應(yīng)用TALENs技術(shù)定向敲除煙草eIF4E—6基因

宋琳娜 楊鵬九 萬(wàn)秀清 喬嬋 潘洪杏 郭振楠 劉俠 郭兆奎 李若

摘要 [目的]利用TALENs技術(shù)定向敲除煙草eIF4E-6基因，為提高優(yōu)質(zhì)烤煙品種K326 的馬鈴薯Y病毒（PVY）抗性提供材料。 [方法]構(gòu)建特異靶向煙草eIF4E-6基因的TALENs載體，并由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化K326煙草，用PCR和克隆測(cè)序方法篩選目的基因被成功編輯的T0代轉(zhuǎn)基因煙株。 [結(jié)果]構(gòu)建了2個(gè)特異靶向eIF4E-6基因的TALENs載體T3和T4。2個(gè)載體各獲得了約40和50株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化的K326 T0代煙株。T3載體獲得1株目的基因靶位點(diǎn)發(fā)生大片段堿基缺失的雜合突變型T0代單株、3株靶位點(diǎn)發(fā)生堿基替換的雜合突變型T0代單株。T4載體獲得5株靶位點(diǎn)發(fā)生堿基替換的雜合突變型T0代單株。 [結(jié)論]利用TALENs技術(shù)獲得的eIF4E-6基因雜合突變型K326 T0代單株為后續(xù)獲得純合基因敲除的K326煙草，并最終獲得PVY病毒抗性改良的K326煙草材料奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 煙草；PVY；K326；eIF4E-6基因；TALENs

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）04-0142-05

The Directional Knockout of eIF4E-6 Gene Using TALENs Technique

SONG Lin-na1，2，YANG Peng-jiu3，WAN Xiu-qing2，LI Ruo2* et al （1.Mudanjiang Normal University，Mudanjiang，Heilongjiang 157100；2.Mudanjiang Tobacco Science Research Institute，Mudanjiang，Heilongjiang 157011；3.Heilongjiang Tobacco Monopoly Bureau，Harbin，Heilongjiang 150010）

Abstract [Objective] To knockout eIF4E-6 gene using TALENs technique，and to provide material for improving the PVY resistance of high-class flue-cured tobacco cultivar K326.[Method] TALENs vectors that specifically targeting against eIF4E-6 gene were constructed.TALENs vectors transformed tobacco cultivar K326 mediated by Agrobacterium tumefaciens.The T0 transgenic tobacco plants of which eIF4E-6 gene were successfully edited were screened.[Result] Two TALENs vectors which specifically targeted against eIF4E-6 gene were constructed in this study.Two vectors obtained approximately 40 and 50 positively transformed T0 tobacco plants respectively.Vector T3 obtained 1 heterozygous mutant T0 plant whose targeting site of eIF4E-6 gene showed deletion of big base fragment and 3 heterozygous mutant plants whose targeting sites showed single base substitution.Vector T4 obtained 5 heterozygous mutant T0 plants whose targeting sites showed single base substitution.[Conclusion] These heterozygous mutant T0 K326 tobacco plants obtained by using TALENs technique laid foundation for obtaining homozygous gene knockout K326 tobacco and finally obtaining K326 tobacco with improved PVY resistance.

Key words Tobacco；PVY；K326；eIF4E-6 gene；TALENs

馬鈴薯Y病毒（Potato Virus Y，PVY）是近年來危害煙草生產(chǎn)的重要病害之一，嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。培育煙草PVY抗病品種是解決這一病毒性病害的有效途徑。前期研究中，從普通栽培煙草中鑒定了一個(gè)真核生物翻譯起始因子4E（Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E，eIF4E）基因家族成員eIF4E-6基因，基因功能研究結(jié)果表明其為煙草PVY病毒的感病基因?？梢?，通過基因組編輯技術(shù)敲除煙草PVY感病基因eIF4E-6來培育PVY抗病煙草成為可能。

轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALENs）技術(shù)是近年新興的基因組編輯技術(shù)，已在動(dòng)植物的基因組改造、基因功能研究等各個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。TALENs通過DNA識(shí)別模塊靶向特異性的DNA位點(diǎn)并結(jié)合，然后由其Fok Ⅰ 核酸酶切斷該位點(diǎn)的DNA雙鏈。DNA雙鏈斷裂觸發(fā)生物細(xì)胞固有的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，細(xì)胞或通過非同源末端連接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）的方式在靶位點(diǎn)DNA引入一定數(shù)目的堿基刪除、插入以實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的敲除，或在提供供體模板的情況下通過同源修復(fù)（Homology-Directed Repair，HDR）的方式對(duì)靶位點(diǎn)DNA實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變、片段或基因的替換、敲入。由于TAL蛋白的DNA特異識(shí)別單位是間隔32個(gè)恒定氨基酸殘基的二聯(lián)氨基酸，而二聯(lián)氨基酸與A、G、T、C 這4個(gè)核苷酸堿基具有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，因此利用模塊化的串聯(lián)TAL蛋白就可以靶向任意DNA序列。該研究利用TALENs技術(shù)對(duì)煙草eIF4E-6基因進(jìn)行特異性敲除，以期改良優(yōu)質(zhì)烤煙品種K326的PVY抗病性。

1 材料與方法

1.1 材料

烤煙品種K326種子由牡丹江煙草科學(xué)研究所提供。特異靶向普通煙草eIF4E-6基因的TALENs載體PTALED-LR（分別命名為T3及T4）訂購(gòu)自北京唯尚立德生物科技有限公司（圖1）。MS（Murashige & Skoog Medium）及1/2 MS植物組織培養(yǎng)基購(gòu)自Duchefa Biochemie公司（荷蘭）。潮霉素B（Hygromycin B）購(gòu)自Roche公司（瑞士）。質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒（TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0）、植物基因組DNA提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit）、DNA片段純化試劑盒（TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0）、pMD18-T載體、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（E.coli DH5α Competent Cells）、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞（Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Electro-Cells）、普通Taq酶（TaKaRa TaqTM）、Ex Taq酶（TaKaRa Ex Taq）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。該研究所用PCR引物及序列見表1，所有引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司（北京）合成。 其他試劑為化學(xué)分析純。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建靶向eIF4E-6基因的TALENs載體。

首先確定目的基因的靶序列。①根據(jù)TALENs載體靶序列選擇原則，TALENs識(shí)別臂識(shí)別堿基數(shù)量為16～18，識(shí)別位點(diǎn)第0個(gè)堿基為T或者C，間隔序列為14～18個(gè)堿基；②根據(jù)在線Blast及與中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)比對(duì)情況，確定eIF4E-6基因的特異靶位點(diǎn)2個(gè)，分別命名為T3和T4，靶位點(diǎn)序列信息見表2。根據(jù)靶位點(diǎn)序列，由北京唯尚立德生物科技有限公司合成TALENs載體，并用熒光素酶（Luciferase）單鏈退火（Single Strand Annealing，SSA）報(bào)告基因方法檢測(cè)TALENs載體的體外DNA剪切活性。

1.2.2 TALENs載體遺傳轉(zhuǎn)化K326煙草。

首先將TALENs載體質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，具體步驟如下：將1 μg質(zhì)粒放入解凍后的農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min；將混合液移入電擊杯中，2 500 V/6 ms進(jìn)行電擊；然后加入500 μL SOC培養(yǎng)基，28 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)60 min；取150 μL菌液涂布在含卡那霉素的LB平板上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d至單菌落出現(xiàn)。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。菌落PCR 反應(yīng)體系為總體積20 μL，其中10×PCR Buffer 2 μL，dNTPs （各2.5 mmol/L） 1.6 μL，無(wú)菌水14.1 μL，上下游引物（TEST-F和TEST-R各10 μmol/L）各0.5 μL，r-Taq酶0.3 μL，菌液1 μL。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min。PCR反應(yīng)完成后進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增載體潮霉素B抗性標(biāo)簽的PCR產(chǎn)物大小為801 bp。

其次制備K326煙草無(wú)菌苗，具體步驟如下：將K326煙草種子放入滅菌的1.5 mL離心管中，用0.2%升汞消毒5 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，按8粒/瓶播種于1/2 MS固體培養(yǎng)基 （MS大量元素減半+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L，pH=5.8）上，培養(yǎng)條件為25 ℃，光照16 h/d。

最后采用葉盤法轉(zhuǎn)化K326煙草，具體步驟如下：待無(wú)菌苗長(zhǎng)出4片葉子后，剪成約5 mm × 5 mm的小塊，用MS固體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)2 d。擴(kuò)繁轉(zhuǎn)化成功的菌液，離心后用1/2 MS液體培養(yǎng)基重懸菌體。用重懸的菌液侵染煙草葉盤5 min，然后將被侵染的煙草葉盤置于含有2 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的MS固體培養(yǎng)基中，23 ℃暗培養(yǎng)2 d。共培養(yǎng)后，在培養(yǎng)基中添加500 mg/L頭孢曲松鈉和10 mg/L潮霉素B進(jìn)行篩選，誘導(dǎo)抗性愈傷組織的產(chǎn)生。待不定芽長(zhǎng)到1～2 cm時(shí)，切下不定芽并轉(zhuǎn)移到含250 mg/L頭孢曲松鈉和10 mg/L潮霉素B的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)后獲得T0代K326煙株。

1.2.3 篩選T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因K326煙株。

分別取T0代K326煙株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢熤牾r嫩葉片，用植物基因組DNA提取試劑盒提取煙草葉片DNA，以此為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為10 × PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs （各2.5 mmol/L） 2 μL，上下游引物（hygromycinB-F2和hygromycinB-R2各10 μmol/L）各1 μL，普通Taq酶0.25 μL，模板DNA 1 μL，加無(wú)菌水至25 μL。PCR擴(kuò)增條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增潮霉素B載體抗性標(biāo)簽，預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為968 bp，在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。

1.2.4 T0代K326煙株eIF4E-6基因突變檢測(cè)。以T0代K326煙株葉片DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)突變。PCR反應(yīng)體系為10 × Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTPs （各2.5 mmol/L） 2 μL，上下游引物（eIF4E6TALEN4&5-F2和eIF4E6TALEN4&5-R2各10 μmol/L）各1 μL，Ex Taq酶0.25 μL，無(wú)菌水17.25 μL，模板DNA 1 μL。 PCR 擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR反應(yīng)完成后取少量PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用DNA片段純化試劑盒純化剩余PCR產(chǎn)物，然后將純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD-18T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選每板挑取10個(gè)陽(yáng)性菌落，搖菌后送上海立菲生物技術(shù)有限公司（北京）測(cè)序。用DNAMAN6、DNASTAR7等序列分析軟件分析T0代K326煙株eIF4E-6基因在TALENs靶位點(diǎn)處產(chǎn)生DNA序列和相應(yīng)氨基酸序列改變的情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 TALENs載體體外DNA剪切活性檢測(cè)

采用Luciferase-SSA報(bào)告基因方法對(duì)構(gòu)建的2對(duì)TALENs載體T3和T4進(jìn)行體外DNA剪切活性檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。相對(duì)于陰性對(duì)照，T3及T4載體的相對(duì)熒光強(qiáng)度分別達(dá)3.7倍和5.4倍，說明2個(gè)載體對(duì)相應(yīng)靶位點(diǎn)DNA均具體外剪切活性，可以用于體內(nèi)試驗(yàn)。

2.2 K326煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

TALENs載體電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，菌液PCR檢測(cè)載體上的潮霉素B抗性標(biāo)簽，結(jié)果如圖3所示。2個(gè)載體轉(zhuǎn)化的菌落均擴(kuò)增出約800 bp大小的條帶，與預(yù)期801 bp大小PCR產(chǎn)物相符，說明載體已成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌。

2.3 T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因K326煙株的篩選 經(jīng)潮霉素B抗性篩選，最終2個(gè)TALENs載體各獲得約50和80株T0代再生K326煙株。提取再生煙株及非轉(zhuǎn)基因K326煙草葉片DNA，PCR檢測(cè)潮霉素B抗性標(biāo)簽以篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙株，代表性結(jié)果如圖4所示。大部分T0代再生煙株均能擴(kuò)增出約1 kb大小的特異性條帶，與預(yù)期的PCR產(chǎn)物大小968 bp一致，說明這些煙株已被TALENs載體成功轉(zhuǎn)化。最終，2個(gè)TALENs載體各獲得約40和50株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙株。

2.4 T0代轉(zhuǎn)基因K326煙株eIF4E-6基因突變檢測(cè)

在eIF4E-6基因TALENs靶位點(diǎn)兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物（eIF4E6TALEN4&5-F2和eIF4E6TALEN4&5-R2），PCR特異擴(kuò)增T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因K326煙株及非轉(zhuǎn)基因K326煙草目標(biāo)基因片段，代表性結(jié)果如圖5所示。作為陰性對(duì)照的非轉(zhuǎn)基因K326煙草擴(kuò)增出單一的約200 bp大小的PCR產(chǎn)物，與預(yù)期PCR產(chǎn)物大小222 bp相符。后續(xù)對(duì)該產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，產(chǎn)物序列與eIF4E-6基因序列完全一致。這說明該對(duì)引物可用于eIF4E-6基因靶位點(diǎn)序列的測(cè)定。但是，絕大部分2個(gè)載體轉(zhuǎn)化的T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因K326煙株得到的該基因片段的大小與陰性對(duì)照一致。這預(yù)示著，這些T0代轉(zhuǎn)基因K326煙株的eIF4E-6基因在TALENs靶位點(diǎn)處可能未出現(xiàn)大片段的缺失或插入。

將擴(kuò)增eIF4E-6基因靶位點(diǎn)序列的PCR產(chǎn)物連入T載體，進(jìn)行克隆測(cè)序，并與非轉(zhuǎn)基因K326煙草該片段序列比對(duì)，序列分析結(jié)果如圖6所示。由圖6A可知，T3轉(zhuǎn)基因煙株T3-26 eIF4E-6基因由靶位點(diǎn)處開始出現(xiàn)49 bp的DNA片段缺失；單株T3-38、45、46則分別在TALENs載體Fok Ⅰ 核酸酶剪切位點(diǎn)出現(xiàn)單個(gè)堿基替換。由圖6B可知，這些核酸序列的突變導(dǎo)致這些單株eIF4E-6基因翻譯蛋白分別出現(xiàn)了蛋白翻譯提前終止或單氨基酸殘基的替換。由圖6C、6D可知，T0代T4轉(zhuǎn)基因煙株有5個(gè)單株T4-14、15、21、34、44在靶位點(diǎn)出現(xiàn)單堿基替換，導(dǎo)致靶位點(diǎn)處單氨基酸殘基的替換。需要說明的是，這些突變均為雜合型突變，即每個(gè)單株克隆測(cè)序序列中仍有與野生型eIF4E-6基因完全一致的序列，而實(shí)際上一致的序列占多數(shù)。對(duì)部分T0代單株P(guān)CR產(chǎn)物直接測(cè)序的結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，產(chǎn)物中占多數(shù)的未發(fā)生突變的eIF4E-6基因片段序列掩蓋了占少數(shù)的突變序列。最終，這些eIF4E-6基因雜合突變的T0代轉(zhuǎn)基因K326煙株為后續(xù)基因純合突變后代的獲得提供了材料。

3 結(jié)論與討論

PVY病毒是危害煙葉生產(chǎn)的重要病害，長(zhǎng)年對(duì)我國(guó)煙葉生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。PVY病毒是馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的典型成員。近年發(fā)現(xiàn)，eIF4E蛋白是植物抗/感Potyvirus病毒的決定因子[2]。例如辣椒中抗PVY和煙草蝕紋病毒（Tobacco Etch Virus，TEV）的pvr2基因[3]，擬南芥中抗蕪菁黃葉病毒（Turnip Mosaic Virus，TuMV）和生菜花葉病毒（Lettuce Mosaic Virus，LMV）的lsp1基因[4，5]，生菜中抗LMV的mo1基因[6]等，不同植物物種中的所有這些Potyvirus病毒抗性相關(guān)基因都最終被鑒定為eIF4E基因家族成員?；诖耍捌谠谄胀ㄔ耘酂煵葜姓业?個(gè)eIF4E-6基因，通過基因功能研究試驗(yàn)鑒定其為PVY感病基因。目前煙草抗PVY育種中采用的主要抗源是va基因[7]，它是1個(gè)控制煙草PVY抗性的單隱性抗病基因。在法國(guó)，有77.5%的煙草栽培品種含有此抗源[8]。2014年Julio等[9]確定普通煙草中的eIF4E基因家族中一成員（GenBank序列號(hào)KF155696），即對(duì)應(yīng)va基因。經(jīng)序列比對(duì)，該研究中的eIF4E-6基因與Julio等報(bào)道的KF155696序列完全一致。基于以上研究，通過目前的基因組編輯技術(shù)可以定向敲除普通煙草中PVY感病基因eIF4E-6，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)煙草栽培品種的抗性改良。

近年來，基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)及迅速發(fā)展為實(shí)現(xiàn)作物的精準(zhǔn)遺傳改良提供了強(qiáng)大技術(shù)支撐。最初的基因組編輯工具鋅指核酸酶（Zinc-Finger Nucleases），因其在基因組作用靶點(diǎn)范圍、基因編輯效率、組裝技術(shù)難度、脫靶概率及突變遺傳復(fù)雜性等方面的局限，而逐漸被后續(xù)出現(xiàn)的TALENs及CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat-associated Protein 9）技術(shù)取代。TALENs技術(shù)近年來已成功應(yīng)用于酵母、蛔蟲、大鼠、斑馬魚、人胚胎干細(xì)胞等眾多生物的靶向基因組編輯[10]，其中也包括水稻、擬南芥、煙草等多種植物物種[11]。該研究利用這一技術(shù)通過定向敲除煙草PVY感病基因來改良煙草的抗病性。由于該研究的目標(biāo)基因eIF4E-6屬于1個(gè)包含多達(dá)12個(gè)成員的基因家族，且成員間編碼序列一致度高，所以最終僅選擇2個(gè)靶點(diǎn)。依據(jù)靶點(diǎn)序列構(gòu)建的TALENs載體在導(dǎo)入煙草前對(duì)其體外DNA剪切活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示T4載體的活性高于T3。但最終T0代轉(zhuǎn)化煙草的目標(biāo)基因突變檢測(cè)結(jié)果

表明T3

載體對(duì)目標(biāo)基因的編輯效果要略優(yōu)于T4。這說明，TALENs載體的體外活性可能并不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)其在植物體內(nèi)的基因組編輯效果。當(dāng)然，由于該研究2個(gè)載體基因編輯效率較低，且獲得的T0代煙株數(shù)量不足夠大，這一結(jié)果需要更大數(shù)量后代材料的驗(yàn)證。從2個(gè)載體獲得的T0代煙株目的基因的整體突變情況來看，突變均為雜合型且多數(shù)為單堿基替換，2個(gè)載體基因編輯效率偏低。這可能由于該研究所用的早期的（2013年）TALENs載體基因編輯效率不高[11]，也可能受到該研究目標(biāo)基因與其他非靶標(biāo)基因同源性的限制。

綜上所述，該研究利用TALENs基因組編輯技術(shù)獲得了eIF4E-6基因雜合突變型的T0代K326煙株，為將來獲得純合基因敲除的PVY抗性改良的煙草品種提供了材料。

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