The pH stability, thermostability and storage stability of the immobilized enzyme improved significantly, and M-CLEAs still remained nearly 60% of activity after 10 cycles.

biocatalysis; enzyme; immobilization; magnetic cross-linked enzyme aggregates; preparation method;glucoamylase; characterization of enzyme

date:2016-11-07.

Prof. CHEN Guo, chenguo@hqu.edu.cn

supported by the National Natural Science Foundation of China (21576108), Program for New Century Excellent Talents in Fujian Province University, and Research Innovation Ability Cultivation Program for Graduate Student of Huaqiao University.

Q 814

A

0438—1157（2017）07—2763—08

10.11949/j.issn.0438-1157.20161565

2016-11-07收到初稿，2017-03-31收到修改稿。

聯系人：陳國。

張雙正（1991—），男，碩士研究生。

國家自然科學基金面上基金項目(21576108)；福建省新世紀優(yōu)秀人才項目；華僑大學研究生科研創(chuàng)新能力培育計劃資助項目。