β-arrestin1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其對肺癌細(xì)胞增殖的影響

劉 曉 胡 崗 陳一凡 廖俊喆 徐 敏 劉 波

(成都市第五人民醫(yī)院呼吸科，四川 成都 611130)

β-arrestin1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其對肺癌細(xì)胞增殖的影響

劉 曉 胡 崗 陳一凡 廖俊喆 徐 敏 劉 波

(成都市第五人民醫(yī)院呼吸科，四川 成都 611130)

目的 探討非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞系和組織中β-arrestin1的表達(dá)及β-arrestin1對肺癌細(xì)胞增殖能力的影響。方法 收集該院經(jīng)手術(shù)治療的30例NSCLC患者的癌組織標(biāo)本(NSCLC組)和肺良性病變邊緣正常肺組織標(biāo)本(對照組)，培養(yǎng)NSCLC細(xì)胞系(SPC-A-1、H460、H520、H1975)和人正常肺上皮細(xì)胞系16HBE，分別提取NSCLC組、對照組及細(xì)胞系總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)用于檢測β-arrestin1 mRNA的表達(dá)，蛋白印跡法(Western印跡)和免疫組化(IHC)分別檢測細(xì)胞系和組織中的β-arrestin1蛋白的表達(dá)水平。MTT實(shí)驗(yàn)檢測分別轉(zhuǎn)染sh-β-arrestin1質(zhì)粒和對照質(zhì)粒sh-control到SPC-A-1細(xì)胞后對NSCLC細(xì)胞SPC-A-1增殖能力的影響。結(jié)果 β-arrestin1 mRNA和蛋白表達(dá)水平在NSCLC組織和細(xì)胞系中分別高于對照組和16HBE細(xì)胞(P<0.05)。轉(zhuǎn)染sh-β-arrestin1質(zhì)粒后，β-arrestin1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)，且在MTT實(shí)驗(yàn)中可顯著抑制ASPC-A-1的增殖能力(P<0.05)。結(jié)論 β-arrestin1在NSCLC組織和細(xì)胞系中呈高表達(dá)，且可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖。

非小細(xì)胞肺癌；β-arrestin1

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%。發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期NSCLC患者在得不到有效治療時的中位數(shù)生存期僅為4～5個月，1年生存率<10%〔1〕。臨床上NSCLC的主要治療形式包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、綜合治療、靶向治療及中藥治療等，而不同NSCLC患者對不同治療方案的敏感性不同，腫瘤自身及機(jī)體特異性也會限制治療方式〔2〕。腫瘤的發(fā)生是一個多基因參與的復(fù)雜過程，β-arrestin1是Arrestin蛋白家族的成員之一，具有多種功能的信號蛋白，β-arrestin1在腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用〔3〕，且β-arrestin1可通過與磷酸化的G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)結(jié)合形成β-arrestin1的受體復(fù)合物，并以銜接蛋白的形式激活絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白激酶B(AKT)和磷酯酰肌醇-3激酶(PI3K)等多種信號通路的激活，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔4〕。已有研究證實(shí)β-arrestin1可促進(jìn)卵巢癌〔5〕和前列腺癌〔6〕的侵襲或轉(zhuǎn)移，但關(guān)于β-arrestin1在NSCLC中的表達(dá)及作用的研究極少且不明確，僅有β-arrestin1可促進(jìn)尼古丁誘導(dǎo)的NSCLC轉(zhuǎn)移〔7〕，β-arrestin1的表達(dá)缺失與NSCLC患者的較差預(yù)后密切相關(guān)〔8〕。本研究旨在探究β-arrestin1對NSCLC細(xì)胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 兔抗人β-arrestin1單抗和兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多抗(CST，USA)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(博士德，湖北武漢)，β-arrestin1的抑制性慢病毒載體質(zhì)粒sh-β-arrestin1及對照空載體質(zhì)粒sh-control(GeneCopoeia構(gòu)建，USA)，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol(Invitrogen，USA)，TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life Technologies，USA)，qSYBR-Green-containing PCR kit試劑盒(GeneCopoeia，USA)，蛋白提取試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒(Thermo，USA)，兩步法免疫檢測試劑盒(Dako，USA)，噻唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞生長增殖/毒性檢測試劑盒(Sigma，USA)，BioRad IQTM5 Multicolor實(shí)時熒光定量系統(tǒng)(BioRad，USA)，奧林巴斯正置顯微鏡 OLYMPUS BX51(Olympus，日本，配合UIS2光學(xué)成像系統(tǒng)使用)，ChemiDocTM觸摸成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA，配合Image LabTMTouch軟件Version 1.0使用)，Multiskan MK 3酶標(biāo)儀(Thermo，USA)，紫外可見分光光度儀(Thermo，USA，Nanodrop 2000)。

1.2 臨床樣本 本研究中所有組織樣本均來源于成都市第五人民醫(yī)院2014年1月至2015年12月經(jīng)手術(shù)治療的30例NSCLC患者(NSCLC組)，標(biāo)本均經(jīng)本院病理科證實(shí)。NSCLC患者術(shù)前均未接受過任何化療及放療，其中男和女各15例，年齡25～80歲，平均(56.9±2.3) 歲，分別取30例NSCLC患者的癌病變切除組織和肺良性病變邊緣5 cm以上的正常肺組織(對照組)。取術(shù)中切除的新鮮組織，立即置于RNAlater中，于-80℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。30例患者的石蠟標(biāo)本均由本院病理科提供，4 μm厚連續(xù)切片10張。該實(shí)驗(yàn)的所有過程均遵從赫爾辛基宣言的標(biāo)準(zhǔn)，且該研究得到本院倫理委員會的批準(zhǔn)，且患者簽署了知情同意書。

1.3 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) NSCLC細(xì)胞系(SPC-A-1)細(xì)胞，H460，H520，H1975和人正常肺上皮細(xì)胞系(16HBE，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院生化細(xì)胞所)均培養(yǎng)于含10%胎牛血清(BSA)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，USA)中，細(xì)胞置于37℃，飽和濕度，含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 在SPC-A-1細(xì)胞生長匯合度達(dá)到80%～90%時收集細(xì)胞，用含10% BSA的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至濃度為5×104個/ml的細(xì)胞懸液，按2 ml每孔加入6孔板，細(xì)胞匯合度約為60%～80%時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。使用無菌EP管配制Lipofectamin 2000和轉(zhuǎn)染試劑(sh-β-arrestin1或sh-control)，兩者輕輕混勻，室溫放置20 min。將上述混合物與不含抗生素的無血清培養(yǎng)基輕輕混勻，加入到待轉(zhuǎn)染的6孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后換為常規(guī)培養(yǎng)基。48 h后，收集細(xì)胞，提取蛋白或RNA，或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 RNA提取和qRT-PCR檢測 取術(shù)中新鮮獲得的NSCLC組織和正常組織各100 mg，分別加入700 μl TRIzol試劑，充分研磨，(細(xì)胞系總RNA提取時每個六孔板中加入100 μl TRIzol試劑，其余試劑均按組織RNA提取時用量的1/7加入)。室溫放置5 min后加入氯仿140 ml，劇烈震蕩15 s后室溫放置5 min，隨后4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上層液體到另一干凈的EP管，按照每1 ml Trizol中加入0.5 ml異丙醇的比例加入異丙醇，混勻，室溫放置10 min，離心去上清。1 ml 75%乙醇洗滌沉淀，4℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥，加入30 μl無酶水溶解，取1 μl測RNA濃度及純度，其余-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以從組織或細(xì)胞系中提取的總RNA為模板，按照TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行操作，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，以cDNA為模板，按照實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)的說明書進(jìn)行操作，進(jìn)行CT值的測定。其中GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCT用于計(jì)算β-arrestin1基因的相對表達(dá)量，ΔΔCT =(CT gene-CTGAPDH)target-(CT gene-CTGAPDH)對照，反應(yīng)體系為20 μl，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個復(fù)孔。

1.6 蛋白提取和Western印跡檢測 按照蛋白提取試劑盒、ECL試劑盒和BCA蛋白定量檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作，分別提取細(xì)胞總蛋白并測定蛋白濃度。分別取30 μg樣本，進(jìn)行10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟丙烯(PVDF)膜上，5%的BSA室溫封閉1～2 h，加入1∶5 000的兔抗人β-arrestin1抗體和1∶10 000兔抗人GAPDH抗體4℃過夜。Tirs鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，10 min/次，加入1∶800的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，加入ECL發(fā)光劑并曝光，采用ChemiDocTM觸摸成像系統(tǒng)掃描并保存蛋白條帶的圖片。Quantity One軟件分析，以目的蛋白β-arrestin1和內(nèi)參GAPDH的蛋白條帶的灰度值比值來確定目的蛋白的相對表達(dá)水平，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個復(fù)孔。

1.7 MTT法檢測β-arrestin1對SPC-A-1細(xì)胞增殖能力的影響 將實(shí)驗(yàn)分成sh-control組和sh-β-arrestin1組。將sh-control和sh-β-arrestin1分別轉(zhuǎn)染到SPC-A-1細(xì)胞中，細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔，在未接種細(xì)胞的孔中加入DMEM為調(diào)零孔，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。隨后每孔加入30 μl的MTT試劑，37℃孵育2 h后，每孔中加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min至使結(jié)晶物充分融解。酶標(biāo)儀測定492 nm波長處的OD492值并記錄，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個復(fù)孔，對照組為sh-control組。

1.8 免疫組化(IHC) 將切片依次放入二甲苯-二甲苯-100%無水乙醇-95%無水乙醇-80%無水乙醇-70%無水乙醇中脫蠟，各5 min。隨后高壓鍋內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)(玻片置于檸檬酸緩沖液中)，在高壓蒸汽鍋冒氣后，煮5 min，使抗原位點(diǎn)暴露，玻片置于室溫冷卻，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，共3次，5 min/次，輕輕擦干組織周圍PBS，37℃血清封閉30 min，吸水紙擦干組織周圍血清，滴加β-arrestin1抗體，按1∶500稀釋，4℃孵育過夜。第2天進(jìn)行PBS沖洗，共3次，5 min/次，擦干組織旁PBS，孵育二抗，37℃孵育60 min。

PBS沖洗共3次，5 min/次，加顯色劑(按照Dako兩步法免疫組化試劑盒的說明書進(jìn)行操作，B溶液和C溶液按50∶1混合)，清水沖洗10 min后，蘇木精復(fù)染，水中沖洗干凈切片，依次放入70%無水乙醇-80%無水乙醇-95%無水乙醇-100%無水乙醇-二甲苯-二甲苯。各2 min，將切片置于通風(fēng)櫥中，中性樹膠封片晾干，顯微鏡下采集200倍的圖像，β-arrestin1蛋白表達(dá)的定性研究采用直接觀察是否在胞質(zhì)中表達(dá)，根據(jù)陽性細(xì)胞在全部組織細(xì)胞中所占比例和陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，A：按顯色細(xì)胞數(shù)計(jì)分，陽性細(xì)胞數(shù)<1/3為1分，1/3～2/3為2分，>2/3為3分。B：按細(xì)胞顯色深淺計(jì)分，無陽性反應(yīng)細(xì)胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。積分?jǐn)?shù)=A×B。A×B=0判斷為(-)，A×B=1～2判斷為(+)，A×B=3～4為()，A×B=5～9為()，β-arrestin1蛋白表達(dá)的半定量評分由本院三位病理科技術(shù)人員共同閱片打分，取平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析+LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 β-arrestin1在SPC-A-1、H460、H520、H1975細(xì)胞系和正常肺16HBE的表達(dá) 16HBE相比，β-arrestin1 mRNA和蛋白表達(dá)水平在NSCLC細(xì)胞系中均表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。見圖1。

2.2 β-arrestin1在NSCLC組和對照組中的表達(dá) 與對照組比較，β-arrestin1 mRNA和蛋白表達(dá)水平在NSCLC組織中均表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。β-arrestin1定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色者為陽性染色。β-arrestin1在對照組中96.7%(29/30)染色弱陽性，為低表達(dá)，在NSCLC組中80.0%(24/30)染色強(qiáng)陽性，為高表達(dá)。見圖2。

2.3 β-arrestin1對NSCLC細(xì)胞SPC-A-1增殖能力的影響 見圖3。轉(zhuǎn)染sh-β-arrestin1組的β-arrestin1蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著低于sh-control組，即轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染48 h后，與sh-control組相比，sh-β-arrestin1組的細(xì)胞增殖能力被顯著抑制(P<0.05)。兩組MTT OD平均值為0.91，0.33。

圖1 β-arrestin1在NSCLC細(xì)胞系和16HBE中的表達(dá)

圖2 β-arrestin1在NSCLC癌組織和癌旁組織中的表達(dá)(DAB，×200)

圖3 β-arrestin1對NSCLC細(xì)胞SPC-A-1增殖能力的影響

3 討 論

NSCLC患者的生存期和生活質(zhì)量的改善狀況仍不理想〔9〕。NSCLC的治療方案常根據(jù)疾病的分期、組織類型、并發(fā)癥或體力狀況來決定，不同的病人所采用的治療方案各不相同，其生存期的延長也不同〔10〕。因此發(fā)現(xiàn)NSCLC中異常表達(dá)的基因，尋找治療NSCLC的特異性靶點(diǎn)，將大大提升臨床上NSCLC患者的治療效果。β-arrestin1是一類重要的多功能支架蛋白和信號調(diào)控因子，是Arrestin家族(S-arrestin、X-arrestin、β-arrestin1和β-arrestin2)成員之一，其廣泛存在人體的各種組織細(xì)胞中，可通過促進(jìn)GPCR的脫敏、內(nèi)化或信號傳導(dǎo)，從而激活多種受GPCR調(diào)控的信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化活動〔4〕。另外β-arrestin1還參與了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，參與多種腫瘤相關(guān)的信號通路的調(diào)控，β-arrestin1的異常表達(dá)和功能異常在多種疾病的進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用，如β-arrestin1可促進(jìn)腎臟、心血管、膽囊和肺的纖維化〔11〕。通過敲除小鼠的β-arrestin1基因，小鼠的存活率得到了明顯提升，且敲除β-arrestin1的小鼠原始肺成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出更弱的遷徙能力〔12〕。鑒于β-arrestin1在疾病發(fā)展中的重要作用，推測β-arrestin1在NSCLC中也發(fā)揮了重要的作用，可能是肺癌治療的新靶點(diǎn)。

目前關(guān)于β-arrestin1在NSCLC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)及其對肺癌細(xì)胞增殖影響的研究較少〔7,8〕，本研究從細(xì)胞系的角度表明了β-arrestin1的高表達(dá)與NSCLC疾病的發(fā)生有關(guān)，該結(jié)果與白血病細(xì)胞系中β-arrestin1高表達(dá)相一致〔13〕。本研究從病人組織標(biāo)本的角度表明了β-arrestin1的高表達(dá)與NSCLC疾病的發(fā)生有關(guān)。其與β-arrestin1在肺腺癌組織中高表達(dá)并與血管內(nèi)皮生長因子相關(guān)的研究一致〔14〕。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示β-arrestin1能顯著抑制肺癌細(xì)胞SPC-A-1的增殖能力，與已有研究結(jié)果相一致〔13〕。本研究說明β-arrestin1有潛力成為NSCLC治療的新靶點(diǎn)，通過β-arrestin1抑制劑干預(yù)NSCLC患者中β-arrestin1的表達(dá)，將可能延長NSCLC腫瘤患者的生存期，并最終改善患者的生存質(zhì)量。

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〔2017-04-12修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

四川省醫(yī)學(xué)科研青年創(chuàng)新課題(No.Q16008)

劉 波(1973-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病的診斷及治療研究。

劉 曉(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事肺癌的早期診斷與治療研究。

R73

A

1005-9202(2017)13-3137-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.007