亞低溫療法聯(lián)合依達(dá)拉奉對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

吳達(dá)榮 曾志芬 陶恩祥△

1)深圳市龍崗中心醫(yī)院，廣東 深圳 518116 2)中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東 廣州 510120

亞低溫療法聯(lián)合依達(dá)拉奉對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

吳達(dá)榮1)曾志芬2)陶恩祥2)△

1)深圳市龍崗中心醫(yī)院，廣東 深圳 518116 2)中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東 廣州 510120

目的 探討亞低溫療法聯(lián)合依達(dá)拉奉對大鼠腦缺血再灌注損傷后的保護(hù)作用。方法 采用線栓法建立局灶性腦缺血再灌注模型，缺血6 h后再灌注，并分為假手術(shù)組、模型組、依達(dá)拉奉組、亞低溫聯(lián)合依達(dá)拉奉組，再灌注24 h后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，采用TTC染色測定腦梗死體積和用免疫組化的方法檢測Bax和Bcl-2的陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 與模型組比較，依達(dá)拉奉未能減少腦梗死體積，但能通過下調(diào)Bax及上調(diào)Bcl-2減少細(xì)胞的凋亡，對腦細(xì)胞有保護(hù)作用；與模型組、依達(dá)拉奉組比較，亞低溫聯(lián)合依達(dá)拉奉組能通過上調(diào)Bcl-2及下調(diào)Bax明顯降低大鼠神經(jīng)缺陷評分及減少腦梗死體積。 結(jié)論 亞低溫療法聯(lián)合依達(dá)拉奉對大鼠腦缺血再灌注損傷具有很好的保護(hù)作用。

亞低溫；腦缺血；依達(dá)拉奉；Bax；Bcl-2；大鼠

缺血性腦卒中發(fā)病率、致殘率和病死率均高，已成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。腦梗死溶栓后，可產(chǎn)生血流再灌注損傷，加重腦損傷，與自由基產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡有關(guān)。近年來研究表明，亞低溫對缺血性腦損傷具有保護(hù)作用，是一種療效肯定的治療措施。依達(dá)拉奉是一種新型自由基清除劑，具有抗細(xì)胞凋亡和神經(jīng)保護(hù)的作用。本研究旨在探討亞低溫療法聯(lián)合依達(dá)拉奉對大鼠腦缺血再灌注損傷后的保護(hù)作用，為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 動物分組 健康雄性SD大鼠80只(清潔級，中山大學(xué)實驗動物中心提供)，體質(zhì)量280～330 g 。依達(dá)拉奉注射液(必存)，南京先聲東元制藥有限公司。TTC (2，3，5-氯化三苯基四氮唑)，威佳生物技術(shù)公司。兔抗鼠Bax、Bcl-2多克隆抗體，美國Santa Cruz公司。將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、依達(dá)拉奉組、亞低溫聯(lián)合依達(dá)拉奉組各20只。

1．2 方法 假手術(shù)組僅進(jìn)行手術(shù)，不造成缺血狀態(tài)，其余3組均采用線栓法建立大鼠大腦中動脈的局灶性腦缺血模型，于缺血6 h后實施再灌注。依達(dá)拉奉給藥組于缺血時及再灌注后立即予依達(dá)拉奉3 mg·kg-1腹腔內(nèi)注射。模型組給予等劑量生理鹽水腹腔內(nèi)注射。亞低溫聯(lián)合依達(dá)拉奉組在缺血后立即采用噴灑酒精和電扇降溫的方法在10 min內(nèi)使肛溫降至30 ℃，相應(yīng)的腦溫為33 ℃[1-2]。33 ℃為最適腦溫，恢復(fù)快，并發(fā)癥少[3]。維持亞低溫6 h后，實施再灌注，然后把大鼠轉(zhuǎn)移到溫度為5 ℃的房間內(nèi)，調(diào)節(jié)肛溫30 ℃，維持24 h[4]。

1．3 動物模型的制作 線栓法建立大鼠大腦中動脈(middle cerebral artery occlusion，MCAO)的局灶性腦缺血模型[5]。大鼠腹腔注射10 %水合氯醛(0.3 mL/100 g) 麻醉后，仰臥固定在手術(shù)臺上，75 %乙醇消毒頸部皮膚，正中頸部切口，分離并暴露右側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)，游離ECA主干及分支，距離分叉部約4mm處結(jié)扎ECA，電凝ECA 的分支，分離ICA主干至翼腭動脈(pterygopalatine artery，PPA)并將其從根部結(jié)扎。在術(shù)野中CCA近心端、ICA遠(yuǎn)心端分置動脈夾夾閉，于ECA主干置一不扎緊的縫線，殘端用眼科手術(shù)剪剪一0.3 mm的切口，將預(yù)先制備好的頭端成球狀、直徑為0.26處mm的栓線插入，扎緊ECA主干上的縫線，松開ICA遠(yuǎn)心端的動脈夾，輕推魚絲線沿ICA入顱，魚絲線插入深度(18.5±0.5)mm，扎緊ECA上絲線，松開CCA上的動脈夾，縫合皮膚切口。待達(dá)到缺血時間后，把線頭往外輕拉，感到阻力時，表明魚絲線的頭端已經(jīng)回到ECA的主干中，貼近皮膚剪去魚絲線，實現(xiàn)再灌注，術(shù)后常規(guī)青霉素肌注預(yù)防感染，麻醉清醒后大鼠出現(xiàn)以左前肢為主的偏癱作為模型成功的標(biāo)志。假手術(shù)組魚絲線插入深度為13 mm，其余步驟同實驗組。

1．4 觀察指標(biāo)

1．4．1 神經(jīng)功能缺損評分：再灌注后30 h行神經(jīng)功能評分，采用Longa評分分級標(biāo)準(zhǔn)，即0分：無神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損癥狀，活動正常；1分：對側(cè)前肢不能完全伸展；2分：爬行時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時身體向偏癱側(cè)傾倒；4分：不能自主行走，意識喪失；5分：死亡。1～4分為造模成功。

1．4．2 腦梗死體積百分比測定：用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速剪開胸腔暴露心臟，經(jīng)左心室先用100 mL肝素化生理鹽水快速灌注，隨后立即斷頭取腦，置于-20 ℃冰箱中冷凍20 min，從腦額極開始，每間隔2 mm作一冠狀切片，層厚2 mm。置于2%TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)溶液中，嚴(yán)格避光，37 ℃水浴中孵育30 min，梗死區(qū)不著色，正常腦組織著紅色。隨即用4%多聚甲醛液固定，根據(jù)蒼白區(qū)觀察梗死灶范圍。采用全自動圖像分析系統(tǒng)計算每張切片的梗死灶面積及總面積，根據(jù)公式V = 2 (A 1 + A 2 + A n)計算梗死體積及總體積，其中2 為切片厚度，A 為面積[6]。腦梗死體積百分比=梗死體積/全腦體積。

1．4．3 組織學(xué)觀察：斷頭取腦，取大腦視交叉前緣始向前的2 mm厚冠狀切片，置于含4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、連續(xù)冠狀切片，切片厚度5 μm，切片貼附于預(yù)處理的載玻片上。相鄰切片分別作Bax 、Bcl-2免疫組化染色。胞漿著色呈棕黃色為陽性細(xì)胞。每張切片于高倍鏡(×400)下將缺血灶周邊區(qū)皮質(zhì)和紋狀體的5個視野計數(shù)[7]。

2 結(jié)果

2．1 各組神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積百分比比較 除假手術(shù)組外，其余各組均出現(xiàn)大鼠神經(jīng)功能缺損。模型組與依達(dá)拉奉組比較無顯著性差異(P>0.05)。亞低溫聯(lián)合依達(dá)拉奉可降低大鼠神經(jīng)功能缺陷評分，與模型組比較有顯著性差異(P<0.01)，與依達(dá)拉奉組比較亦有顯著性差異(P<0.05)。假手術(shù)組未出現(xiàn)腦梗死灶。模型組與依達(dá)拉奉組比較無顯著性差異。亞低溫聯(lián)合依達(dá)拉奉組能減小腦梗死體積，與模型組、依達(dá)拉奉組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能評分、腦梗死體積百分比比較±s)

注：與模型組比較，#P<0.01；與依達(dá)拉奉組比較，▲P<0.05；與模型組、依達(dá)拉奉組比較，△P<0.05

2．2 免疫組織化學(xué)

2．2．1 各組Bax陽性細(xì)胞數(shù)比較：胞漿著色為棕黃色為Bax陽性細(xì)胞。假手術(shù)組Bax陽性細(xì)胞數(shù)為1.64±1.15，模型組為63.80±6.15，依達(dá)拉奉組為50.00±7.38，亞低溫聯(lián)合依達(dá)拉奉組為35.40±4.20，各組與假手術(shù)組比較均有明顯差異(P<0.01)。亞低溫聯(lián)合依達(dá)拉奉組Bax表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)與模型組、依達(dá)拉奉組比較均有所減少。依達(dá)拉奉組Bax陽性細(xì)胞數(shù)小于模型組。見圖1。

圖1 不同組Bax陽性細(xì)胞數(shù) 胞漿染成棕黃色為陽性 Bar is 100 μm.(DAB 染色，×400) A：假手術(shù)組 B：模型組 C：依達(dá)拉奉組 D：亞低溫聯(lián)合依達(dá)拉奉組

2．2．2 Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)比較：Bcl-2陽性細(xì)胞為胞漿著色為棕黃色。假手術(shù)組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)為1.58±0.84，模型組為30.00±2.10，依達(dá)拉奉組為40.62±2.09，亞低溫聯(lián)合依達(dá)拉奉組為50.84±3.18，各組與假手術(shù)組比較均有明顯差異(P<0.01)。亞低溫聯(lián)合依達(dá)拉奉組Bcl-2表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于模型組、依達(dá)拉奉組(P<0.01)。依達(dá)拉奉組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

圖2 不同亞組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù) 胞漿染成棕黃色為陽性。 Bar is 100 μm.(DAB 染色，×400) A：假手術(shù)組 B：模型組 C：依達(dá)拉奉組 D：亞低溫聯(lián)合依達(dá)拉奉組

3 討論

以往研究表明，腦梗死后血流下降最嚴(yán)重的是梗死中心區(qū)域，細(xì)胞發(fā)生壞死，周圍缺血半暗帶區(qū)的血流出現(xiàn)不同程度下降，與凋亡密切相關(guān)[8]。腦缺血缺氧后有多種蛋白被誘導(dǎo)表達(dá)，其中Bax 和Bcl-2是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控蛋白，Bax表達(dá)增加促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2是抗凋亡蛋白。Bax 和Bcl-2形成了細(xì)胞凋亡的正負(fù)調(diào)控，兩者比例決定了細(xì)胞是否趨向凋亡。本研究免疫組化結(jié)果顯示，Bax、Bcl-2陽性細(xì)胞更多的出現(xiàn)于缺血半暗帶區(qū)，Bax、Bcl-2陽性細(xì)胞胞漿染色，胞核尚未著色。結(jié)果顯示，腦梗死發(fā)生后，Bax及Bcl-2陽性細(xì)胞明顯增多，提示參與了細(xì)胞的凋亡，與以往研究結(jié)果相一致。依達(dá)拉奉是一種自由基清除劑，可清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，從而抑制腦細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷[9]。本實驗表明，與模型組相比較，依達(dá)拉奉未能降低神經(jīng)功能缺陷評分及未能減少腦梗死體積，但能通過下調(diào)Bax及上調(diào)Bcl-2減少細(xì)胞的凋亡，對腦細(xì)胞有保護(hù)作用。亞低溫對缺血區(qū)域的神經(jīng)元具有保護(hù)作用，其機制可能與降低腦氧代謝率、改善細(xì)胞能量代謝、減少興奮性氨基酸的釋放、減少氧自由基的生成、減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載、減輕腦水腫等有關(guān)。文獻(xiàn)[10]報道，亞低溫能通過下調(diào)Bax及上調(diào)Bcl-2對腦梗死缺血區(qū)域的腦細(xì)胞發(fā)揮腦保護(hù)作用。因此理論上，亞低溫聯(lián)合依達(dá)拉奉對缺血腦組織將有更大的保護(hù)作用。而本實驗的研究結(jié)果也證明了該設(shè)想，亞低溫聯(lián)合依達(dá)拉奉較單用依達(dá)拉奉有更好的腦保護(hù)作用，體現(xiàn)在能明顯降低大鼠功能神經(jīng)缺陷評分及減小腦梗死體積方面，其機制可能是更大程度的上調(diào)了Bcl-2及下調(diào)了Bax。

本實驗表明，亞低溫聯(lián)合依達(dá)拉奉比單用依達(dá)拉奉能更大程度的上調(diào)Bcl-2及下調(diào)Bax，從而降低大鼠神經(jīng)功能缺陷評分，抑制神經(jīng)元的凋亡，減小腦梗死體積，阻止腦梗死的進(jìn)展。

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(收稿2017-04-02)

Protective effects of mild hypothermia combined with edaravone on rats with cerebral ischemic reperfusion injury

WuDarong*，ZengZhifen，TaoEnxiang

*LonggangCentralHospitalofShenzhen，Shenzhen518116，China

Objective To observe protective effects of mild hypothermia combined with edaravone on rats with cerebral ischemic reperfusion injury．Methods Six hours after the establishment of focal cerebral ischemia by suture method，we performed reperfusion．And 24 hours after successful reperfusion injury，neurological functional deficits in sham-operation group，model group，edaravone group and mild hypothermia combined with edaravone group (combined group) were evaluated．Cerebral ischemic volume was measured by TCC staining and the number of positive Bax and Bcl-2 cells was tested by immunohistochemistry method．Results Compared with model group，edaravone group failed to reduce the infarct volume，but managed to decrease cell apoptosis via down-regulating Bax and up-regulating Bcl-2 for the purpose of protective effect．In addition，compared with model group and edaravone group，the combined group significantly lowered the degree of ischemic reperfusion injury and reduced infarct volume through the up-regulation of Bcl-2 and down-regulation of Bax．Conclusion Mild hypothermia combined with edaravone has good effects on rats with cerebral ischemic reperfusion injury．

Mild hypothermia；Cerebral ischemia；Edaravone；Bax；Bcl-2；Rats

深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研項目(項目編號：201402121)；深圳市龍崗區(qū)科技計劃醫(yī)療衛(wèi)生項目(項目編號：YLWS20140605174929210)

R-332

A

1673-5110(2017)12-0005-03

△通訊作者：陶恩祥，E-mail：taoenxiang@yahoo.com.cn