忍冬內(nèi)生真菌的分離鑒定及其抑菌活性初探

趙瑞芳+張程成+王增輝

摘要：從忍冬（Lonicera japonica）植物中分離得到28株內(nèi)生真菌，以番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、蘋果腐爛及小麥赤霉病菌為指示菌，對其抑菌活性進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，忍冬含有豐富的具有抑菌活性的內(nèi)生真菌，其中有2株（T9、T25）具有廣譜的抗菌活性，具有進(jìn)一步研究的理論和應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：忍冬（Lonicera japonica）；內(nèi)生真菌；抑菌活性

中圖分類號：Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）11-2064-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.11.016

Abstract： 28 strains of endophytic fungi were isolated from Lonicera japonica and their antifungal activity were tested with Botrytis cinerea， Alternaria solani， Cytospora mandshurica， Fusarium graminearum as indicator strains. The results showed that the Lonicera japonica was rich in endophytic fungi with antifungal activity， in which， T9 and T25 exhibited broad spectrum antifungal activity， and would be of theoretical and practical value for the further research.

Key words： Lonicera japonica； endophytic fungi； antifungal activity

農(nóng)藥的大量施用對環(huán)境和人體健康產(chǎn)生了很多的負(fù)面影響，例如有害生物抗藥性的增強(qiáng)及生態(tài)平衡的破壞，因此生物農(nóng)藥越來越受到人們的親睞。生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥相比，主要有易降解、對非靶標(biāo)生物安全等特點，這與中國倡導(dǎo)的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略相一致，因此是新農(nóng)藥開發(fā)的重要方向之一。植物內(nèi)生真菌（Endophytic fungi）是指那些其生活史的特定階段或全部階段寄生在植物組織內(nèi)，而不對植物產(chǎn)生有害癥狀的真菌[1]。自Vogl[2]從黑麥草（Lolium tumelentum）的種子中分離出第一株內(nèi)生真菌以來，內(nèi)生真菌就受到了人們廣泛的研究興趣。一般來說，內(nèi)生真菌對宿主植物至少有三個有益的作用：一是促進(jìn)宿主植物的生長；二是增強(qiáng)植物的修復(fù)功能；三是增加宿主對環(huán)境脅迫的抗性。內(nèi)生真菌幾乎存在于所有已經(jīng)研究過的植物中，包括可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的，分布廣泛，種類也較多，這些內(nèi)生真菌在植物中起著重要的生態(tài)學(xué)作用，能夠產(chǎn)生豐富多樣的次級代謝產(chǎn)物，包括抗生素、植物激素及其他一些生物活性物質(zhì)，80%的植物內(nèi)生真菌在抗真菌、抗蟲、抗藻類或雜草方面具有活性[3]。因此，科學(xué)利用和研究植物內(nèi)生真菌具有重大的理論和實際意義，也為生物農(nóng)藥的開發(fā)提供了新思路，在農(nóng)用活性物質(zhì)的篩選上受到人們的廣泛關(guān)注。

忍冬（Lonicera japonica）別稱金銀花、老翁須，屬多年生半常綠纏繞或直立灌木，是一種歷史悠久的中藥，最早開始記載于《名醫(yī)別錄》。忍冬適應(yīng)性強(qiáng)，對氣候、土壤要求不嚴(yán)，具有耐寒、耐旱、耐鹽堿等特性，化學(xué)成分復(fù)雜，開發(fā)利用前景廣闊。近年來，許多國內(nèi)外研究人員對忍冬的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，表明忍冬屬植物化學(xué)成分主要包括酚酸類、苷類、黃酮類、揮發(fā)油類[4]及其他類成分，而對其內(nèi)生真菌的生物活性鮮有報道。本研究對忍冬內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離，并對其抗菌活性進(jìn)行了初步研究，以期篩選到具有抑菌活性的內(nèi)生真菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 忍冬材料采自天津西青區(qū)，選取健康無病生長旺盛的植株，主要采集根、莖、葉，洗干凈后，自然晾干，立刻進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。

組織煎汁培養(yǎng)基：取100 g忍冬新鮮根皮和100 g馬鈴薯小塊，加去離子水1 000 mL，煮沸25 min后，用紗布過濾。濾液中加入20 g瓊脂粉、20 g葡萄糖，加熱充分溶解后加去離子水補(bǔ)足至1 000 mL，分裝，滅菌。

1.1.3 主要儀器設(shè)備和試劑 超凈工作臺（HS-B00U）、立式壓力蒸汽滅菌器（LS-B50L）、水浴振蕩器（HZS-HA）、光照培養(yǎng)箱（LRH-250-G）、離心機(jī)（Anke GL-20G-II）

試劑：乙醇、升汞、鏈霉素。

1.1.4 供試病原菌 小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、蘋果腐爛病菌（Cytospora mandshurica）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）。以上病原菌由天津農(nóng)學(xué)院病理實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物材料的表面消毒 將采集的忍冬組織在流水下沖洗干凈，除去表面附著的泥沙，晾干，在75%酒精中浸泡3～5 min，用無菌水沖洗3～4次，再用0.1%的升汞漂洗10～30 s，最后以無菌水沖洗5次。

消毒檢驗—印痕處理：為了檢查表面消毒是否徹底，進(jìn)行對照試驗。將上述同樣條件下處理過的材料在PDA培養(yǎng)基上滾動，使其和培養(yǎng)基充分接觸，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，檢查皿內(nèi)是否有菌生長，以檢驗消毒是否徹底[5]。

1.2.2 內(nèi)生真菌的分離與純化 內(nèi)生真菌的分離采用組織塊法。即在無菌條件下，剝下消毒后的忍冬枝條和根的韌皮部，切成0.5 mm的小段定植于PDA培養(yǎng)基上，葉片消毒后直接剪成小塊，每皿4～6塊，在25 ℃恒溫倒置培養(yǎng)5～10 d。待植物組織邊緣有菌落長出時，采用尖端挑取法，挑取內(nèi)生真菌菌落的邊緣，接種到新的PDA培養(yǎng)基中。按照菌落的外部特征（包括菌落形狀、顏色、是否分泌色素、表面特征、質(zhì)地）和個體形態(tài)特點（包括菌絲、子實體和孢子形態(tài)）等條件進(jìn)行區(qū)分不同的菌株，同時編號，繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d。菌落長大后，在超凈工作臺下，接種到PDA斜面上，放入冰箱保存[6]。

1.2.3 內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將分離純化后的內(nèi)生真菌分別接種于察氏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基中，通過觀察菌落顏色、菌落特征等，并對孢子、菌絲進(jìn)行顯微觀察。參考《真菌鑒定手冊》[7]進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.2.4 內(nèi)生真菌的液體搖瓶發(fā)酵 在無菌條件下，用接種針挑取菌落接種于液體培養(yǎng)基中，封口，置于振蕩器內(nèi)，180 r/min、25 ℃培養(yǎng)7～10 d，發(fā)酵終止后用濾紙過濾發(fā)酵產(chǎn)物，收集發(fā)酵液，6 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，取上清液備用[8]。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性測定 抑制菌絲生長速率法：在無菌條件下，取內(nèi)生真菌發(fā)酵上清液8 mL于無菌小燒杯內(nèi)，與32 mL冷卻至50 ℃左右PDA培養(yǎng)基迅速混合均勻（為了防止細(xì)菌的干擾，可在培養(yǎng)基中加入少量鏈霉素）倒入4個無菌培養(yǎng)皿中，冷卻后，分別將0.5 cm病原菌菌餅接于培養(yǎng)皿中央，以培養(yǎng)液作為對照，倒置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3 d后，采用十字交叉法測量處理組與對照組的菌落直徑。

1.2.6 活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物毒力測定 對抑菌效果顯著的發(fā)酵液進(jìn)行毒力測定。在無菌條件下，將發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基分別以2∶8、1∶9、0.5∶9.5、0.25∶9.75的比例混合均勻倒入培養(yǎng)皿中，冷卻后，將供試菌接入凝固后的皿內(nèi)，以培養(yǎng)液作為對照，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3 d后檢查菌落直徑，并計算抑制率及EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌分離結(jié)果及培養(yǎng)特征

采用組織塊分離法，分別從忍冬莖和根的韌皮部分離獲得28株內(nèi)生真菌，其中從莖中分離獲得24株內(nèi)生真菌，從根中獲得4株，從葉片中未分離得到。而這些內(nèi)生真菌中，從休眠期分離得到9株，生長期分離得到19株。由此可見，內(nèi)生真菌的數(shù)量與忍冬的生長有關(guān)，新陳代謝越旺盛，內(nèi)生真菌種類可能也越多。

根據(jù)培養(yǎng)特征（表1、圖1）及顯微特征，對分離獲得的內(nèi)生真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)果表明，這28株內(nèi)生真菌均屬于半知菌亞門，其中有9株屬于無孢科的絲核菌屬和束絲菌屬，有15株屬于叢梗孢科，以鏈格孢屬為優(yōu)勢種群，為11株，其余的為青霉和木霉，另有4株屬于鐮孢菌屬。

2.2 抑菌活性測定結(jié)果

為了篩選出具有抑菌活性的內(nèi)生真菌，將分離獲得的28株內(nèi)生真菌進(jìn)行發(fā)酵，對其發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性測定，結(jié)果見表2。

由表2可見，忍冬體內(nèi)含有豐富的具有抑菌活性的內(nèi)生真菌，28株內(nèi)生真菌發(fā)酵液中，有15株對4種供試菌中至少一種的抑制率在50%以上，其中，T9和T25菌株表現(xiàn)出較為廣譜的抑菌活性，其發(fā)酵液對4種供試病原菌的抑制率都達(dá)到60%以上，表明這兩株內(nèi)生真菌具有較廣譜、強(qiáng)烈的抑菌活性。

2.3 T9、T25菌株的抑菌毒力測定結(jié)果

為了進(jìn)一步驗證T9、T25這兩株菌的抑菌活性，對這兩株菌株的發(fā)酵液進(jìn)行抑菌毒力測定，結(jié)果見表3。

由表3可見，這兩株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液對供試的3種病原菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性，而T9對3種病原菌的EC50均小于T25，表明T9菌株發(fā)酵液的抑菌活性高于T25菌株。

3 討論

自然界蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，從中尋找具有農(nóng)用活性的次生代謝產(chǎn)物是農(nóng)藥開發(fā)的一個重要途徑。目前已記載的真菌種類僅占地球上真菌總數(shù)的5%左右，未被發(fā)現(xiàn)的真菌將是開發(fā)新的具有農(nóng)用活性代謝產(chǎn)物的潛在資源。而植物種類繁多，內(nèi)生真菌豐富多樣，能夠產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，這些內(nèi)生真菌具有抗菌[9]、抗腫瘤[10]、抗蟲[11]等活性，因此從中發(fā)現(xiàn)高活性的先導(dǎo)化合物的可能性是極大的。本研究從忍冬植物中共分離獲得28株內(nèi)生真菌，表明忍冬體內(nèi)含有豐富的內(nèi)生真菌，而這些內(nèi)生真菌主要來自忍冬莖稈，根中較少，說明內(nèi)生真菌的分布具有組織特異性，這可能與內(nèi)生真菌的傳播和侵入有關(guān)，真菌通過雨水和空氣進(jìn)行傳播，從植物表皮的皮孔、氣孔進(jìn)入植物并定植在植物的莖部[12]。在忍冬不同生育期分離的內(nèi)生真菌數(shù)量也不同，在休眠期分離獲得9株內(nèi)生真菌，在生長期分離獲得19株，說明內(nèi)生真菌的數(shù)量可能也和植物的生長代謝快慢有關(guān)，在植物生育期內(nèi)，氣溫較高，植物代謝活躍，能夠為內(nèi)生真菌提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，因此內(nèi)生真菌數(shù)量也就多。抑菌活性結(jié)果表明有近一半的內(nèi)生真菌都具有一定的抑菌活性，表明忍冬植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生豐富的具有抑菌活性的次生代謝物質(zhì)，而T9、T25這兩株內(nèi)生真菌具有廣譜的抗菌活性，具有進(jìn)一步深入研究的價值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊潤亞，馮培勇，李 清.植物內(nèi)生真菌農(nóng)藥活性的研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥，2006，45（7）：440-444.

[2] VOGL A E. Mehl und die anderen mehlprodukte der cerealien und leguminosen[J]. Nahrungsmittle Unters Hyg Warenkunde， 1898，12：25-29.

[3] SCHULZ B，BOYLE C，DRAEGER S，et al. Endophytic fungi： A source of novel biologically active secondary metabolites[J].Mycol Res，2002，106（9）：996-1004.

[4] 邢俊波，李 萍.忍冬屬化學(xué)成分研究概況及展望[J].中藥材， 1999，22（7）：366-367.

[5] 鄒小明，肖春玲，陳丹萍，等.青霉屬銀杏內(nèi)生菌的篩選及鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（20）：5255-5264.

[6] 黃午陽.植物內(nèi)生真菌的抗菌活性研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2005，21（1）：24-26.

[7] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

[8] 嚴(yán)鑄云，龐 蕾，羅 靜，等.銀杏內(nèi)生真菌菌種的分離及鑒定[J].華西藥學(xué)雜志，2006，21（5）：425-427.

[9] YUE Q，MILLER C J，WHITE J F，et al. Isolation and characterization of fungal inhibitors from Epichlo？觕 festucae[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48（10）：4687-4692.

[10] STROBEL G，STIERLE A，STIERLE D，et al. Taxomyces andreanae，a proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with Pacific yew（Taxus brevifolia）[J].Mycotaxon，1993，47：71-80.

[11] CLAYDON N，GROVE J F，POPLE M. Elm bark beetle boring and feeding deterrents from Phomopsis oblonga[J].Phytochemistry，1985，24（5）：937-943.

[12] 張立新，劉慧平，韓巨才，等.番茄內(nèi)生真菌的分離和拮抗生防菌的篩選[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，25（1）：30-33.