• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    小桐子類固醇還原酶基因Jc5β-StR的克隆和表達(dá)分析

    2017-07-12 18:05:57黃堯瑤文錦芬鄧明華龔明陳浩維
    生物技術(shù)通報(bào) 2017年7期
    關(guān)鍵詞:桐子還原酶結(jié)構(gòu)域

    黃堯瑤文錦芬鄧明華龔明陳浩維

    (1. 昆明理工大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,昆明 650500;2. 昆明理工大學(xué)建筑與城市規(guī)劃學(xué)院,昆明 650500;3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院,昆明 650201;4. 云南師范大學(xué)生命科學(xué)院,昆明 650500)

    小桐子類固醇還原酶基因Jc5β-StR的克隆和表達(dá)分析

    黃堯瑤1文錦芬2鄧明華3龔明4陳浩維1

    (1. 昆明理工大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,昆明 650500;2. 昆明理工大學(xué)建筑與城市規(guī)劃學(xué)院,昆明 650500;3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院,昆明 650201;4. 云南師范大學(xué)生命科學(xué)院,昆明 650500)

    以小桐子(Jatropha curcas L.)cDNA為模版,克隆了Jc5β-StR基因的CDS序列,并對(duì)其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。序列分析表明該基因包含1 173 bp開放閱讀框(ORF),編碼390個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為44.23 kD,理論等電點(diǎn)為5.22。Blast搜索結(jié)果及進(jìn)化分析結(jié)果表明,Jc5β-StR與蓖麻5β-StR蛋白序列一致性最高(87%)且親緣關(guān)系最近。Jc5β-StR是一個(gè)短鏈還原酶,該蛋白編碼有一個(gè)短鏈還原酶家族(SDRs)的黃體酮5β還原酶(5β-POR),還含有SDRs的6個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。組織表達(dá)結(jié)果顯示Jc5β-StR在小桐子根、莖、葉、花、果皮和種子中都有表達(dá),在種子中表達(dá)量最高,且隨種子發(fā)育過程表達(dá)量逐漸上升,在種子生長發(fā)育的后期(50 d)達(dá)到最高值后下降。非生物脅迫(PEG、NaCl、低溫和機(jī)械損傷)誘導(dǎo)下,Jc5β-StR的表達(dá)量都不同程度上調(diào),推測(cè)其參與小桐子非生物脅迫響應(yīng)。

    小桐子;Jc5β-StR;克??;生物信息學(xué)分析;表達(dá)分析

    短鏈還原酶家族(Short-chain dehydrogenases/ reductases,SDRs)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最古老、最大的蛋白質(zhì)超家族之一,存在各種生物形式中,如古細(xì)菌,原核生物,真核生物和病毒等[1-2]。SDR家族成員在脂類、氨基酸、碳水化合物、激素類、異生物質(zhì)代謝和氧化還原反應(yīng)傳感機(jī)制中發(fā)揮重要作用。它們通常催化NADP(H)依賴的反應(yīng),其底物包括多元醇、類維生素A、類固醇、脂肪酸的衍生物和異源物質(zhì)等[3-4]。已報(bào)到的SDRs具有廣泛的生物學(xué)功能,不僅通過參與許多重要內(nèi)固醇化合物的合成來調(diào)控植物生長發(fā)育,如油菜素內(nèi)酯和強(qiáng)心苷等,還參與植物的脅迫應(yīng)答。半定量RT-PCR分析證實(shí),在草莓果實(shí)發(fā)育過程中,草莓短鏈還原酶基因FaSDR的表達(dá)量隨著果實(shí)的著色快速升高,揭示該基因可能參與草莓果實(shí)成熟調(diào)控[5]。擬南芥的一個(gè)短鏈還原酶基因AtHSD1通過調(diào)節(jié)油菜素內(nèi)酯生物合成,來調(diào)控植物的生長和發(fā)育[6,7]。類固醇5α-還原酶(DET2)也屬于SDR家族一員,是油菜素類固醇物質(zhì)生物合成途徑的限速酶,GbDET2基因在棉花纖維的起始和快速伸長過程中發(fā)揮著重要的作用[8]。從甘藍(lán)型油菜中克隆的β-酮脂酰輔酶A還原酶基因BnKCR1和BnKCR2在植株中普遍表達(dá),并在種子與根系中的表達(dá)最豐富,在酵母中異源表達(dá)這兩個(gè)基因恢復(fù)了酵母脂肪酸延長酶的活性[9]。胡椒(CaMNR1)和擬南芥(AtSDR1)中的薄荷酮新薄荷醇還原酶(MNR)基因增強(qiáng)了植物對(duì)多種病原菌的抗性[10]。

    類固醇5β還原酶5β-StR(3-o-Δ4,5steroid 5β-reductase)也是SDR家族的一員,能夠催化多種類固醇基質(zhì),在內(nèi)固醇化合物生物合成途徑上發(fā)揮作用。目前對(duì)于植物5β-StR的研究報(bào)道較少,Herl等[11]在2009年報(bào)道了一個(gè)擬南芥內(nèi)固醇5β還原酶基因At5β-StR,其蛋白序列和三維模型都與毛花洋地黃(Digitalis lanata)黃體酮5β還原酶(Dl5β-POR)相似度較高,5β-POR是一種類固醇化合物—強(qiáng)心苷生物合成途徑上的重要催化酶。半定量RTPCR發(fā)現(xiàn)擬南芥At5β-StR在莖和根中表達(dá)量最高,并且在甘露醇誘導(dǎo)20 h后的表達(dá)明顯增強(qiáng),推測(cè)At5β-StR還參與植物滲透脅迫調(diào)控。同年,Edyta等[12]研究報(bào)道5β-StR因?yàn)槠涮继茧p鍵活性,所以催化能力要強(qiáng)于5β-POR。

    小桐子(Jatropha curcas L.)又叫做膏桐、小油桐、老胖果、油蘆子、麻瘋樹等。原產(chǎn)熱帶美洲,分布于我國廣東、云南、四川、貴州、廣西等省區(qū)[13]。小桐子果實(shí)含油率高達(dá)60%,可以提練出不含硫、無污染、符合歐四排放標(biāo)準(zhǔn)的生物柴油,是中國重點(diǎn)開發(fā)的綠色能源樹種[14]。小桐子不擇土壤,耐干旱瘠薄,又是干熱河谷地區(qū)荒山造林的優(yōu)良樹種,具有廣泛的開發(fā)利用前景[15-16]。本研究從小桐子中克隆得到一個(gè)類固醇5β還原酶基因Jc5β-StR,進(jìn)行蛋白質(zhì)序列和功能結(jié)構(gòu)上的探討,并分析其在不同組織和非生物脅迫下的表達(dá)變化,以期為進(jìn)一步研究5β-StR基因的作用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試材料小桐子(Jatropha curcas L.)取自于云南省昆明市昆明理工大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地。取小桐子根、莖、葉、花、果皮和授粉后不同發(fā)育階段(10、20、30、40、50和60 d)的種子,立即液氮速凍后保存在-80℃的環(huán)境中備用。每種組織從10株小桐子樹上取樣,來源于3株樹上的組織混合作為1個(gè)組織樣品,4次重復(fù)。

    實(shí)驗(yàn)處理材料為穩(wěn)定成熟期的小桐子幼苗,取長勢(shì)基本一致的小桐子幼苗分別放置于NaCl(250 mmol/L)培養(yǎng)液、30% PEG 6000培養(yǎng)液和4℃培養(yǎng)箱中,機(jī)械損傷用消過毒的剪刀在每個(gè)小桐子葉片上各剪5下,注意不要剪斷葉片主脈。4種處理后的0(對(duì)照)、3、6、12和24 h取幼嫩的葉片。各處理3次重復(fù),材料用錫箔紙包好,立即液氮速凍后保存在-80℃的環(huán)境中備用。

    1.2 方法

    1.2.1 RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 小桐子RNA用TianGen公司植物總RNA提取試劑盒(RNAprep pure Kit,DP432)提取,cDNA鏈合成用大連寶生物公司(TaKaRa PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit)試劑盒,操作過程參考說明。產(chǎn)物放置于-20℃?zhèn)溆谩?.2.2 基因克隆 Jc5β-StR基因克隆特異引物設(shè)計(jì)為Jc5β-StR-F(5'-CCTCAGCCACCAACTACTA-3')和Jc5β-StR-R(5'-GTTCAAATCAAGGCACAAT-3'),PCR擴(kuò)增用大連寶生物公司的Taq酶(TaKaRa Ex Taq Hot Start Version)和5×PCR buffer,cDNA模板加入量為2 μL,操作過程均參考說明。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸40 s,35個(gè)循環(huán),72℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T并雙向測(cè)序,每個(gè)基因至少5個(gè)克隆。

    1.2.3 cDNA序列及其編碼氨基酸分析 用NCBI網(wǎng)站中的ORF finder找出基因的開放讀碼框(open reading frame,ORF)和其BLASTp程序進(jìn)行同源性分析;用DNAMAN軟件進(jìn)行核酸翻譯和多序列對(duì)比,采用MEGA7.0 Neighbor-joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行親緣關(guān)系分析。利用ProtParam在線軟件分析氨基酸殘基數(shù)目、組成和蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)等參數(shù)。利用ExPASy在線分析蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)。通過在線軟件SOPMA預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。用Modeling程序(http://swissmodel.expasy. org/)對(duì)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)??缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)用TMHMM-2.0 server,信號(hào)肽預(yù)測(cè)用SignalP。

    1.2.4 基因的表達(dá)分析 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行基因表達(dá)分析。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物序列為Jc5β-StR-qF(5'-GATTTGCCCAGATTAGACGCT-3')和Jc5β-StR-qR(5'-CAATCCCTCCTTCTTCGCTAC-3')。內(nèi)參基因序列設(shè)計(jì)為β-actin-F(5'-GCAGGCATCCACGAGACTACT-3')和β-actin-R(5'-GTCAGCAATACCAGGGAACATAG-3')。分別對(duì)反轉(zhuǎn)錄后不同組織和不同處理材料葉片cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。反應(yīng)體系為:2 μL cDNA模板、12.5 μL Premix TaqTM、0.5 μL Jc5β-StR-qF、0.5 μL Jc5β-StR-qR、加dd H2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min,94℃預(yù)變性30 s,59℃退火1 min,72℃延伸30 s,72℃延伸5 min,35個(gè)循環(huán)。根據(jù)廠商推薦,在羅氏LightCycler 480系統(tǒng)上進(jìn)行。每個(gè)材料做3次獨(dú)立重復(fù),采用2-ΔΔCT方法分析處理數(shù)據(jù),在組織表達(dá)分析中用表達(dá)量最低的組織作為校正子,在種子發(fā)育過程中的時(shí)序表達(dá)分析用第一發(fā)育階段(10 d)的樣品做校正子[17]。用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析,Excel 2013作圖。

    2 結(jié)果

    2.1 Jc5β-StR基因的克隆

    用RT-PCR方法對(duì)Jc5β-StR進(jìn)行克隆,瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀上觀察得到一條大約1 200 bp的產(chǎn)物(圖1),對(duì)其測(cè)序后,用ORF finder軟件分析Jc5β-StR基因編碼氨基酸序列,完整的ORF框編碼區(qū)為1 173 bp,編碼蛋白包含390個(gè)氨基酸(圖2)。

    2.2 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

    通過ProtParam軟件分析表明,Jc5β-StR蛋白相對(duì)分子量為44.23 kD,理論等電點(diǎn)為5.22,酸性氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)為49個(gè),堿性氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)為34個(gè),不穩(wěn)定系數(shù)為41.40,為不穩(wěn)定蛋白。原子總數(shù)是6 160個(gè),分子式為C2017H3032N520O578S13。脂肪系數(shù)為84.31,疏水系數(shù)為-0.299,為親水蛋白。

    2.3 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

    通過在線軟件SOPMA對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),結(jié)果表明Jc5β-StR蛋白含有豐富的α螺旋(Alpha he1ix)占氨基酸殘基總數(shù)的40.77%,其次是無規(guī)則卷曲(Random coil)占氨基酸殘基總數(shù)的33.08%,延伸鏈(Extended strand)占氨基酸殘基總數(shù)的17.18%,β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)占氨基酸殘基總數(shù)的8.97%(圖3)。

    通過Prosite在線數(shù)據(jù)庫分析,發(fā)現(xiàn)Jc5β-StR蛋白序列含有3類功能位點(diǎn)包括2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(N-glycosylation site),7個(gè)豆蔻酰化位點(diǎn)(N-myristoylation site)和7個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(Casein kinase II phosphorylation site)。登錄http://swissmodel.expasy.org/中的MODELING,對(duì)小桐子Jc5β-StR蛋白三級(jí)建模,結(jié)果顯示Jc5β-StR蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型以黃體酮5β還原酶(5β-POR)為模板,序列相似度為74.86%,建模結(jié)果如圖4所示。2.4 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)

    圖1 Jc5β-StR基因電泳檢測(cè)圖

    蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Jc5β-StR最有可能定位在細(xì)胞質(zhì)??缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明Jc5β-StR不具有跨膜結(jié)構(gòu)域。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明Jc5β-StR不具有信號(hào)肽,說明它不是一個(gè)分泌蛋白。

    2.5 Jc5β-StR序列一致性分析

    通過NCBI Blast序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)5β-StR基因在多種植物中均存在,Jc5β-StR與大戟科蓖麻(Ricinus communis)序列一致性最高,為87%;其次與胡桃科核桃(Juglans regia)序列一致性為83%,與梧桐科可可樹(Theobroma cacao)序列一致性為82%;與薔薇科白梨(Pyrus bretschneideri)序列一致性為81%;與蕓香科甜橙(Citrus sinensis)、錦葵科陸地棉(Gossypium hirsutum)、薔薇科蘋果(Malus domestica)和梅(Prunus mume)等序列一致性為80%;與大豆(Glycine max)、辣椒(Capsicum annuum)、油菜(Brassica napus)等其他幾十種植物序列一致性為75%-79%。Jc5β-StR與不同種類植物序列一致性較高,說明該基因在植物進(jìn)化過程中較保守。

    圖2 Jc5β-StR全長序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

    圖3 Jc5β-StR蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

    圖4 Jc5β-StR蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)

    Jc5β-StR屬于NADB Rossmann超家族(圖5)。該蛋白編碼一個(gè)短鏈還原酶家族(SDRs)的黃體酮5β還原酶(5β-POR),Jc5β-StR也有含有SDRs的6個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(圖6),表明Jc5β-StR是一個(gè)短鏈還原酶。結(jié)構(gòu)域Ⅰ-Ⅲ在所有NADP依賴的SDRs中都存在,是典型的SDRs結(jié)構(gòu)域,余下的3種Ⅳ-Ⅵ結(jié)構(gòu)域,不是所有的SDRs都存在,特別是Ⅴ結(jié)構(gòu)域(NFYYxxED),是5β-POR類的典型結(jié)構(gòu)域[11]。

    2.6 Jc5β-StR進(jìn)化分析

    用MEAG7.0軟件對(duì)Jc5β-StR蛋白氨基酸序列和其他植物的5β-StR蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析,結(jié)果表明,Jc5β-StR的進(jìn)化基本符合植物分類學(xué)分類,并具有明顯的種屬特性,如屬薔薇科的蘋果和梨組成一個(gè)分支,Jc5β-StR與大戟科蓖麻聚在一枝(圖7),說明其與蓖麻親緣關(guān)系最近。

    2.7 Jc5β-StR表達(dá)分析

    圖5 Jc5β-StR保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

    圖6 Jc5β-StR與不同物種5β-StR氨基酸序列對(duì)比

    以β-actin作為內(nèi)參,對(duì)小桐子Jc5β-StR在不同組織和種子不同發(fā)育階段的表達(dá)情況進(jìn)行qRT-PCR分析,分析結(jié)果表明,Jc5β-StR在小桐子根、莖、葉、花、果皮和種子中都有表達(dá),在種子和葉片中的表達(dá)量顯著高于其他組織。Jc5β-StR在種子發(fā)育過程中的定量分析(圖8)表明,該基因在種子整個(gè)生長發(fā)育期都有表達(dá),在種子生長發(fā)育前期其表達(dá)水平不斷增加,在種子生長發(fā)育的后期(50 d)達(dá)到最高值,然后下降。

    Jc5β-StR在PEG、NaCl、機(jī)械損傷和低溫4℃處理下表達(dá)都不同程度提高,PEG處理下表達(dá)水平變化顯著,在第12 h達(dá)到最高值,為對(duì)照樣品表達(dá)量的6倍左右。NaCl處理下12 h達(dá)到最高值,為對(duì)照樣品的1.8倍左右。機(jī)械損傷處理下第6 h達(dá)到最高值,為對(duì)照樣品的3.7倍左右。4℃處理下Jc5β-StR在第3小時(shí)表達(dá)水平就達(dá)到最高值,為對(duì)照樣品的2.5倍左右,之后緩慢下降(圖9)。

    圖7 不同植物5β-StR氨基酸序列進(jìn)化樹分析

    3 討論

    本研究通過RT-PCR方法從小桐子中克隆了一個(gè)小桐子類固醇5β還原酶基因(Jc5β-StR),分析其ORF大小為1 173 bp,編碼蛋白包含390個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)其相對(duì)分子量為44.23 kD,理論等電點(diǎn)為5.22。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)其定位在細(xì)胞質(zhì),沒有跨膜結(jié)構(gòu)域,也不具有信號(hào)肽。Blast結(jié)果表明Jc5β-StR屬于NADB Rossmann超家族。其序列與同屬于大戟科的蓖麻5β-StR序列一致性最高,為87%,進(jìn)化樹分析表明其與蓖麻5β-StR親緣關(guān)系最近。該蛋白編碼一個(gè)短鏈還原酶家族(SDRs)的黃體酮5β還原酶(5β-POR),也含有SDRs的6個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,證明Jc5β-StR是一個(gè)短鏈還原酶。

    圖8 Jc5β-StR基因在不同組織(A)和種子不同發(fā)育時(shí)期(B)的表達(dá)

    圖9 小桐子Jc5β-StR基因在不同非生物脅迫處理下的表達(dá)

    類固醇化合物對(duì)植物生長發(fā)育過程具有調(diào)節(jié)作用,Mandava報(bào)道了甾和皂苷對(duì)某些植物的生長過程均有調(diào)節(jié)作用,特別是甾醇和性激素對(duì)一些植物的生長具有促進(jìn)作用[18]。種子作為小桐子的生殖器官,在發(fā)育過程中大量合成和累積類固醇化合物,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)定量分析結(jié)果,Jc5β-StR在小桐子種子中高表達(dá),并且在種子生長發(fā)育期表達(dá)量上升,種子成熟期(50 d)表達(dá)量達(dá)到最高值后下降,表達(dá)量變化過程與種子生長發(fā)育趨勢(shì)一致,進(jìn)一步驗(yàn)證了5β-StR在類固醇化合物生物合成途徑上的重要作用。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)還表明Jc5β-StR也屬于SDRs家族一員,已報(bào)到的SDRs廣泛參與植物的初級(jí)代謝和次級(jí)代謝,在植物生長發(fā)育和抗逆機(jī)制中發(fā)揮重要作用[5-11]。本研究小桐子幼苗在PEG、NaCl、機(jī)械損傷和低溫這4種非生物脅迫處理下Jc5β-StR基因表達(dá)量都不同程度上調(diào),由此推測(cè)Jc5β-StR也參與小桐子非生物脅迫應(yīng)答。本研究為深入了解5β-StR基因的功能和小桐子的抗逆機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

    4 結(jié)論

    本研究報(bào)道了小桐子的一個(gè)內(nèi)固醇5β還原酶基因 Jc5β-StR。序列全長1 173 bp,編碼390個(gè)氨基酸。該基因編碼的蛋白含有SDRs的6個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。Jc5β-StR具有組織表達(dá)特異性,在種子中表達(dá)量最高,還受多種非生物脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。

    [1]Jornvall H, Hedlund J, Bergman T, et al. Superfamilies SDR and MDR:from early ancestry to present forms. Emergence of three lines a Zn-metalloenzyme, and distinct variabilities[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 396:125-130.

    [2]Moummou H, KallbergY, Tonfack LB, et al. The plant short chain dehydrogenase(SDR)superfamily:genome-wide inventory and diversification patterns[J]. BMC Plant Biol, 2012:12:1-17.

    [3]Oppermann U, Filling C, Hult M, et al. Short-chain dehydrogenases/ reductases(SDR):the 2002 update[J]. Chem-Biol Interact, 2003, 143:247-253.

    [4]Kallberg Y, Oppermann U, Persson B. Classification of the short-chain dehydrogenase/ reductase superfamily using hidden models[J]. Febs Journal, 2010, 277:2375-2386.

    [5]楊東曉, 侯柄竹, 沈元月. 草莓果實(shí)FaSDR基因的克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)分析[J]. 中國園藝文摘, 2015, 9:19-21.

    [6]Li F, Asami T, Wu X, et al. A putative hydroxysteroid dehydrogenase involved in regulating plant growth and development[J]. PlantPhysiol, 2007, 145:87-97.

    [7]Baud S, Dichow NR, Kelemen Z, et al. Regulation of HSDl in seeds of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell Physiol, 2009, 50:1463-1478.

    [8]陳全家, 劉超, 倪志勇, 等. 海島棉GbDET2基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 分子植物育種, 2015, 13(1):119-124.

    [9] Puyaubert J, Dieryck W, Costaglioli P, et al. Temporal gene expression of 3-ketoacyl-CoA reductase is different in high and in low erucic acid Brassica napes cultivars during seed development[J]. Biochim Biophys Acta, 2005, 1687:152-163.

    [10] Choi HW, Lee BC, Kim NH, et al. A role for a reductase in resistance against microbial pathogens in plants[J]. Plant Physiol, 2008, 148:383-401.

    [11] Herl V, Fischer G, Reva VA, et al. The VEP1 gene(At4g24220)encodes a short-chain dehydrogenase/reductase with 3-oxo-Δ4,5-steroid 5β -reductase activity in Arabidopsis thaliana L. [J]. Biochimie, 2009, 91:517-525.

    [12]Edyta B, Marina K, Gabriele F, et al. Recombinant Δ4,5-steroid 5β -reductase as biocatalysts for the reduction of activated C=C-double bonds in monocyclic and acyclic molecules[J]. Adv Synth Catal, 2009, 351(17):2787-2790.

    [13]余帥勇, 丁貴杰. 能源植物麻瘋樹研究進(jìn)展[J]. 貴州林業(yè)科技, 2009, 37(1):49-54.

    [14] 曾覺民. 可大力發(fā)展的生物質(zhì)能源植物——膏桐[J]. 云南林業(yè), 2006, 27(2):21-22.

    [15]呂文, 王春蜂, 王國勝, 等. 中國林業(yè)生物質(zhì)能源發(fā)展?jié)摿Φ难芯浚跩]. 中國能源, 2005, 27(11):21-26.

    [16]林娟, 周選圍, 唐克軒, 等. 麻瘋樹植物資源研究概況[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2004, 12(3):285-290.

    [17]Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J]. Methods, 2001, 25:402-408.

    [18]Mandava. Planta growth substances[J]. ACS symposium Seris, 1979, 160:164-165.

    (責(zé)任編輯 狄艷紅)

    Cloning and Expression Analysis of Jc5β-StR Gene in Jatropha curcas

    HUANG Yao-yao1WEN Jin-fen2DENG Ming-hua3GONG Ming4CHEN Hao-wei11. Faculty of Modern Agricultural Engineering,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500;2. Faculty of Architecture and City Planning,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500;3. Faculty of Landscape and Horticulture,Yunnan
    Agricultural University,Kunming 650201;4. School of Life Sciences,Yunnan Normal University,Kunming 650500)

    The CDS sequence of Jc5β-StR gene was cloned with Jatropha curcas cDNA as template,and analyzed by bioinformatics analysis. The opening reading frame(ORF)of Jc5β-StR was 1 173 bp encoded 390 amino acids. The predicted molecular weight was 44.23 kD,and theoretical isoelectric point(pI)was 5.22. Blast searching and phylogenetic analysis showed that Jc5β-StR had highest identity(87%)and closest relationships with the 5β-StR of Ricinus communis. Jc5β-StR was a short-chain reductase,containing a progesterone 5β reductase(5β-POR)in a family of short chain reductase(SDRs),and also 6 conserved domains of SDRs. Jc5β-StR expressed in different tissues of root,stem,leave,flower,seed capsule,and seed,the 1highest in seed;moreover,the expression gradually rose with the development of seed,and declined after peak in the later stage of seed development(50 d). The abiotic stress such as NaCl,PEG,4℃,and mechanical damage resulted in the up-regulation of Jc5β-StR expression in varied level,indicating that Jc5β-StR involved in the response to abiotic stress.

    Jatropha curcas L.;Jc5β-StR;clone;bioinformatics analysis;expression analysis

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1114

    2016-12-08

    國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460355)

    黃堯瑤,女,碩士研究生,研究方向:分子生物學(xué);E-mail:358680047@qq.com

    文錦芬,博士,副教授,研究方向:植物次生代謝產(chǎn)物;E-mail:wenjf888@163.com

    猜你喜歡
    桐子還原酶結(jié)構(gòu)域
    四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與冠心病嚴(yán)重程度的相關(guān)性
    桐子樹
    含笑花(2019年3期)2019-06-12 05:04:23
    蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域劃分方法及在線服務(wù)綜述
    凍桐子花
    文苑(2018年20期)2018-11-09 01:35:54
    小桐子種源試驗(yàn)與選擇
    重組綠豆BBI(6-33)結(jié)構(gòu)域的抗腫瘤作用分析
    組蛋白甲基化酶Set2片段調(diào)控SET結(jié)構(gòu)域催化活性的探討
    蒲公英的重量
    心理與健康(2015年6期)2015-05-30 10:48:04
    泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域與泛素化信號(hào)的識(shí)別
    發(fā)酵液中酮基還原酶活性測(cè)定方法的構(gòu)建
    中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:15
    91久久精品国产一区二区成人| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 男女床上黄色一级片免费看| 最近中文字幕高清免费大全6 | 极品教师在线免费播放| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国内精品美女久久久久久| 国产伦精品一区二区三区视频9| 男女之事视频高清在线观看| bbb黄色大片| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美日韩综合久久久久久 | 99热只有精品国产| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美潮喷喷水| 97碰自拍视频| 超碰av人人做人人爽久久| 简卡轻食公司| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| АⅤ资源中文在线天堂| 国产成人aa在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美黄色片欧美黄色片| 麻豆国产av国片精品| 九色国产91popny在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产精品av视频在线免费观看| 成人午夜高清在线视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲av五月六月丁香网| 国产欧美日韩一区二区三| 免费人成视频x8x8入口观看| 精品久久久久久久久久久久久| 99久久九九国产精品国产免费| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 99国产综合亚洲精品| x7x7x7水蜜桃| 99国产精品一区二区三区| 国产野战对白在线观看| 欧美激情在线99| 特大巨黑吊av在线直播| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 十八禁网站免费在线| 亚洲成av人片免费观看| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美一区二区精品小视频在线| 十八禁网站免费在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 如何舔出高潮| 欧美日韩综合久久久久久 | 精品久久久久久久久av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| www.熟女人妻精品国产| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久久久久久久大av| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产成人啪精品午夜网站| 少妇高潮的动态图| 国内揄拍国产精品人妻在线| 欧美成人a在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美在线黄色| 桃红色精品国产亚洲av| 免费在线观看日本一区| 两个人的视频大全免费| 亚洲精品粉嫩美女一区| 最新在线观看一区二区三区| 内射极品少妇av片p| 亚洲精品成人久久久久久| 51午夜福利影视在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲国产精品合色在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 成人无遮挡网站| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲成人免费电影在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产淫片久久久久久久久 | 国产精品,欧美在线| 久久性视频一级片| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品影院久久| 99国产精品一区二区蜜桃av| 免费黄网站久久成人精品 | 亚洲人成电影免费在线| 欧美+日韩+精品| 美女免费视频网站| 毛片一级片免费看久久久久 | 麻豆一二三区av精品| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 精品一区二区三区av网在线观看| av天堂在线播放| 18禁在线播放成人免费| 亚洲第一电影网av| 精品一区二区三区人妻视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲av免费在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 高清在线国产一区| 国产成人a区在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 特级一级黄色大片| 久久九九热精品免费| 一级黄片播放器| 国产单亲对白刺激| 天堂av国产一区二区熟女人妻| av天堂在线播放| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 九九在线视频观看精品| 变态另类丝袜制服| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区 | 国产淫片久久久久久久久 | 亚洲av成人av| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产伦精品一区二区三区视频9| 免费观看的影片在线观看| 免费人成在线观看视频色| 此物有八面人人有两片| 制服丝袜大香蕉在线| 人妻久久中文字幕网| 日韩中文字幕欧美一区二区| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产在视频线在精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 露出奶头的视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 一级黄色大片毛片| 一二三四社区在线视频社区8| 美女 人体艺术 gogo| 免费看光身美女| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 中文字幕高清在线视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 午夜激情福利司机影院| av福利片在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲人成网站在线播| 在线天堂最新版资源| 麻豆国产97在线/欧美| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 91麻豆精品激情在线观看国产| 能在线免费观看的黄片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产精品一区二区三区四区久久| 成年女人毛片免费观看观看9| 日本成人三级电影网站| 99国产综合亚洲精品| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品一区二区性色av| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 老司机福利观看| 国产午夜福利久久久久久| 一个人免费在线观看的高清视频| 99久久成人亚洲精品观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 免费看美女性在线毛片视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日韩免费av在线播放| 日日干狠狠操夜夜爽| 男女那种视频在线观看| 久久精品国产自在天天线| 国产精华一区二区三区| 免费看光身美女| 亚洲av免费在线观看| 99热这里只有是精品在线观看 | 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲中文日韩欧美视频| 美女黄网站色视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产综合懂色| 国产男靠女视频免费网站| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 精品人妻1区二区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久精品国产自在天天线| 精品一区二区三区视频在线| 看十八女毛片水多多多| av在线天堂中文字幕| 级片在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 免费观看精品视频网站| 我的老师免费观看完整版| 日韩欧美在线乱码| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 免费在线观看成人毛片| 99热这里只有是精品50| 色5月婷婷丁香| 一区二区三区激情视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久久久久大精品| 久久久久九九精品影院| 国产麻豆成人av免费视频| 老女人水多毛片| 日韩精品中文字幕看吧| 欧美+日韩+精品| 一区二区三区高清视频在线| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产欧美日韩一区二区精品| 99久久九九国产精品国产免费| 成年女人永久免费观看视频| 国产高清三级在线| 最新中文字幕久久久久| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲av二区三区四区| 九九热线精品视视频播放| 国产在视频线在精品| 村上凉子中文字幕在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 麻豆成人av在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 少妇的逼水好多| 一进一出好大好爽视频| 亚洲av不卡在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久久久久久久久成人| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久精品人妻少妇| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产三级黄色录像| 久久久久性生活片| 搞女人的毛片| 一a级毛片在线观看| 丰满乱子伦码专区| 久久精品国产自在天天线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 男女视频在线观看网站免费| 国产淫片久久久久久久久 | 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲欧美日韩东京热| 久久热精品热| 久久99热这里只有精品18| 麻豆国产97在线/欧美| 一夜夜www| 女人被狂操c到高潮| 午夜久久久久精精品| 成年女人看的毛片在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99热精品在线国产| 男女床上黄色一级片免费看| 国产大屁股一区二区在线视频| 搡老岳熟女国产| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久香蕉精品热| 男女之事视频高清在线观看| 国产午夜精品论理片| 有码 亚洲区| 国产综合懂色| 亚洲av.av天堂| 精品日产1卡2卡| 久久久久亚洲av毛片大全| 美女cb高潮喷水在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 露出奶头的视频| 国产色婷婷99| 宅男免费午夜| 中文在线观看免费www的网站| 搡老岳熟女国产| 美女 人体艺术 gogo| 成人特级黄色片久久久久久久| 舔av片在线| 欧美成人性av电影在线观看| 一区二区三区激情视频| 亚洲 国产 在线| 黄色视频,在线免费观看| 精品久久久久久成人av| 婷婷精品国产亚洲av| 88av欧美| 老司机午夜十八禁免费视频| 伦理电影大哥的女人| 精品人妻视频免费看| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲最大成人中文| 丰满的人妻完整版| 亚洲人成电影免费在线| 免费看光身美女| 亚洲av美国av| 99久久精品国产亚洲精品| h日本视频在线播放| 国产精品一区二区三区四区久久| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 日韩有码中文字幕| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 五月伊人婷婷丁香| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美一区二区国产精品久久精品| aaaaa片日本免费| 欧美不卡视频在线免费观看| 深夜精品福利| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美3d第一页| 欧美区成人在线视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 免费看日本二区| 全区人妻精品视频| 成人特级av手机在线观看| 很黄的视频免费| 看片在线看免费视频| www日本黄色视频网| 丝袜美腿在线中文| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲无线在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 一本精品99久久精品77| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲无线在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 好男人电影高清在线观看| 青草久久国产| 国产精品久久久久久久电影| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品国产亚洲在线| 在现免费观看毛片| 久久热精品热| 99久久精品国产亚洲精品| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美色视频一区免费| 久久精品91蜜桃| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 真人一进一出gif抽搐免费| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产成人影院久久av| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 美女cb高潮喷水在线观看| 一区二区三区激情视频| 亚洲国产色片| 波多野结衣高清无吗| 美女 人体艺术 gogo| 日韩精品青青久久久久久| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 最新在线观看一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲美女搞黄在线观看 | 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品亚洲一级av第二区| 九色成人免费人妻av| 婷婷丁香在线五月| 欧美日韩综合久久久久久 | 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产一区二区在线av高清观看| 如何舔出高潮| 国产精品综合久久久久久久免费| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日本成人三级电影网站| 黄色视频,在线免费观看| 观看免费一级毛片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲,欧美精品.| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产av麻豆久久久久久久| 午夜福利18| 国产淫片久久久久久久久 | 在线观看66精品国产| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲经典国产精华液单 | 看黄色毛片网站| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美色视频一区免费| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲av成人av| 久久久国产成人精品二区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 人妻久久中文字幕网| 国产伦精品一区二区三区视频9| 99久久成人亚洲精品观看| 在线免费观看的www视频| 成人美女网站在线观看视频| 午夜福利免费观看在线| 伊人久久精品亚洲午夜| 午夜福利在线观看吧| 精品国产亚洲在线| 热99re8久久精品国产| av在线观看视频网站免费| 国产成人欧美在线观看| 日本 av在线| 国产在视频线在精品| 少妇丰满av| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美一区二区精品小视频在线| x7x7x7水蜜桃| 在线观看一区二区三区| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲无线在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| av国产免费在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲美女搞黄在线观看 | 亚洲综合色惰| 女人被狂操c到高潮| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 日韩精品中文字幕看吧| 欧美性猛交黑人性爽| 免费观看人在逋| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产久久久一区二区三区| 欧美黑人欧美精品刺激| 9191精品国产免费久久| 成人午夜高清在线视频| 999久久久精品免费观看国产| 少妇人妻精品综合一区二区 | 熟女人妻精品中文字幕| 丁香欧美五月| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲国产欧美人成| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 桃红色精品国产亚洲av| 欧美又色又爽又黄视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲最大成人手机在线| 午夜免费成人在线视频| 欧美潮喷喷水| 少妇的逼好多水| 久久久久免费精品人妻一区二区| 免费搜索国产男女视频| 亚洲成人久久性| 日本黄色片子视频| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美最黄视频在线播放免费| 天美传媒精品一区二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 热99re8久久精品国产| 欧美在线黄色| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 我要搜黄色片| 国产精品久久久久久久电影| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲片人在线观看| 免费在线观看日本一区| 51午夜福利影视在线观看| 午夜两性在线视频| x7x7x7水蜜桃| 99久久精品热视频| 成人精品一区二区免费| 免费人成视频x8x8入口观看| 日韩欧美 国产精品| 国产成人欧美在线观看| 亚州av有码| 中文资源天堂在线| 看黄色毛片网站| 极品教师在线免费播放| 女同久久另类99精品国产91| 美女 人体艺术 gogo| 最新中文字幕久久久久| 欧美潮喷喷水| 日韩av在线大香蕉| 麻豆久久精品国产亚洲av| 女人被狂操c到高潮| 丰满的人妻完整版| 国产精品人妻久久久久久| 毛片一级片免费看久久久久 | 亚洲精品日韩av片在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 我要看日韩黄色一级片| 欧美日韩综合久久久久久 | 直男gayav资源| 成年女人永久免费观看视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 成人三级黄色视频| 久久久精品大字幕| 69人妻影院| 在线a可以看的网站| 午夜激情欧美在线| 国产免费av片在线观看野外av| 真人做人爱边吃奶动态| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲 国产 在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美性猛交黑人性爽| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲美女视频黄频| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久午夜福利片| 波多野结衣高清无吗| 在线播放国产精品三级| 丰满乱子伦码专区| av天堂中文字幕网| 亚洲欧美激情综合另类| 免费电影在线观看免费观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 精品久久国产蜜桃| 9191精品国产免费久久| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲午夜理论影院| 亚洲无线在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产成年人精品一区二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产成人福利小说| 久久久久久久久中文| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲最大成人中文| 性插视频无遮挡在线免费观看| 99视频精品全部免费 在线| 欧美乱妇无乱码| ponron亚洲| x7x7x7水蜜桃| 久久国产乱子伦精品免费另类| 老司机午夜福利在线观看视频| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品久久电影中文字幕| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久久久久久久中文| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲欧美日韩东京热| 18美女黄网站色大片免费观看| 午夜福利在线在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲av第一区精品v没综合| 日韩欧美 国产精品| 欧美国产日韩亚洲一区| 18禁在线播放成人免费| 精品一区二区三区人妻视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 一个人免费在线观看的高清视频| 日本黄色视频三级网站网址| 老司机福利观看| 久久久久久大精品| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲av不卡在线观看| 成人特级av手机在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久草成人影院| 成年女人永久免费观看视频| 国产视频一区二区在线看| 亚洲精品456在线播放app | 啪啪无遮挡十八禁网站| 婷婷精品国产亚洲av在线| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 神马国产精品三级电影在线观看| 99热这里只有是精品50| 99久久无色码亚洲精品果冻| 最好的美女福利视频网| 高潮久久久久久久久久久不卡| 毛片一级片免费看久久久久 | 国产精品,欧美在线| 天天一区二区日本电影三级| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精品乱码久久久久久99久播| 伊人久久精品亚洲午夜| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 99热只有精品国产| 亚洲色图av天堂| 麻豆av噜噜一区二区三区| 精品久久久久久久久av| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 精品午夜福利视频在线观看一区| 色综合站精品国产| 亚洲电影在线观看av| 色av中文字幕| 舔av片在线| 91久久精品电影网| 国产综合懂色|