微生物浸出過程中胞外蛋白的作用及其機理研究進展

余潤蘭 劉阿娟 劉亞楠 劉學(xué)端 邱冠周 曾偉民

（1. 中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，長沙 410083；2. 中南大學(xué)生物冶金教育部重點實驗室，長沙 410083）

微生物浸出過程中胞外蛋白的作用及其機理研究進展

余潤蘭 劉阿娟 劉亞楠 劉學(xué)端 邱冠周 曾偉民

（1. 中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，長沙 410083；2. 中南大學(xué)生物冶金教育部重點實驗室，長沙 410083）

礦物-微生物-溶液多相界面是硫化礦生物浸出的關(guān)鍵場所，界面微生物胞外多聚物（EPS）關(guān)鍵組分胞外蛋白在生物膜形成、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和硫化礦溶解等方面起到關(guān)鍵作用。綜述了生物浸出過程中EPS關(guān)鍵組分胞外蛋白的研究進展和胞外蛋白現(xiàn)有的研究方法及其對冶金微生物胞外蛋白研究的適用性，展望了浸礦微生物胞外蛋白研究的前景，旨為生物冶金領(lǐng)域研究EPS關(guān)鍵組分胞外蛋白結(jié)構(gòu)及其作用機理提供重要的理論和方法支撐。

生物浸出；胞外多聚物（EPS）；胞外蛋白；激光共聚焦顯微鏡（CLSM）

生物浸出技術(shù)是低成本、環(huán)境友好地開發(fā)礦產(chǎn)資源的高新技術(shù)，對保證我國礦產(chǎn)資源可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

對于生物浸出反應(yīng)機制，大家普遍接受“非接觸浸出”和 “接觸浸出”的聯(lián)合機制［1，2］?！胺墙佑|浸出”機制是指浸出溶液中的Fe2+離子被溶液中懸浮細菌氧化成 Fe3+離子，F(xiàn)e3+與礦物表面接觸氧化硫化礦物，而Fe3+被還原成Fe2+，依次循環(huán)；“接觸浸出”機制是指生物浸出反應(yīng)過程中，微生物分泌胞外多聚物（Extracellula r polymeric substances，EPS），吸附至礦物表面，細菌群體生長并形成微菌落，營造出不連續(xù)的、局部的、三維網(wǎng)狀聚集的、微米量級厚度的生物膜，營造出細菌生存和礦物溶解的微觀環(huán)境。生物膜作為礦物、細菌和浸出溶液間的中間媒介，是細菌生存和礦物溶解的共同場所，因此，生物膜在生物浸出體系中具有非常重要的作用，已成為目前生物浸出反應(yīng)理論研究的熱點。

生物膜EPS的主要成分是多糖、蛋白質(zhì)及脂肪酸等。在生物浸礦領(lǐng)域，對EPS功能及其作用，目前研究最多的是胞外多糖，而蛋白質(zhì)作為EPS的關(guān)鍵組分之一，其功能作用和機理研究較少；報道的胞外蛋白的分離提取方法也多種多樣，而胞外蛋白關(guān)鍵成分的結(jié)構(gòu)、功能及其作用的研究更少，不利于基于EPS的生物膜在生物冶金過程中作用機制的闡明。本文綜述了胞外蛋白特別是多糖結(jié)合型胞外蛋白的研究進展、胞外蛋白的現(xiàn)有研究方法及其對冶金微生物胞外蛋白研究的適用性，展望了浸礦微生物胞外蛋白研究的前景，旨為生物冶金領(lǐng)域研究EPS關(guān)鍵組分胞外蛋白結(jié)構(gòu)及其作用提供重要的理論和方法支撐。

1 胞外蛋白對生物浸出的影響

目前，越來越多的人認可胞外多聚物（EPS）關(guān)鍵組分胞外蛋白在生物膜形成、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和硫化礦溶解等方面起到關(guān)鍵作用［3］。Sampson等［4］歸納了包括微生物表面EPS黏液層的分泌，蛋白結(jié)合受體分泌，多糖和蛋白復(fù)合物的分泌等在內(nèi)的浸礦生物吸附到礦物表面的作用方式。Zeng等［5］使用GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析了吸附到礦物表面的微生物產(chǎn)生胞外多聚物的成分，主要包括蛋白質(zhì)、糖類和脂肪酸等。Zhang等［6］通過對硫營養(yǎng)條件下Aci dithiobacillus ferrooxidans的EPS中蛋白質(zhì)成分的研究認為，部分蛋白質(zhì)通過Pr-SH與元素硫結(jié)合，進而直接參與硫的代謝活動。Zhang等［7］研究了極端嗜酸古菌Ferroplasma acidiphilum在礦物表面的聚集及生物膜的形成情況發(fā)現(xiàn)，其在黃鐵礦表面形成單層生物膜，且其最先吸附到黃銅礦表面的裂縫處。Guo等［8］通過比較基因組學(xué)分析揭示了Sulfobacillus thermosulfidooxidans ST的代謝多樣性及其環(huán)境適應(yīng)機制，研究發(fā)現(xiàn)至少230個假定的轉(zhuǎn)運蛋白，其中結(jié)構(gòu)元件大約有90個轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和50個代表性運輸家族。Morales［9］通過研究S. thermosulfidooxidans 在黃鐵礦表面生成EPS的情況發(fā)現(xiàn)，EPS矩陣在整個浸礦過程中不斷變化，其中胞外蛋白的含量受介質(zhì)中氮源含量變化的影響。此外，胞外蛋白的含量也與生物膜的形成階段有關(guān)。

胞外蛋白可以與金屬離子發(fā)生螯合或鍵合作用，促進微生物細胞之間的聚集；微生物也可通過形成多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物吸附在礦物表面，組成生物膜的網(wǎng)狀骨架等。因此，在浸礦領(lǐng)域深入研究 浸礦菌EPS關(guān)鍵組分胞外蛋白在生物浸出過程中的含量變化、基因表達以及在礦物表面的分布情況對微生物吸附、細菌的生長、生物膜形成和穩(wěn)定等的影響，可為闡明胞外蛋白在生物浸出過程中的作用機理提供理論依據(jù)，對深入理解EPS的作用機理和實際應(yīng)用都有重要意義。

2 胞外蛋白的作用及其機理

通常胞外蛋白根據(jù)存在形式分為結(jié)合型胞外蛋白和溶解型胞外蛋白。從生物降解角度來說，胞外蛋白分為可降解的蛋白和不可降解的蛋白；根據(jù)其在生物膜形成過程中的作用又可分為兩類：一類是胞外結(jié)構(gòu)蛋白，主要形成生物膜的骨架，促進生物膜的形成等；一類是胞外非結(jié)構(gòu)蛋白，大部分是一些酶類，主要用于生物膜的降解、防止膜污染等［10，11］。

2.1 胞外結(jié)構(gòu)蛋白

胞外結(jié)構(gòu)蛋白在生物膜中所占比例較高，可分為多糖結(jié)合型胞外蛋白（Polyasccharides binding extracellular proteins）、細胞結(jié)合型胞外蛋白（Cellbinding extracellular proteins）、生物膜結(jié)合型胞外蛋白（Biofilm-associated protein）、核酸結(jié)合型胞外蛋白（Nucleic acid binding proteins）。

2.1.1 多糖結(jié)合型蛋白 多糖結(jié)合型蛋白是生物膜形成初期的重要組成部分。如Bran da等［12］通過研究革蘭氏陽性菌Bacillus subtilis生物膜的形成發(fā)現(xiàn)，胞外蛋白TasA與多糖結(jié)合生成網(wǎng)狀生物膜骨架，若這個組分缺失，則不能形成成熟的生物膜。Gilboa-Garber等［13，14］對Pseudomonas aeruginosa 胞外蛋白中多糖結(jié)合型胞外蛋白LecA（PA-IL）、LecB（PA-IIL）凝集素的提取方法、相關(guān)組分定性定量及功能等方面的研究，結(jié)果表明外源 LecA（PA-IL）凝集素受到了群體感應(yīng)系統(tǒng)（Quorum-sensing，QS）的調(diào)控，lecA表達過少，導(dǎo)致生物膜的厚度及覆蓋面積減少，lecA過表達，則會促進生物膜的形成；而LecB（PAIIL）凝集素與Ca2+等多價陽離子鍵合形成具有高親和力的多價配體可抑制該菌生物膜的形成，甚至使已形成生物膜的完全解體。此外，在P. aeruginosa中還發(fā)現(xiàn)LecA、LecB凝集素分別對半乳糖和海藻糖有較高的親和力，是P. aeruginosa膜形成初期不可或缺的組分，LecA與LecB的多糖復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，如圖1所示［15，16］。

圖1 LecA-半乳糖和LecB-海藻糖復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)［16］

2.1.2 細胞結(jié)合型胞外蛋白 細胞型結(jié)合蛋白能促進細胞和細胞外多糖的識別聚集，促進生物膜的形成和穩(wěn)定。Branda等［12］在研究Bacillus subtilis生物膜形成時發(fā)現(xiàn)CdrA蛋白可促進細胞表面蛋白與胞外多糖的結(jié)合，從而加劇更多細胞與生物膜的結(jié)合，促進生物膜的形成與穩(wěn)定。Park等［17］通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)活性污泥的EPS中富含根枯蛋白和鞭毛蛋白等多種蛋白，這些蛋白與細菌細胞的聚集、吸附及生物膜的形成有關(guān)。Boretska等［18］采用CLSM技術(shù)發(fā)現(xiàn)硫細菌Thiobacillus thioparus DSM 505的細胞結(jié)合型胞外蛋白在生物腐蝕過程中起重要作用。

2.1.3 生物膜結(jié)合型胞外蛋白 生物膜結(jié)合型蛋白絕大部分分布在細胞表面，主要用于維持生物膜結(jié)構(gòu)的致密性和穩(wěn)定性。Lasa等［10］研究了Bap蛋白在不同菌種形成生物膜中的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)現(xiàn)，Bap蛋白主要分布在細胞表面，且促進前期細胞間的粘附及非生物表面的吸附。Rendueles等［19］研究細菌在生物膜系統(tǒng)中的代謝與細胞間的交流時發(fā)現(xiàn)，生物膜結(jié)合型蛋白能夠有效促進生物膜結(jié)合大腸桿菌素，從而適應(yīng)外界環(huán)境的變化。

2.1.4 核酸結(jié)合型胞外蛋白 核酸結(jié)合型蛋白一般與胞外 DNA緊密結(jié)合，維持生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。此外，當細胞發(fā)生裂解、自溶時，胞內(nèi) DNA 釋放出來后可以與核酸結(jié)合型胞外蛋白結(jié)合，從而防止細胞遺傳物質(zhì)的丟失［2］。Wolffe［20］研究發(fā)現(xiàn)Y-box蛋白有固定的中心位點與核酸結(jié)合，從而實現(xiàn)信號的傳導(dǎo)或監(jiān)管相關(guān)物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄過程。Harami等［21］發(fā)現(xiàn)有翼的螺旋域（Winged helix domain，WHD）廣泛存在于核酸中，這個螺旋域主要與蛋白結(jié)合形成核酸結(jié)合蛋白（Nucleic acid binding proteins），胞內(nèi)的核酸結(jié)合蛋白主要行使轉(zhuǎn)錄監(jiān)管機構(gòu)的功能，分泌到胞外的核酸結(jié)合蛋白行使信號傳導(dǎo)的功能或形成生物膜的基本骨架，促進生物膜的形成與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

2.2 胞外非結(jié)構(gòu)蛋白

胞外非結(jié)構(gòu)蛋白主要包括各種細胞的胞外酶，是胞外蛋白的另一個主要存在形式。很多胞外酶蛋白都是在生物膜中被發(fā)現(xiàn)的，與生物膜的降解有關(guān)。胞外酶蛋白通過多種方式間接影響生物膜的形成和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，如在細胞生長的衰亡期，胞外酶蛋白降解EPS中的部分多糖類物質(zhì)，一方面為細胞生長提供碳源和能源；另一方面促進細胞從生物膜中脫落和釋放出來；但胞外大分子聚合物的過多水解又會造成生物膜結(jié)構(gòu)的失穩(wěn)和破壞，如Li等［22］在研究好氧污泥顆粒在饑餓階段EPS產(chǎn)生情況時發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)和碳水化合物的濃度分別從18.0 mg/g、7.1 mg/g降到了7.0 mg/g、2.9 mg/g，從而改變EPS的成分和細胞表面的疏水性。Lasa和Tielen等［10，23］研究了胞外酶對P. aeruginosa生物膜形成的影響發(fā)現(xiàn)，其分泌多種水解酶水解大分子物質(zhì)，這些水解酶的過度水解會影響EPS的組成成分、細胞表面性質(zhì)及細胞的能動性，進而影響生物膜的形成和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

3 研究胞外蛋白的關(guān)鍵技術(shù)與手段

3.1 胞外蛋白的提取及組分分析方法

由 胞外蛋白組分分析的技術(shù)路線（圖2）可知，EPS提取是實驗的第一步，EPS的提取方法直接影響胞外蛋白的提取量，選取適宜的提取方法就顯得非常重要。Higgins和Novak［24］采用 NaOH提取方法從活性污泥中提取EPS，再與其他技術(shù)結(jié)合獲得LecA凝集素等不同類型胞外蛋白。張麗麗等［25］通過比較加熱、超聲、離心和加堿等方法提取好氧顆粒污泥的EPS發(fā)現(xiàn)，用熱堿法提取的EPS中蛋白質(zhì)的含量較高。張瑞永［26］用水浴-離心、超聲波-離心、熱堿法-離心3種方法提取A. ferrooxidans的胞外蛋白，實驗結(jié)果表明水浴加熱-離心的方法所得蛋白質(zhì)的含量較高。

圖2 胞外蛋白組分分析的技術(shù)路線圖

現(xiàn)在已有很多技術(shù)手段對胞外蛋白組分進行定性或定量的分析。單獨使用某一方法或技術(shù)存在一些不足之處，但通過對這些技術(shù)的聯(lián)用，我們可以得到很多關(guān)于蛋白的含量、空間分布、官能團和二級結(jié)構(gòu)等信息。Higgins［24］從活性污泥中提取EPS，通過SDS-PAGE電泳得到不同分子量的胞外蛋白，然后用高壓液相色譜（HPLC）、蛋白質(zhì)測序儀對其進一步分析，獲得LecA凝集素等不同類型胞外蛋白。Yang等［27］用同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）與2-DLC-MS/MS聯(lián)用的方法，分析了Cronobacter sp.中與生物膜形成有關(guān)的幾種關(guān)鍵蛋白，為研究生物膜的形成機制提供了重要信息。Zeng［28］采用酶解法和加熱法提取生物浸出過程中黃銅礦表面的 EPS，并通過LC-MS等方法檢測，初步得到關(guān)于 EPS 裂解后一些蛋白質(zhì)、糖類和脂肪酸的成分及含量。

目前，在生物浸出過程中常用振蕩、水浴與離心相結(jié)合的方法提取胞外蛋白，采用雙向電泳與質(zhì)譜的聯(lián)用的技術(shù)對純培養(yǎng)條件下微生物體內(nèi)或體外的一些功能蛋白進行鑒定。由于胞外蛋白的提取與分離方法的復(fù)雜性，目前關(guān)于胞外蛋白的分離純化及鑒定還沒有統(tǒng)一的規(guī)定，選擇適宜的方法分離和純化胞外蛋白是今后生物冶金領(lǐng)域胞外蛋白研究工作的重點。

3.2 胞外蛋白功能基因的定量研究方法

胞外蛋白功能基因定量的方法有很多種，參考相關(guān)文獻，將常用于基因定量的研究方法匯總（表1），以期從中選擇合適的方法技術(shù)用于胞外蛋白功能基因的定量研究。由表1可知，不同方法有其各自的優(yōu)缺點，比較前沿的技術(shù)有核酸酶保護法、核酸依賴的擴增技術(shù)、數(shù)字PCR技術(shù)等。

在生物浸出過程中，實時熒光定量PCR技術(shù)因其操作簡便、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點，被廣泛地用于基因的定量分析。劉晶等［39］用RT-PCR技術(shù)檢測黃銅礦浸出過程中游離菌數(shù)量與吸附菌數(shù)量在不同pH條件下的動態(tài)變化，闡明游離菌與吸附菌相互促進生長，引起黃銅礦的不斷溶解。張瑞永［26］從 A. ferrooxidans中挑選10個可能與硫活化相關(guān)的基因，采用RT-PCR方法對這多個可能與硫活化相關(guān)的基因進行轉(zhuǎn)錄水平表達差異研究發(fā)現(xiàn)，在元素硫中生長的細菌的硫活化相關(guān)基因的相對表達量明顯上調(diào)，證實這些基因與元素硫的活化氧化相關(guān)聯(lián)。在此研究背景下，RT-PCR是對生物浸出中胞外蛋白功能基因進行定量研究的有效技術(shù)。但在具體實驗中要根據(jù)實驗的目的、實驗對象及其實驗室設(shè)備等選擇相應(yīng)的實驗方法。

3.3 胞外蛋白原位觀察手段及方法

國內(nèi)外主要采用多種電鏡組合技術(shù)和光譜學(xué)方法對生物膜和EPS進行進一步研究［40，41］，如激光共聚焦顯微鏡（CLSM）、三維熒光顯微鏡（3D-EEM）、原子力顯微鏡（AFM）、場發(fā)射掃描電鏡（FE-SEM）、核磁共振光譜技術(shù)（NMR）及傅立葉變換紅外光譜儀（FTIR）等。Mcswain等［41］采用 CLSM 觀察了廢水生物處理過程中厭氧顆粒的表面形態(tài)，并采用多種熒光染料對預(yù)處理后的厭氧顆粒染色。Garny等［42］將共聚焦激光掃描電鏡技術(shù)與核磁共振光譜技術(shù)結(jié)合起來，用于研究生物膜的結(jié)構(gòu)、組成和分子流動性。Zhang等［43］采用CLSM、AFM等研究了生物浸出過程中極端嗜酸古菌F. acidiphilum在礦物表面的聚集現(xiàn)象和生物膜形成情況發(fā)現(xiàn)，其首先吸附到黃鐵礦的裂縫中，并在黃鐵礦表面形成單層生物膜。Boretska等［18］研究了硫細菌Thiobacillus thioparus DSM 505在鋼鐵表面產(chǎn)生EPS的情況，并采用CLSM技術(shù)觀察4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）特異性標記核酸及PWM凝集素特異性標記多聚乙酰葡萄糖胺（PNAG）在生物腐蝕過程中的變化，研究發(fā)現(xiàn)生物膜在金屬表面建立相關(guān)的界面空間以促進生物腐蝕反應(yīng)的發(fā)生（圖3）。

在今后對生物浸出過程中胞外蛋白的研究，通過對CLSM與3D-EEM、FTIR等電鏡技術(shù)的聯(lián)用，可以較為準確、特異性地分析生物浸出過程中胞外蛋白的生成及含量變化，從而為實時定量分析胞外蛋白在細菌與礦物界面中的作用及進一步探究浸礦菌的作用機理奠定理論基礎(chǔ)。

表1 蛋白質(zhì)相關(guān)基因的定量檢測方法

4 展望

近年來，隨著對不同領(lǐng)域胞外蛋白研究的深入，關(guān)于胞外蛋白的研究越來越多，提取胞外蛋白的方法及研究胞外蛋白的技術(shù)也都趨于成熟。但在生物浸礦領(lǐng)域，對胞外多聚物關(guān)鍵組分胞外蛋白的研究存在很多困難，主要集中在以下幾個方面：

（1）目前對EPS的提取方法還沒形成統(tǒng)一的標準。這就導(dǎo)致了用不同方法提取的胞外蛋白的量及性質(zhì)各不相同，從而造成對胞外蛋白研究結(jié)果的差異；（2）EPS中的關(guān)鍵組分胞外蛋白的分離純化方法。在生物浸礦領(lǐng)域，提取浸礦菌EPS的量本身較少，從提取的EPS中分離純化出胞外蛋白的量就更少，若胞外蛋白分離純化的方法不當，會嚴重影響后面對胞外蛋白的研究，因此選擇適當?shù)陌獾鞍追蛛x純化方法也是本課題的一大挑戰(zhàn)；（3）胞外蛋白功能特性方面的研究。對蛋白質(zhì)功能特性的研究主要是通過使用現(xiàn)代儀器與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等結(jié)合的方法。但這些方法操作較為繁瑣，技術(shù)還不是很成熟，要對浸礦菌EPS中的胞外蛋白進行深入研究還需要進一步的探究。

圖3 T. thioparus DSM 505在硫磺或低碳鋼表面分泌的EPS中存在PNAG［18］

雖然對礦物表面胞外多聚物關(guān)鍵組分胞外蛋白的提取方法和技術(shù)需要完善，但通過實驗的探究、現(xiàn)代技術(shù)與方法的聯(lián)用，對浸礦菌胞外蛋白的研究存在很大的發(fā)展空間。此外，通過對浸礦菌EPS胞外蛋白關(guān)鍵組分胞外蛋白的深入研究可以深層次觀察和分析生物浸礦過程中礦物-溶液-微生物的多相界面反應(yīng)，揭示和闡明尚存爭議的生物浸礦機理，為生物浸礦工業(yè)的快速發(fā)展奠定一定的理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

The Research Progress of the Functions and Mechanism of Extracellular Proteins in Bioleaching

YU Run-lan LIU A-juan LIU Ya-nan LIU Xue-duan QIU Guan-zhou ZENG Wei-min
1. School of Minerals Processing and Bioengineering，Central South University，Changsha 410083；2. Key Laboratory of Biometallurgy，Ministry of Education，Central South University，Changsha 410083）

Mineral-microbe-solute multi phase interface is the key space for bioleaching of sulfide minerals. Microbial proteins at the interface as the key components of extracellular polymeric substances（EPS）play a key role in the biofilm formation，structure maintainance and sulfide mineral dissolution. This article reviews the developments，existing methods and their applicability for studying the extracellular proteins in EPS of metallurgical microorganisms during bioleaching，and prospects a vista of future research on the extracellular protein produced by bioleaching microorganisms. These will offer important theoretical basis for studying the structure and functional mechanisms of extracellular proteins in the bioleaching process.

bioleaching；extracellular polymeric substances；extracellular proteins；confocal laser scanning microscopy

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1197

2017-01-07

國家自然科學(xué)青年基金資助項目（31200382），國家自然科學(xué)基金面上資助項目（31470230），國家自然科學(xué)基金國際合作重大項目（51320105006），國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃資助項目（2010CB630903），中南大學(xué)貴重儀器設(shè)備開放共享基金資助（CSUZC201603）

余潤蘭，男，博士，教授，研究方向：生物冶金；E-mail：YRL715@sina.com

曾偉民，男，博士，副教授，研究方向：生物冶金；E-mail：zengweimin1024@sina.com