苦瓜輻照花粉授粉離體胚挽救的研究

陳小鳳 黃如葵 馮誠誠 黃熊娟 梁家作 黃玉輝 劉杏連（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣西南寧 530007）

苦瓜輻照花粉授粉離體胚挽救的研究

陳小鳳 黃如葵*馮誠誠 黃熊娟 梁家作 黃玉輝 劉杏連
（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣西南寧 530007）

為提高輻照花粉授粉不同發(fā)育階段胚的萌發(fā)，以劑量為150 Gy的60Co-γ射線進行輻照花粉授粉，利用胚挽救技術(shù)進行苦瓜離體胚培養(yǎng)，從培養(yǎng)基、接種方式、光暗處理等方面進行優(yōu)化研究。結(jié)果表明，在不同類型苦瓜中，整粒種子經(jīng)暗處理10 d后，切掉3/4并保留含胚切塊，在MS基本培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)20 d后，可使胚挽救時期提前到授粉后5 d，使授粉后9 d的胚萌發(fā)出苗率達9.6%以上，并免去了剝離種皮取胚的步驟，簡化了苦瓜離體胚挽救技術(shù)。

苦瓜；輻照花粉；胚挽救

與栽培種不同屬或不同種的野生或近野生資源，往往具有栽培種沒有的抗病蟲性、抗逆性，可通過轉(zhuǎn)育其相關(guān)基因來改良栽培品種，但這些資源與常規(guī)栽培種進行雜交，往往產(chǎn)生胚敗育的現(xiàn)象，不能成功獲得雜交種，需要在胚敗育前進行挽救。單倍體加倍后的雙單倍體（DH）為純合體，只有1種基因型和表現(xiàn)型，優(yōu)良的純合系后代可直接作為品種或雜交親本應(yīng)用于育種，縮短育種年限，但單倍體自發(fā)產(chǎn)生的頻率極低，用輻射過的花粉授粉來誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，也需要在胚敗育前進行挽救。離體胚挽救是作物新種質(zhì)創(chuàng)制的重要手段之一，已廣泛運用于雜交育種（崔光芬 等，2014；陳昌文 等，2015）、遠緣雜交育種（扈新民 等，2009；喬海云 等，2009）、倍性雜交育種（宋健坤 等，2005；劉可慧等，2010）等研究中。在葫蘆科蔬菜方面，胚挽救技術(shù)主要應(yīng)用于單倍體育種（王麗莉和秦智偉，2007）。通過輻照花粉授粉結(jié)合胚挽救技術(shù)獲得單倍體研究始于甜瓜（Sauton & Dumas，1987），多見于黃瓜研究（雷春 等，2006；張永兵 等，2006；蘇芃 等，2015）。筆者（陳小鳳 等，2011）曾采用輻照花粉授粉結(jié)合胚挽救技術(shù)，探討胚挽救時期對成苗率及輻照劑量對形成不同類型胚的影響，以期獲得單倍體植株，但沒有成功，原因是低發(fā)育水平的胚剛好肉眼可見或者根本看不見，剝離種皮取胚操作困難，易傷到胚，受傷的胚易愈傷化，萌發(fā)困難，也增加了污染率。為了提高出苗率，簡化培養(yǎng)技術(shù)，在前期的研究基礎(chǔ)上，利用劑量為150 Gy的60Co-γ射線進行花粉輻照授粉結(jié)合胚挽救技術(shù)進行苦瓜離體胚挽救，從培養(yǎng)基篩選、接種方式、光暗處理等方面進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，以促進低發(fā)育階段胚萌發(fā)，提高出苗率，使胚挽救時期提前，為獲得苦瓜單倍體提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為自交系MC6、MC8、MC9、MC39-4、MC72、MC143，由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。試驗材料在瓜形、瓜色、瓜瘤數(shù)目和形狀、瓜長及瓜橫徑等特征特性方面各不相同，幾乎包括了苦瓜的所有類型，在苦瓜資源中具有一定的代表性，其基本性狀見表1。

1.2 試驗方法

2014年9月10日、2015年9月16日15：00左右采集次日開放的雄花，裝入防水袋中，立即拿到廣西輻照中心進行60Co-γ射線輻照，輻照劑量為150 Gy。同時把要授粉的雌花套袋。次日早上用輻照過的花粉授粉并作好標記，繼續(xù)套袋隔離至坐果。同一材料的雄花授同一材料的雌花。

不同培養(yǎng)基的比較試驗：取授粉后9 d果實的種子，切掉3/4不含胚的種皮，保留種子含胚切塊并接種到MS及MS+IBA 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基中，一直在光下培養(yǎng)，溫度（26±2）℃，光強2 000 lx，光照時間8 h·d-1。培養(yǎng)7 d以上時，每天觀察出苗情況，并統(tǒng)計出苗率和正常苗比率；每份材料每處理均為60粒種子，3次重復(fù)，每重復(fù)20粒種子。

出苗率=出苗數(shù)／接種種子含胚切塊×100%

正常苗比率=正常苗數(shù)／接種種子含胚切塊×100%

不同接種方式的比較試驗：取授粉后9 d果實的種子，整粒種子經(jīng)暗處理（不開光源且用黑色不透光的塑料布遮光）10 d后，再切掉3/4不含胚的種皮，接種含胚切塊于MS培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計出苗率，以接種整粒種子為對照。每份材料每處理均為60粒種子，3次重復(fù)，每重復(fù)20粒種子。

不同胚挽救時期的比較試驗：取授粉后4、5、6、7、8 d果實的種子，按以上暗處理的方法，統(tǒng)計出苗率。每處理均為24粒種子，3次重復(fù)，每重復(fù)8粒種子。

胚挽救的大數(shù)據(jù)試驗：取輻照花粉授粉后9 d果實的種子，暗處理后接種含胚切塊，除了MC39-4外，其他材料的接種數(shù)目都在120塊以上，不設(shè)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理及計算

利用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)作圖分析，用DPS 3.01軟件進行新復(fù)極差方差分析。

表1 試驗材料的基本性狀

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對胚萌發(fā)出苗率的影響

表2顯示，把種子含胚切塊接種到MS及MS+IBA 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基中，不經(jīng)暗處理直接在光下培養(yǎng)，出苗率都很低。在MS培養(yǎng)基中，試驗材料有1.7%～6.7%的出苗率，但只有MC6獲得1株正常苗；在MS+IBA 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基中，MC8、MC9、MC143各有1個胚萌發(fā)出苗，但最終都未獲得正常植株。在2種培養(yǎng)基中，大部分種子含胚切塊都愈傷化，最終褐化死亡，沒有胚萌發(fā)出苗（圖1）。說明要提高幼胚萌發(fā)出苗，關(guān)鍵在于阻止嫩種子切塊愈傷的形成。

表2 不同培養(yǎng)基對胚萌發(fā)出苗率的影響

圖1 不經(jīng)暗處理的種子含胚切塊的培養(yǎng)效果A和B分別為種子含胚切塊在MS和MS+IBA中愈傷化情形，C和D分別為種子含胚切塊在MS和MS+IBA中愈傷褐化死亡情形。彩色圖版見《中國蔬菜》網(wǎng)站：www.cnveg.org，下圖同。

2.2 不同接種方式對胚萌發(fā)出苗率的影響

表3顯示，暗處理10 d后在MS培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)，以整粒種子作為培養(yǎng)對象的出苗率為0；接種含胚切塊并在光下培養(yǎng)，各材料的出苗率都在21%以上，MC8的出苗率最低，為21.7%；MC72的出苗率最高，達38.3%。說明暗處理后在光下接種含胚部分，能有效促進離體胚的萌發(fā)出苗（圖2）。

表3 不同接種方式對胚萌發(fā)出苗率的影響

圖2 暗處理后整粒種子與種子含胚切塊的培養(yǎng)效果A：暗處理后轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)；B：整粒種子褐化死亡；C和D：種子含胚切塊培養(yǎng)后萌發(fā)出苗。

2.3 不同胚挽救時期對胚萌發(fā)出苗率的影響

圖3顯示，隨著胚挽救時期的延后，胚萌發(fā)出苗的比率也不斷提高。當胚挽救時期提前到授粉后4 d時，僅MC6、MC9、MC143有1個胚萌發(fā)出苗，出苗率為4.1%；MC8、MC39-4、MC72沒有胚萌發(fā)出苗。當胚挽救時期提前到授粉后5 d時，MC9只有1個胚萌發(fā)出苗，出苗率最低；MC6有4個胚萌發(fā)出苗，出苗率最高，為16.7%。到授粉后7 d以上時，供試材料的出苗率都在25%以上，說明經(jīng)暗處理后再接種含胚切塊，能使胚的挽救時期提前到授粉后5 d，并且胚萌發(fā)出苗率與胚的成熟度呈正相關(guān)。

2.4 苦瓜胚挽救的大數(shù)據(jù)試驗結(jié)果

輻照花粉引起苦瓜授粉障礙，造成同一果實中胚的發(fā)育進程不一致（陳小鳳 等，2011），由于重復(fù)間的出苗率相差較大，無法對重復(fù)之間數(shù)據(jù)進行多重比較分析。因此，要獲得比較可靠的參考數(shù)據(jù)，大數(shù)據(jù)是有說服力的方法之一。表4顯示，MC143接種278塊種子含胚切塊，出苗率最高，為22.3%；MC72接種322塊種子含胚切塊，出苗率最低，為9.6%；而接種種子含胚切塊最多的MC9，共接種704塊，出苗率為10.5%。表4總體的數(shù)據(jù)表明，在不同類型苦瓜中，利用本試驗方法培養(yǎng)授粉后9 d果實種子的含胚切塊，能使胚的出苗率達9.6%以上；平均初次萌發(fā)即獲得正常苗的比率為6.8%。部分初次萌發(fā)不正常的畸形苗經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后能轉(zhuǎn)化為正常苗，但仍有相當比例的苗未能長成正常苗，正常苗在MS培養(yǎng)基中就能正常生根（圖4）。

圖3 不同胚挽救時期對胚萌發(fā)出苗率的影響

圖4 畸形苗類型及正常苗繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)效果A：畸形苗類型；B：萌發(fā)苗繼代培養(yǎng)；C和D：正常苗生根培養(yǎng)。

表4 苦瓜胚挽救的大數(shù)據(jù)試驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

苦瓜在進行外植體培養(yǎng)時，易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷，而愈傷難以分化不定芽。唐懿（2011）在進行花藥培養(yǎng)時，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率可達79.42%，結(jié)果僅獲得1個不定芽和1個3 cm左右的豎狀突起，多次繼代后褐化死亡，沒有成功獲得再生植株。武鵬等（2012）以子葉、上胚軸、下胚軸為外植體進行培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)率達80%以上，同樣存在愈傷組織難以分化不定芽的問題。在本試驗中，授粉后4～8 d的種子含胚切塊也屬幼嫩組織，在進行離體培養(yǎng)時也一樣產(chǎn)生愈傷現(xiàn)象，影響胚萌發(fā)出苗，說明苦瓜組織培養(yǎng)很容易產(chǎn)生愈傷，即使是在無激素的MS基本培養(yǎng)基中也一樣（圖1）。因此，本試驗沒有就更多培養(yǎng)基成分組合對胚培養(yǎng)的影響進行進一步優(yōu)化，而直接在MS基本培養(yǎng)基中完成本試驗。

在作物離體培養(yǎng)中，培養(yǎng)初期需要先經(jīng)過一段時間的黑暗處理，目的是提高愈傷組織誘導(dǎo)率和降低外植體褐化率（孫源蔚 等，2011；韓瑞超，2012）。本試驗的外植體比較特殊，是幼嫩種子，黑暗處理的目的是模擬種子在果實體內(nèi)的生長環(huán)境，但由于種皮的阻礙，讓幼胚無法吸收到培養(yǎng)基中的養(yǎng)分，培養(yǎng)早期胚發(fā)育所需營養(yǎng)來自種子內(nèi)貯存的養(yǎng)分，當養(yǎng)分消耗完時，種子不含胚部分變得干癟、中空而不含水分，此時切去這部分種子，保留含胚部分再放到光下培養(yǎng)，可以減少愈傷形成，提高胚萌發(fā)出苗率（圖2-C和2-D）。而整粒種子培養(yǎng)沒有胚萌發(fā)出苗，可能是幼胚沒有能力突破種皮而萌發(fā)成苗，種皮也阻礙了胚吸收養(yǎng)分從而導(dǎo)致胚停止發(fā)育（圖2-B）。本試驗的方法能使胚挽救時期提前到授粉后5 d，使授粉后9 d的胚萌發(fā)出苗率達9.6%以上。

苦瓜不似黃瓜、南瓜、西葫蘆、甜瓜等葫蘆科作物，它們1個子房含有的胚珠就達400粒以上，只要授粉幾個瓜就可獲得大量的種子進行離體胚培養(yǎng)。不過這些作物單倍體的獲得比率也非常低，如蘇芃等（2015）在進行黃瓜單倍體研究時，單倍體誘導(dǎo)率只有0.26%～0.54%。苦瓜子房內(nèi)含有的胚珠只有幾十個，要獲得同樣多的種子進行離體胚培養(yǎng)，得多授幾十倍甚至上百倍的果實才會有同樣的機會去增加單倍體的獲得比率。

據(jù)本試驗觀察發(fā)現(xiàn)，苦瓜胚發(fā)育為肉眼可見時，有2個變化明顯的時期，分別為授粉后8 d和授粉后10 d，授粉后8 d的胚剛好肉眼可見，到授粉后9 d時的變化不大，但到授粉后10 d時，大部分胚已長為種殼的一半大小，授粉后11 d以上，胚的大小已與種殼一樣大，成為飽滿胚（圖5）。因此，本試驗中使授粉后5 d的胚發(fā)育成苗，對組培中易愈傷的苦瓜來說是非常不易的。

圖5 不同授粉天數(shù)后的苦瓜種子及離體胚A：授粉后3 d的種子；B：授粉后5 d的種子；C：授粉后6 d的種子；D：授粉后8 d的種子及離體胚（箭頭所指，下同）；E：授粉后9 d的種子及離體胚；F：授粉后10 d的種子及離體胚；G：授粉后11 d的種子及離體胚；H：授粉后12 d的種子及離體胚。

綜上所述，結(jié)合苦瓜授粉胚的發(fā)育進程看，雖然本試驗未獲得單倍體植株，但本試驗的結(jié)果使胚挽救時期提前到授粉后5 d，以授粉后9 d胚挽救為例，能使胚萌發(fā)出苗率達9.6%以上，并免去了剝離種皮取胚的步驟，簡化了胚培養(yǎng)的方法。且6個供試材料為不同類型苦瓜，在苦瓜中具有一定的代表性。因此，本試驗結(jié)果可為獲得苦瓜單倍體提供技術(shù)支撐。

陳昌文，朱更瑞，王力榮，方偉超，曹珂，王新衛(wèi)，馮義彬．2015．蟠桃新品種‘中蟠桃 11 號’．園藝學(xué)報，42（10）：2089-2090．

陳小鳳，黃如葵，黃玉輝，劉杏連，梁家作，周生茂．2011．輻照花粉授粉及胚挽救時期對苦瓜離體雌核發(fā)育的影響．北方園藝，（16）：152-154．

崔光芬，王祥寧，蔣亞蓮，吳麗芳，賈文杰，段青，王繼華．2014．OT百合新品種‘金門’．園藝學(xué)報，41（7）：1517-1518．

韓瑞超．2012．桂花幼胚培養(yǎng)與愈傷組織誘導(dǎo)及分化〔碩士論文〕．泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)．

扈新民，李錫香，梁燕，方智遠，沈鏑，邱楊．2009．甘藍與蘿卜屬間雜交及其胚挽救技術(shù)優(yōu)化．中國蔬菜，（10）：7-12．

雷春，陳勁楓，錢春桃．2006．輻照花粉授粉培育單倍體黃瓜研究．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，39（7）：1428-1436．

劉可慧，于方明，張秋明，易干軍．2010．應(yīng)用胚挽救技術(shù)獲得三倍體柑橘植株．廣西植物，30（2）：246-249．

喬海云，李菲，張淑江，章時蕃，孫日飛．2009．大白菜與諸葛菜屬間雜交及GISH鑒定．園藝學(xué)報，36（10）：1473-1478．

宋健坤，郭文武，伊華林，劉繼紅，陳春麗，鄧秀新．2005．以異源四倍體體細胞雜種為父本與二倍體雜交創(chuàng)造柑橘三倍體的研究．園藝學(xué)報，32（4）：594-598．

蘇芃，Nguyen H H，管葦，崔利，陳勁楓．2015．輻射花粉授粉技術(shù)誘導(dǎo)黃瓜單倍體．江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，31（1）：134-137．

孫源蔚，李果果，姚延興，李國懷．2011．中國李Nubiana 胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生．果樹學(xué)報，28（1）：42-45．

唐懿．2011．苦瓜花藥培養(yǎng)及培養(yǎng)過程中內(nèi)源激素研究〔博士論文〕．成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)．

王麗莉，秦智偉．2007．葫蘆科植物單倍體離體誘導(dǎo)研究進展．中國農(nóng)學(xué)通報，（23）：85-89．

武鵬，方鋒學(xué)，黃如葵，黃熊娟，陳小鳳．2012．苦瓜離體再生體系建立的研究．北方園藝，（2）：124-126．

張永兵，陳勁楓，伊鴻平，雷春，吳明珠．2006．輻射花粉授粉誘導(dǎo)甜瓜單倍體．果樹學(xué)報，23（6）：892-895．

Sauton A R，Dumas D V．1987．Obtention de plants haploids chezs le melon（Cucumis melon L．）par gynogeneses induite parde pollen irradiate．Agronomic，7：141-148．

Studies on Embryo Rescue of Irradiated Pollen Pollination of Bitter Gourd in Vitro

CHEN Xiao-feng，HUANG Ru-kui*，F(xiàn)ENG Cheng-cheng，HUANG Xiong-juan，LIANG Jia-zuo，HUANG Yu-hui，LIU Xing-lian
（Vegetable Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，Guangxi，China）

In order to improve the germination of different development stage of embryo of irradiated pollen pollination，this study took 150 Gy dose of60Co-γ to carry out irradiated pollen pollination，and took bitter gourd embryos cultivation in vitro by using embryo rescue technique，which were optimized from the culture medium，inoculation method，light or dark treatments．The results showed that among different types of bitter gourd，treated the whole seed under dark for 10 days and then cut off 3/4 and retained the part with embryo slices，put this part in MS culture medium and under light for 20 days．The embryo rescue stage could be advanced to 5 days after pollination，and the germination rate could reach 9.6% 9 days after pollination．The step of stripping seed peel and isolating embryo from seed was spared．Thus，the embryo rescue technique of bitter gourd in vitro was simplified by this method．

Bitter gourd（Momordica charantia L．）；Irradiated pollen；Embryo rescue

陳小鳳，女，碩士，副研究員，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：798581549@qq.com

*通訊作者（Corresponding author）：黃如葵，女，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種及栽培研究，E-mail：rkhuang@ gxaas.net

2016-12-23；接受日期：2017-05-15

廣西自然科學(xué)基金項目（2014GXNSFAA118091，2015GXNSFBA139079），廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項（2015YT66），現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS-25）