巰基化γ-聚谷氨酸微納米纖維及其抗氧化性能

徐婷婷，王 瑞，李 莎，遲 波，徐 虹

(南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京211800)

隨著醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)體內(nèi)自由基的不平衡與某些慢性疾病有關(guān)[1]。在人體正常代謝范圍內(nèi)，自由基能夠起到抗菌、消炎、抗老化、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及抗癌等作用。但是，超過人體代謝水平的自由基，會破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、脂肪組織、細(xì)胞膜及DNA結(jié)構(gòu)等，進(jìn)而引起慢性疾病[2]。

抗氧化劑是指能夠有效抑制自由基發(fā)生氧化反應(yīng)的一類物質(zhì)。目前，抗氧化劑主要有植物源、動物源及微生物源等抗氧化劑[3-4]，比如：茶多酚、阿魏酸、枸杞多糖、肌肽、谷胱甘肽、殼聚糖、蠶絲蛋白和聚氨基酸等?？寡趸锔叻肿釉谧o(hù)膚品和醫(yī)用材料方面有著良好的應(yīng)用前景。研究者發(fā)現(xiàn)蠶絲蛋白抗氧化水凝膠支架材料可有效保護(hù)皮膚成纖維細(xì)胞，免受自由基的傷害[5]；殼聚糖基水凝膠材料可有效對氧自由基清除，在髓核再生和護(hù)膚品研發(fā)方面具有很好的前景[6-8]。

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是通過生物發(fā)酵法制備的以酰胺鍵聚合的陰離子型多肽聚合物，分子量從幾千到兩百萬不等[9]。γ-PGA的主鏈上的有大量羧基，可進(jìn)行功能化修飾形成衍生化γ-PGA，廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、化妝品和醫(yī)用材料領(lǐng)域[10-12]。在組織工程應(yīng)用方面，γ-PGA可被制備成水凝膠、納米纖維等支架材料，仿生細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞提供三維空間支架，供細(xì)胞黏附、增殖和分化[13-15]。Yang等[16]將聚乙烯醇(PVA)與聚谷氨酸(PGA)混合后進(jìn)行靜電紡絲，在接種后細(xì)胞增殖數(shù)量最多，表明該材料在組織工程應(yīng)用中具有較好的潛質(zhì)。Koeda等[17]利用靜電紡絲聚谷氨酸納米纖維中封裝活性蛋白質(zhì)，通過蛋白活性的測試，證明其具有良好的裝載生物活性物質(zhì)的能力。張?zhí)鞁傻萚18]研究得出γ-聚谷氨酸在體外有中等程度的抗氧化活性及良好的透明質(zhì)酸酶抑制活性，在功能性化妝品中具有廣闊的應(yīng)用前景。但是具有高抗氧化性能的γ-PGA支架材料研究甚少。

本研究中，筆者采用L-半胱氨酸(L-Cys)修飾γ-PGA，利用靜電紡絲法制備可交聯(lián)γ-PGA(γ-PGA-SH)微納米纖維，并研究交聯(lián)后的γ-PGA-SH纖維(γ-PGA-SS)抗氧化性能，開發(fā)其在醫(yī)用材料和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

γ-PGA(重均分子量7.0×105，南京軒凱生物科技有限公司)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)、碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、2-羥基-4’-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2959)、甲醇、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽、水楊酸鈉、鄰苯三酚三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，上海阿拉丁試劑有限公司；鐵氰化鉀、磷酸鈉、三氟乙酸、FeCl3、FeSO4、H2O2、無水乙醇，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

核磁共振氫譜儀(1H NMR)(Avance 400 MHz)，德國Brucker公司；Nicolet 8700型紅外光譜儀，美國Thermo公司；TL-01型靜電紡絲機(jī)，通力微納科技有限公司；S-4800型掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司；TGA4000型熱重分析儀，北京恒久科學(xué)儀器有限公司；1510型酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；DZF-6050型真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ALPHA 1-2 LD plus型冷凍干燥機(jī)，德國Martin Christ公司。

1.2 γ-PGA-SH原料的合成及表征

稱取1 g的γ-PGA溶于80 mL去離子水中，放置于100 mL燒杯中充分溶解后，加入0.093 mol/L的EDC/NHS縮合劑進(jìn)行活化，活化時間為30 min。將L-半胱氨酸鹽酸鹽溶于20 mL去離子水中，然后緩慢滴加到反應(yīng)體系中，控制反應(yīng)pH(pH=4.8)，N2保護(hù)并避光反應(yīng)24 h。使用12 000重均分子量的透析袋透析72 h，注意保持透析液pH=5。

將上述合成的γ-PGA-SH溶解于氘代水中，采用核磁共振氫譜儀(1H NMR)和紅外光譜儀進(jìn)行表征。

1.3 靜電紡絲法制備γ-PGA-SH微納米纖維

室溫下，將γ-PGA-SH溶于5%(體積分?jǐn)?shù))的三氟乙酸水溶液中，磁力攪拌24 h，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的均勻溶液。在γ-PGA-SH紡絲溶液的噴絲頭到接收裝置之間的距離25 cm、直流電壓25 kV、接收距離25 cm、溫度為室溫以及紡絲溶液的推進(jìn)速率為0.1 mL/h的條件下進(jìn)行靜電紡絲，制備成未交聯(lián)γ-PGA-SH微納米纖維。

1.4 γ-PGA-SS微納米纖維的制備

在制得的γ-PGA-SH微納米纖維膜上滴加0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的I2959甲醇溶液，在365 nm的紫外燈下光照10 min，使得纖維中的巰基形成二硫鍵(S—S)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，從而得到在水中具有良好穩(wěn)定性的γ-PGA-SS微納米纖維。

1.5 γ-PGA-SH和γ-PGA-SS微納米纖維的性能測試

1.5.1 掃描電子顯微鏡(SEM)

使用Hitachi S-4800型場發(fā)掃描電鏡觀察纖維表面形貌。并使用Image-ProPlus 6.0(IPP6.0)軟件對纖維直徑分布統(tǒng)計(jì)和利用Origin高斯(Gaussa)擬合分析。

1.5.2 熱重分析(TGA)

將烘干的纖維樣品剪碎，稱取5 mg，放入坩堝內(nèi)，在熱重分析儀中設(shè)定溫度范圍為40～600 ℃，升溫速率10 ℃/min，得到溫度與質(zhì)量損失的曲線。

1.6 γ-PGA-SS微納米纖維抗自由基測試

1.6.1 還原能力測定

先將2 mg交聯(lián)后的γ-PGA-SS微納米纖維浸入2 mL蒸餾水中充分溶脹，再加入2 mL磷酸緩沖液(pH=6.0，0.2 mol/L)、2 mL的1%鐵氰化鉀，混勻放入50 ℃的恒溫水浴20 min。冷卻至室溫后，加入2 mL 10%的三氟乙酸、0.5 mL 0.1%的FeCl3和2 mL去離子水，反應(yīng)10 min。以去離子水為空白對照，常溫下在700 nm處測定吸光值(A)。

還原能力的計(jì)算見式(1)。

還原力吸光度值=A1-A0

(1)

式中：A0為空白樣品；A1為樣品。

1.6.2 ·OH清除能力測定

將2 mg的交聯(lián)后的γ-PGA-SS微納米纖維浸入1 mL蒸餾水中充分溶脹，加入2 mL FeSO4、2 mL H2O2(0.01%)，混合均勻，然后加入2 mL水楊酸-乙醇溶液。將各試管放入37 ℃恒溫水浴中，反應(yīng)1 h。冷卻到室溫，充分搖勻，取上清液，在510 nm波長處測量吸光值(A′)。

清除率的計(jì)算見式(2)。

清除百分率=((A0′-A1′)/A0′)×100%

(2)

1.6.3 DPPH·清除能力

根據(jù)Yang等[19]實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行改性。配制50 mg/ml的DPPH無水乙醇溶液。將2 mg改性的γ-PGA-SH原料和交聯(lián)后γ-PGA-SS纖維分別浸泡在2.5 mL的去離子水中，加入0.5 mL的DPPH乙醇溶液，混合后，室溫下避光反應(yīng)30 min。結(jié)束后，取1 mL的反應(yīng)液在519 nm下測其吸光值(A″)，無水乙醇為空白對照組。通過式(3)計(jì)算DPPH·清除率。

清除率=((A0″-A1″) /A0″)×100%

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 γ-PGA-SH的合成與表征結(jié)果

通過EDC/NHS的縮合，在γ-PGA的羧基與L-Cys的氨基之間形成酰胺化反應(yīng)，從而制備γ-PGA-SH。合成路線如圖1所示。

圖1 γ-PGA-SH合成路線Fig.1 γ-PGA-SH synthetic route

經(jīng)核磁共振氫譜儀(300 MHz，D2O)的表征，結(jié)果如圖2所示。從圖2可知：化學(xué)位移(δ)=4.08～4.28為γ-PGA的α碳原子(CH)的H原子吸收峰，δ=2.25～2.47和δ=1.85～2.22 分別為γ-PGA的β碳原子和γ-碳原子(CH2)的H原子吸收峰。 在γ-PGA-SH圖譜上，δ=3.35～3.58為L-Cys的α碳原子(CH)的H原子吸收峰，δ=2.78～3.08為L-Cys的β碳原子(CH2)的H原子吸收峰。根據(jù)γ-PGA以及γ-PGA-SH吸收峰的位置和峰型，判斷L-Cys成功接枝在γ-PGA主鏈上。并且根據(jù)L-Cys的α碳的H原子吸收峰面積與γ-PGA的α碳的H原子吸收峰面積之比，得出接枝率為55.6%。

圖2 γ-PGA-SH的1H NMR圖譜Fig.2 1H NMR spectrum of γ-PGA-SH

圖3 γ-PGA和γ-PGA-SH的FT-IR紅外光譜Fig.3 FT-IR spectra of γ-PGA and γ-PGA-SH

2.2 纖維形貌和直徑分布分析

通過SEM觀察未交聯(lián)γ-PGA-SH和交聯(lián)后

γ-PGA-SS微納米纖維的形貌，如圖4所示。由圖4可知：未交聯(lián)γ-PGA-SH微納米纖維分布均勻且連續(xù);而交聯(lián)后γ-PGA-SS微納米纖維經(jīng)處理后依然保持連續(xù)性且具有良好纖維形狀。通過圖4(c)和4(d)纖維直徑分布圖可得，未交聯(lián)的纖維直徑分布在幾十納米至1 μm，且平均直徑分布在800 nm左右；而交聯(lián)后的纖維直徑有所變大，主要分布在400 nm～1.0 μm，平均直徑分布在1 100 nm。交聯(lián)后直徑比交聯(lián)前有所提高，主要由于纖維之間的交聯(lián)反應(yīng)使得纖維之間接觸面增加，纖維形貌變得扁平。由此可知，交聯(lián)后的纖維仍有空隙和空間結(jié)構(gòu)。

2.3 熱重分析結(jié)果

圖5為微納米纖維熱重分析結(jié)果。由圖5可知：未交聯(lián)的γ-PGA-SH纖維和交聯(lián)后的γ-PGA-SS纖維熱分解主要分3個階段。第一階段在50～220 ℃，主要是由于纖維水分蒸發(fā)而造成的；第二階段在230～440 ℃，主要是纖維中γ-PGA-SH分子的熱分解；第三階段是450～600 ℃，這是γ-PGA-SH內(nèi)部分子作用力被破壞而熱分解。在230～310 ℃時，交聯(lián)后的γ-PGA-SS纖維的熱分解速度比未交聯(lián)的γ-PGA-SH纖維的熱分解速度慢，主要由于γ-PGA-SS纖維之間通過S—S形成一定交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，提高了纖維的熱學(xué)性能。說明交聯(lián)后的γ-PGA-SS纖維熱穩(wěn)定性有所提高。

圖4 SEM觀察的纖維形貌圖和纖維直徑分布Fig.4 Fibers morphology characterized by SEM and the diameter distribution

圖5 未交聯(lián)γ-PGA-SH纖維和交聯(lián)后 γ-PGA-SS纖維的熱重分析Fig.5 Thermogravimetric analysis of uncrosslinking and ncrosslinking γ-PGA-SH fiber

2.4 抗氧化性能

通過多種指標(biāo)來評價(jià)γ-PGA-SH原料和交聯(lián)后γ-PGA-SS纖維抗氧化性能，結(jié)果如表1所示。由表1可知：相比γ-PGA-SH原料，交聯(lián)后γ-PGA-SS纖維的抗氧化性能發(fā)生了明顯下降。主要由于纖維在交聯(lián)時消耗部分巰基，這個現(xiàn)象與熱重分析的現(xiàn)象一致。但是其抗氧化水平作為纖維支架在生物醫(yī)用材料上仍然具有很大的優(yōu)勢。

表1 γ-PGA-SS纖維的抗氧化性能

注：通過SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析分析，同種性能不同樣品差異顯著(P<0.05；數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。

3 結(jié)論

靜電紡絲法制備γ-PGA-SS微納米纖維，不僅可以通過S—S交聯(lián)纖維，使得纖維形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)狀三維結(jié)構(gòu)，仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)，還具有良好的抗氧化性。在細(xì)胞生長時提供支撐，且能夠清除病損部位過量的自由基，加速傷口愈合和促進(jìn)皮膚修復(fù)。因此，γ-PGA-SS微納米纖維在醫(yī)用材料和美容護(hù)膚有著很好的應(yīng)用前景。