蜂毒肽對(duì)大鼠退行性骨關(guān)節(jié)病軟骨細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響

湯發(fā)強(qiáng) 吳 宏 鄭建章 胡世平 郭徽靈 顏來(lái)鵬 許春財(cái) 林蘊(yùn)碩

(福建省立醫(yī)院骨科，福建 福州 350001)

蜂毒肽對(duì)大鼠退行性骨關(guān)節(jié)病軟骨細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響

湯發(fā)強(qiáng) 吳 宏 鄭建章 胡世平 郭徽靈 顏來(lái)鵬 許春財(cái) 林蘊(yùn)碩

(福建省立醫(yī)院骨科，福建 福州 350001)

目的 探究蜂毒肽對(duì)大鼠退行性骨關(guān)節(jié)病軟骨細(xì)胞核因子(NF)-κB信號(hào)通路的影響。方法 成功建立大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型，分別于關(guān)節(jié)腔注射蜂毒肽，并體外分離慢性骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，采用體外增殖CCK8實(shí)驗(yàn)及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，觀察蜂毒肽對(duì)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用；采用Western印跡法分別檢測(cè)了不同劑量下蜂毒肽影響白細(xì)胞介素(IL)-1誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的激活情況。結(jié)果 成功建立大鼠膝關(guān)節(jié)來(lái)源的體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)體系后，經(jīng)細(xì)胞增殖CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與慢性骨關(guān)節(jié)炎組相比，慢性骨關(guān)節(jié)炎+蜂毒肽組膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖能力最強(qiáng)；經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成骨關(guān)鍵分子〔成骨特異轉(zhuǎn)錄因子核心結(jié)合因子(Runx)2,堿性磷酸酶(ALP),成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Osterox)〕的表達(dá)結(jié)果顯示，相比于慢性骨關(guān)節(jié)炎組，慢性骨關(guān)節(jié)炎+蜂毒肽組早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因(Sox)9、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CEBP)2、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)因子表達(dá)均上調(diào)。經(jīng)Western 印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨蜂毒肽濃度的逐漸增高，IL-1β誘導(dǎo)核因子(NF)-κB及I-κB的表達(dá)條帶顏色逐漸遞減，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，降低程度逐漸明顯。結(jié)論 蜂毒肽通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活以起到骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)。

蜂毒肽；慢性骨關(guān)節(jié)炎；核因子(NF)-κB

長(zhǎng)期慢性炎癥刺激所致關(guān)節(jié)軟骨及滑膜損害、增生、融合是引起后續(xù)關(guān)節(jié)僵硬的重要因素〔1,2〕。蜂毒肽可促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素及促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素的釋放，進(jìn)而起到抵抗自身免疫等作用〔3〕。蜂毒肽癥明顯減輕兔的滑膜炎〔4〕。相比于吲哚美辛，蜂毒肽對(duì)前列腺素合成酶的抑制作用更強(qiáng)，約70倍，同時(shí)也具有良好的鎮(zhèn)痛作用〔5〕。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展是包括多種炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子、機(jī)械性應(yīng)力等因素共同作用的結(jié)果。而各因素均通過(guò)刺激關(guān)節(jié)內(nèi)細(xì)胞進(jìn)而引起相應(yīng)的病理效應(yīng)〔6〕。刺激因素引起的病理效應(yīng)，需要將信號(hào)經(jīng)細(xì)胞傳遞至細(xì)胞內(nèi)部。正是由于這些信號(hào)的密切配合，最后引起基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的變化。核因子(NF)-κB是參與炎癥及免疫反應(yīng)的一種中心轉(zhuǎn)錄因子，它可被包括：腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細(xì)胞介素(IL)-1β等多細(xì)胞因子激活，進(jìn)而快速誘導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)內(nèi)多基因的表達(dá)，包括炎性酶、細(xì)胞因子及基質(zhì)金屬蛋白酶等〔7〕。同時(shí)在大鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型中研究表明，軟骨細(xì)胞中NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活〔8〕。本研究旨在探討NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在蜂毒肽影響大鼠骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的具體作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠60只，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。隨機(jī)分為三組，每組20只，20只大鼠不做任何處理，作為對(duì)照組。其余大鼠切斷膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶以建立關(guān)節(jié)炎模型，其中20只大鼠關(guān)節(jié)腔不注射任何藥物為慢性骨關(guān)節(jié)炎組，余20只術(shù)后5 w后關(guān)節(jié)腔內(nèi)開(kāi)始注射3%蜂毒肽0.15 mg/kg為慢性骨關(guān)節(jié)炎+蜂毒肽組，每周重復(fù)注射1次，3組均于術(shù)后11 w處死。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 蜂毒肽、IL-1β(南京肽業(yè)生物科技有限公司)，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒，超敏電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液；TRIZOL；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)Taq酶Mix，PCR Marker；一氧化氮合酶多克隆抗體；β-actin多克隆抗體；鏈霉素和素-生物素復(fù)合物(SABC)試劑；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒等；I-κB、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、NF-κB引物及多克隆抗體。

1.3 軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng) 無(wú)菌條件下取5～7日齡SD大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)面軟骨。切下的組織立即置于含雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗，并剪成約1 mm3后胰酶消化30 min后，濾網(wǎng)過(guò)濾收集細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min去上清，20%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基37℃、飽和濕度、CO2濃度5%培養(yǎng)。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡分析 原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，Western印跡分別檢測(cè)不同劑量下蜂毒肽影響IL-1誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的激活情況；1:(空白對(duì)照組)不加任何處理因素; 2:10 ng/L IL-1β;3:10 ng/L IL-1β+100 μg/ml蜂毒肽;4:10 ng/L IL-1β+200 μg/ml蜂毒肽;5:10 ng/L IL-1β+300 μg/ml蜂毒肽。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)24 h進(jìn)行檢測(cè)，以加入IL-1β后檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)30、60、120 min三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)NF-κB的核轉(zhuǎn)位及I-κB的降解。一抗(NF-κB濃度1∶500，I-κB濃度1∶400，iNOS濃度1∶250)，二抗稀釋濃度1∶10 000，β-actin為內(nèi)參。

1.5 總RNA的提取和實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR) 細(xì)胞分組及處理方式同Western印跡法。提取總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min(95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s)×40循環(huán)，72℃末次延伸5 min。采用2-ΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GRAPH PAD6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t、χ2、F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離與鑒定 原代培養(yǎng)首次換液后，貼壁細(xì)胞多為單個(gè)長(zhǎng)梭形細(xì)胞，偶爾可見(jiàn)幾個(gè)細(xì)胞的克隆，細(xì)胞在傳代3次后，形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭形，融合時(shí)呈漩渦狀生長(zhǎng)。阿爾辛藍(lán)染色，細(xì)胞分泌的多聚糖染為藍(lán)色，見(jiàn)圖1。表明已成功建立大鼠膝關(guān)節(jié)來(lái)源的體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)體系。

圖1 成功分離并鑒定大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(×400)

2.2 Western印跡法檢測(cè)不同劑量蜂毒肽影響IL-1誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的結(jié)果 隨著蜂毒肽濃度的逐漸增高，IL-1β誘導(dǎo)NF-κB及I-κB的表達(dá)條帶顏色逐漸遞減，同時(shí)隨時(shí)間的延長(zhǎng)，降低程度逐漸明顯(圖2)。以上結(jié)果提示：蜂毒肽通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活以起到對(duì)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。

1:空白對(duì)照組；2：10 ng/L IL-1β；3：10 ng/L IL-1β+100 μg/ml 蜂毒肽；4：10 ng/L IL-1β+200 μg/ml蜂毒肽；5：10 ng/L IL-1β+300 μg/ml蜂毒肽圖2 蜂毒肽通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活保護(hù)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞

2.3 細(xì)胞增殖CCK8實(shí)驗(yàn)法和實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)結(jié)果 細(xì)胞增殖CCK8實(shí)驗(yàn)顯示，與慢性骨關(guān)節(jié)炎組相比，慢性骨關(guān)節(jié)炎+蜂毒肽組膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖能力明顯增高(P<0.05),見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成骨關(guān)鍵分子〔成骨特異轉(zhuǎn)錄因子核心結(jié)合因子(Runx)2、堿性磷酸酶(ALP)、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Osterox)〕表達(dá)，相比于慢性骨關(guān)節(jié)炎組，慢性骨關(guān)節(jié)炎+蜂毒肽組早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因(Sox)9上調(diào)(2.4±0.7)倍，CCAAT增強(qiáng)結(jié)合蛋白(CEBP)2上調(diào)(1.5±0.4)倍，聚集蛋白聚糖(Aggrecan)上調(diào)(1.9±0.2)倍，均差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)表2。蜂毒肽可通過(guò)提高慢性骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增殖及軟骨特性維持，以起到對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。

表1 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組培養(yǎng)24、48、72 h軟骨細(xì)胞增殖率(n=20，%)

1)慢性骨關(guān)節(jié)炎+蜂毒肽組與慢性骨關(guān)節(jié)炎組比較；表2同

表2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄分子的表達(dá)

3 討 論

蜂毒肽也稱蜂毒溶血肽或蜂毒素。蜂毒肽具有良好的藥物活性，研究提示蜂毒肽有較好的溶血和抗菌作用。其次，還可通過(guò)選擇性抑制N-膽堿受體，以阻滯神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)〔9〕。炎癥反應(yīng)是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生與發(fā)展的基礎(chǔ)病理因素，其發(fā)生發(fā)展是多刺激因素共同作用的結(jié)果。而各因素均通過(guò)刺激關(guān)節(jié)內(nèi)細(xì)胞進(jìn)而引起相應(yīng)的病理效應(yīng)的。NF-κB作為免疫炎癥反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起極其重要的作用。因此，通過(guò)抑制NF-κB途徑以阻抗骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，是目前干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎的新方向〔10〕。NF-κB作為免疫炎癥反應(yīng)中的一重要轉(zhuǎn)錄因子，可多種基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子結(jié)合，從而促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB存在于所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。研究顯示，作為NF-κB一重要成員，在骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎(OA)和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)中，NF-κBp50和p65表達(dá)均增加〔11〕。并且RA比OA中NF-κB的激活更高。在脊柱關(guān)節(jié)病(SPA)及RA患者滑膜組織的研究中表明，NF-κB高表達(dá)于軟骨-血管翳交界處〔12〕。此外，正常大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)入IKKβ基因可引起關(guān)節(jié)炎，表現(xiàn)關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹，炎性病理變化及IKK的活性增加，NF-κB的DNA結(jié)合活性增強(qiáng)。提示NF-κB在慢性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中扮演了重要的角色。

NF-κB可影響軟骨細(xì)胞功能。在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β和TNF-α均可引起NF-κB的活化，而TNF-α和IL-1β聯(lián)合刺激關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞對(duì)NF-κB的活化起到協(xié)同作用〔13〕。用各種特定的抑制劑抑制NF-κB途徑，進(jìn)一步延緩及扼制炎癥反應(yīng)的發(fā)展，可能是一個(gè)潛在的治療策略。本文結(jié)果顯示蜂毒肽可通過(guò)提高慢性骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增殖及軟骨特性維持，以起到對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。蜂毒肽通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活以起到骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。

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〔2016-03-19修回〕

(編輯 苑云杰)

福建省自然科學(xué)基金計(jì)劃項(xiàng)目(No.2015J01429)

湯發(fā)強(qiáng)(1972-)，男，博士在讀，副主任醫(yī)師，主要從事關(guān)節(jié)疾病研究。

R365.2

A

1005-9202(2017)13-3132-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.005