慶大霉素廢水對斑馬魚的急性毒性效應(yīng)

孟靜文 解衛(wèi)方 董雨欣 沈洪艷

摘要 [目的]探討慶大霉素廢水對斑馬魚的急性毒性效應(yīng)。[方法]采用靜水式直接接觸致毒法，研究慶大霉素廢水對斑馬魚的急性毒性效應(yīng)。根據(jù)斑馬魚在各時間段的死亡率求出半致死濃度（LC50），根據(jù)LC50判斷慶大霉素廢水的毒性等級。[結(jié)果]預(yù)試驗結(jié)果表明，斑馬魚暴露于慶大霉素體積百分比為30%的廢水中24 h 100 %死亡（24 h LC100）和體積百分比為10%的廢水96 h 零死亡（96 h LC0）。急性毒性試驗結(jié)果表明，在（22±1） ℃下，慶大霉素廢水4、8、12、24、48、72、96 h的LC50分別為23.975%、21.210%、19.050%、18.395%、16.779%、16.779%、16.779%。慶大霉素廢水不同時段的LC50為10%～50%，Tua值為2～10，毒性等級為中等毒性。[結(jié)論]研究結(jié)果可以為慶大霉素廢水對水生生物的亞急性毒性研究提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞 環(huán)境毒理學(xué)；慶大霉素廢水；斑馬魚；急性毒性；半致死濃度

Acute Toxic Effects of Gentamicin Wastewater on Zebrafish

MENG Jing-wen1，2，XIE Wei-fang1，2，DONG Yu-xin1，2，SHEN Hong-yan1，2* （1.School of Environmental Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang，Hebei 050018；2.Medical Molecular Chemistry Laboratory of Hebei Province，Shijiazhuang，Hebei 050018）

Abstract [Objective]To discuss the acute toxic effects of gentamicin wastewater on zebrafish.[Method]The acute toxicity effects of gentamicin wastewater to zebrafish were determined by using hydrostatic contact test methods.The median lethal concentration （LC50） was caculated according to the mortality of zebrafish in each period，and gentamicin wastewater′s toxicity grade was judged according to LC50.[Result] The pre-test showed that 24 h LC100 and 96 h LC0 for zebrafish exposing to gentamicin wastewater were 30% and 10% respectively.The acute toxicity test indicated that 4，8，12，24，48，72，96 h LC50 for zebrafish at （22±1）℃ were 23.975%，21.210%，19.050%，18.395%，16.779%，16.779%，16.779% respectively.The research showed that LC50 values were 10%-50%， Tua values were between 2 and 10， the toxicity grade was moderate toxicity.[Conclusion]The research results can provide some data for studying the subacute toxicity of gentamicin wastewater to aquatic organisms.

Key words Environmental toxicology；Gentamicin wastewater；Zebrafish；Acute toxicity；LC50

抗生素廢水不僅是pH變化趨勢大、色度很高、氣味比較刺鼻，而且是含有殘留抗生素等難降解有機物以及高濃度生物毒性物質(zhì)的一種有機廢水。近年來，國內(nèi)外報道了很多抗生素對藻類、蚤類、發(fā)光菌、魚類的急性毒性試驗[1-5]。孟文娜等[6]研究了土霉素對日本錦鯽肝臟抗氧化防御系統(tǒng)的影響，但關(guān)于抗生素廢水對斑馬魚的致毒效應(yīng)研究較少，尤其是慶大霉素廢水。魚類對于水環(huán)境的變化反應(yīng)是尤為靈敏的，當(dāng)水體污染達到一定濃度時，魚類就會產(chǎn)生一系列中毒反應(yīng)，如出現(xiàn)行為異常、生理功能紊亂，直至死亡[7]。魚類急性毒性試驗不僅用于測定化學(xué)物質(zhì)毒性強度和水體污染程度，檢測廢水處理效果，而且也為制定水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、評價環(huán)境質(zhì)量和管理廢水排放提供了重要技術(shù)支撐。斑馬魚（Zebrafish）在常規(guī)毒性試驗、分子及細(xì)胞生態(tài)毒理、生物致突變效應(yīng)檢測和環(huán)境激素測試等生態(tài)毒理領(lǐng)域中已被廣泛應(yīng)用[8]。在急性毒性試驗中，通常采用半致死濃度（LC50）來表示受試物的急性毒性大小。筆者以斑馬魚為受試生物，以慶大霉素廢水為受試毒物，將斑馬魚暴露于慶大霉素廢水中，測定其在恒定狀態(tài)下4、8、12、24、48、72、96 h的LC50值，觀察慶大霉素廢水對水生生物的急性毒性效應(yīng)，旨在為其后續(xù)的亞急性毒性研究提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗生物。

受試生物斑馬魚（Zebrafish）購于石家莊市某花鳥魚蟲市場，體長為（25±3） mm，體質(zhì)量（0.20±0.05） g，試驗前在實驗室環(huán)境下馴養(yǎng)7 d，自然死亡率不得超過5%，試驗前48 h以及在整個急性毒性試驗期間（96 h），不對斑馬魚進行喂食。

1.1.2 儀器與耗材。曝氣泵；溫度計；量筒；酸度計（FE20）；溶解氧測定儀（JPBJ-608）；水質(zhì)硬度計（YD300）；5 L玻璃魚缸等。

1.1.3 試驗水樣。

慶大霉素廢水來自某制藥企業(yè)污水處理廠進水（生產(chǎn)過程中的排放水）。水樣保存在0～4 ℃的冰柜中備用，4 h與96 h水質(zhì)發(fā)生了物理變化。前者水樣呈深灰色，刺激性氣味，有大量的深灰色絮狀物；后者水樣呈淺灰色，氣味仍然刺鼻，絮狀物明顯減少（圖1）。試驗前對水樣的COD、TOC、TN、pH等常規(guī)性指標(biāo)進行了測定，結(jié)果見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計。

（1）預(yù)試驗。在5 L玻璃水族缸中盛放4 L 試液，設(shè)置5個試驗暴露組，體積分?jǐn)?shù)分別為10.00%、30.00%、50.00%、70.00%和90.00%，不設(shè)平行，每24 h 更換試液1次，每個暴露組放入5 尾斑馬魚，試驗連續(xù)進行96 h，篩選出24 h 100%死亡濃度（24 h LC100）和96 h零死亡濃度（96 h LC0） 。

（2）急性毒性試驗。根據(jù)預(yù)試驗得出的結(jié)果，按等對數(shù)間距設(shè)置5個試驗暴露組。試驗設(shè)置2個平行組，同時設(shè)置1個空白試驗組，試驗最后得出魚類96 h半致死濃度（96 h LC50）。每個暴露組隨機放入12尾斑馬魚，試驗周期為96 h。

每天檢測試驗溶液的pH、溶解氧（DO）和溫度，pH維持在7.4～7.6，DO值為5 mg/L，溫度控制在（22±1） ℃，試驗期間需連續(xù)曝氣，試驗方式為靜水式（每24 h更換試液1次[9]）。試驗時間為96 h，分別在4、8、12、24、48、72、96 h觀察斑馬魚的死亡數(shù)，確定半致死濃度。

急性毒性試驗中的斑馬魚質(zhì)量控制符合《水和廢水監(jiān)測分析方法》中魚類毒性試驗方法的要求，即對照組死亡率不得高于10%，試驗用魚在與試驗相同的環(huán)境條件下提前馴養(yǎng)14 d[10]。試驗期間，空白對照組試驗斑馬魚均表現(xiàn)正常，并未出現(xiàn)死亡或中毒反應(yīng)，水質(zhì)監(jiān)測結(jié)果表明試驗溶液的溶解氧含量均在5 mg/L 以上。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

半致死濃度（LC50）：根據(jù)概率單位加權(quán)回歸（Bliss） 法，又稱圖解法，包括求劑量反應(yīng)曲線方程和半致死濃度的95%置信區(qū)間[11]。

（1）求劑量反應(yīng)直線方程。以試驗濃度對數(shù)值x為橫軸，以死亡概率單位y 為縱軸，繪制散點圖，得到回歸曲線。從回歸曲線上死亡概率單位為5的點作垂線與橫軸相交，讀數(shù)即為lgLC50，取lgLC50的反對數(shù)即可得到LC50值。

（2）半致死濃度的95%置信區(qū)間。通常以總體LC50的 95%置信區(qū)間，為可接受的LC50范圍。

①標(biāo)準(zhǔn)誤差的計算：SlgLC50 =S（N/2） 。式中，回歸曲線的斜率倒數(shù)用S表示；死亡概率單位4～6范圍內(nèi)各組試驗動物數(shù)之和用N表示。②總體LC50的 95%置信區(qū)間的對數(shù)值（lgLC50-1.96SlgLC50，lgLC50+1.96SlgLC50）對上述結(jié)果取反對數(shù)，即得到總體 LC50的95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)試驗結(jié)果

慶大霉素廢水對斑馬魚的預(yù)試驗持續(xù)96 h，得出24 h 100%死亡濃度 （24 h LC100） 為30%，96 h無死亡濃度（96 h LC0）為10%。

2.2 急性毒性試驗結(jié)果

當(dāng)斑馬魚處于慶大霉素廢水中時，10%、13%濃度組的斑馬魚在染毒后有輕微的中毒癥狀：浮于水面游動緩慢、倒游、豎立于水中[12]，約10 h后行動恢復(fù)正常，但24 h 后出現(xiàn)死亡；16.90%、21.90%、28.56%濃度組的斑馬魚在染毒1 h后中毒癥狀明顯，呼吸加劇、失衡、活力減弱，魚體側(cè)臥，輕觸魚背，抽搐、向上跳躍最后出現(xiàn)麻痹甚至死亡狀態(tài)[13]?？瞻讓φ战M中斑馬魚均表現(xiàn)正常，出現(xiàn)零中毒和零死亡現(xiàn)象。

2.3 不同體積分?jǐn)?shù)的慶大霉素廢水對斑馬魚的急性毒性效應(yīng)

隨著慶大霉素廢水體積分?jǐn)?shù)的增加，對斑馬魚呈現(xiàn)的急性毒性效應(yīng)也逐漸增強（表2），表現(xiàn)為斑馬魚死亡率明顯升高，當(dāng)慶大霉數(shù)廢水體積分?jǐn)?shù)達28.56%時，24 h內(nèi)受試斑馬魚累積死亡率達100%。這與武晨虹[14]在研究青霉素廢水對斑馬魚的急性毒性效應(yīng)時也得出隨著青霉素廢水濃度的增加，斑馬魚的死亡數(shù)目增多，死亡率也隨之增大的結(jié)論相一致。從圖2可以看出，在不同體積分?jǐn)?shù)的慶大霉素廢水中斑馬魚死亡率與試驗濃度對數(shù)值存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系[15]，隨著暴露濃度的增加，斑馬魚的死亡率顯著上升。在整個試驗中，慶大霉素廢水對斑馬魚的暴露濃度對數(shù)值-死亡率曲線均呈不規(guī)則的 S 形[16]，即斑馬魚死亡率隨著暴露濃度的升高而升高，但最初急速升高，后來緩慢上升。

2.4 慶大霉素廢水對斑馬魚的急性毒性效應(yīng)參數(shù)分析

依據(jù)斑馬魚在4、8、12、24、48、72、96 h的死亡率，通過建立死亡概率單位（y）與試驗濃度對數(shù)值（x）的回歸方程，各時段均顯示出較強的正相關(guān)性（R2>0.810），計算出LC50、Tua值和95%置信區(qū)間。

由表3可知，隨著暴露時間的延長，LC50呈現(xiàn)下降趨勢，慶大霉素廢水的毒性逐漸增強。在整個試驗周期內(nèi)，試驗時間越長，LC50值越小，慶大霉素廢水的毒性越大，即廢水對斑馬魚的毒性大小受試驗時間的影響[17]。24 h后，隨試驗時間的延長，LC50值下降緩慢，表明隨著試驗時間的延長，廢水致毒能力緩慢增長。48～96 h內(nèi)LC50均為16.779%，表明在這個時段內(nèi)慶大霉素廢水對斑馬魚的毒性不再增強。胡青云等[18]在研究染發(fā)廢水對鯉魚的急性毒性試驗中發(fā)現(xiàn)，試驗魚致死時間主要集中在24 h內(nèi)，24～48 h內(nèi)死亡率緩慢增長，48～96 h死亡率不再變化。

2.5 慶大霉素廢水的毒性等級

根據(jù)工業(yè)廢水毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)[20-22]，慶大霉素廢水在96 h內(nèi)各觀察時間段的LC50均介于10%～50%，Tua值也均在2～10（表4），屬于中毒廢水。

3 結(jié)論

（1）預(yù)試驗結(jié)果表明，慶大霉素廢水在96 h周期試驗中，24 h LC100和 96 h LC0試液中廢水濃度分別為30%和10%；急性毒性試驗結(jié)果表明，96 h LC50為16.779%，慶大霉素廢水在96 h內(nèi)各觀察時間段的LC50均介于10%～50%，Tua值為2～10，屬于中毒性廢水。

（2）回歸曲線表明，斑馬魚死亡率與慶大霉素廢水濃度和暴露時間（試驗時間）成正比。慶大霉素廢水濃度越大、暴露時間越長，斑馬魚的死亡數(shù)量越多，死亡率也隨之增大，毒性越大。

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