膿毒癥氨基酸代謝變化及檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

熊梓宏，張國(guó)英，任興瓊，張 寧，周 芹，盧 賓

(成都市婦女兒童中心醫(yī)院兒童重癥醫(yī)學(xué)科，成都 610091)

膿毒癥是人類(lèi)死亡的主要原因，也是世界范圍內(nèi)危重癥救治的難點(diǎn)之一。膿毒癥患者機(jī)體出現(xiàn)失控的炎癥反應(yīng)和自身免疫功能紊亂，常伴隨食欲減退或無(wú)法進(jìn)食，機(jī)體蛋白質(zhì)消耗增加且合成不足，導(dǎo)致繼發(fā)營(yíng)養(yǎng)不良和免疫功能紊亂的概率大大增加[1-2]。目前，在膿毒癥患者集束化治療中，除強(qiáng)調(diào)積極抗感染、機(jī)械通氣和臟器支持治療外，補(bǔ)充適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以促進(jìn)患者器官保護(hù)和免疫功能改善，縮短膿毒癥患者的住院治療時(shí)間，降低死亡率，故營(yíng)養(yǎng)支持治療得到更多關(guān)注，成為膿毒癥治療的研究新熱點(diǎn)[3]。氨基酸作為人體重要的必需營(yíng)養(yǎng)元素，具有其特有的生理、生化、免疫等功能，氨基酸代謝紊亂的嚴(yán)重程度可直接影響膿毒癥患者的預(yù)后，因此，研究膿毒癥時(shí)重要氨基酸的代謝變化，可指導(dǎo)臨床醫(yī)師選擇合適的膿毒癥炎癥急性期靜脈營(yíng)養(yǎng)支持方案以及氨基酸制劑，為膿毒癥患者提供更精準(zhǔn)有效的營(yíng)養(yǎng)治療方案，及時(shí)糾正全身和肌肉蛋白質(zhì)的損失[4]。現(xiàn)對(duì)膿毒癥患者機(jī)體重要氨基酸的代謝變化及氨基酸檢測(cè)方法的研究進(jìn)展予以綜述。

1 膿毒癥患者機(jī)體中重要氨基酸的代謝變化

1.1谷氨酰胺 隨著膿毒癥的進(jìn)展，患者常出現(xiàn)免疫功能紊亂，機(jī)體產(chǎn)生大量的氧自由基，免疫功能下降和過(guò)氧化均可引發(fā)機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)并誘發(fā)器官功能障礙。谷氨酰胺是人體含量最豐富的條件必需氨基酸，為淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞的分化增殖提供足夠的能源物質(zhì)，可改善患者淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞生成數(shù)量以及單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的識(shí)別、吞噬和殺菌功能，并促進(jìn)機(jī)體內(nèi)抗炎癥細(xì)胞因子(如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素)的合成等，從而改善患者的免疫功能[5]。正常人體內(nèi)存在很多重要的抗氧化物質(zhì)(如谷胱甘肽)，具有保護(hù)機(jī)體多種蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)完整以及維持其正常生理功能的作用。谷氨酰胺是參與谷胱甘肽合成的重要物質(zhì)。有研究證實(shí)，嚴(yán)重感染等所致的機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)下，患者對(duì)谷氨酰胺需求量明顯增加，谷氨酰胺攝入不足，使血液及組織內(nèi)谷氨酰胺水平降低，機(jī)體谷氨酰胺池的水平越低，患者膿毒癥危重程度和病死率越高，兩者具有相關(guān)性[6]。此外，感染細(xì)菌和毒素的腸道黏膜細(xì)胞容易出現(xiàn)損傷、破壞，導(dǎo)致腸黏膜吸收和代謝功能減弱，腸道屏障功能破壞，造成細(xì)菌和毒素移位，引發(fā)內(nèi)源性感染，使膿毒癥患者病情加重，增加治療難度[7]。谷氨酰胺是參與腸道黏膜細(xì)胞代謝的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可促進(jìn)腸黏膜修復(fù)，維持腸道屏障功能穩(wěn)定[8]。為了維護(hù)膿毒癥患者(特別對(duì)于合并嚴(yán)重?zé)齻颊?腸道黏膜屏障的完整性、改善免疫狀況、維持臟器功能等，適當(dāng)添加谷氨酰胺的腸外營(yíng)養(yǎng)液將有助于促進(jìn)膿毒癥患者的恢復(fù)[9]。但目前是否對(duì)所有膿毒癥患者添加谷氨酰胺的腸外營(yíng)養(yǎng)液仍存在爭(zhēng)議。部分研究認(rèn)為，添加谷氨酰胺的腸外營(yíng)養(yǎng)液治療的患者總病死率顯著升高[10]。

1.2精氨酸 精氨酸作為重要的條件必需氨基酸，是機(jī)體鳥(niǎo)氨酸循環(huán)的重要組成部分，對(duì)維持機(jī)體氮平衡具有不可替代的作用。精氨酸對(duì)巨噬細(xì)胞的功能有重要影響，可以提高巨噬細(xì)胞的抗原呈遞能力，改善免疫功能，刺激生長(zhǎng)激素增加，產(chǎn)生一氧化氮和氨氣，是體內(nèi)多種小分子復(fù)合物的前體，可促進(jìn)膠原纖維合成，加速傷口修復(fù)，具有免疫營(yíng)養(yǎng)作用，對(duì)免疫功能和腫瘤生長(zhǎng)具有雙重調(diào)節(jié)作用[11-13]。膿毒癥患者在應(yīng)激高分解狀態(tài)下，精氨酸利用率下降，進(jìn)而使體內(nèi)一氧化氮合酶減少，免疫功能紊亂加重。有研究發(fā)現(xiàn)，參與免疫應(yīng)答的相關(guān)細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等)在膿毒癥進(jìn)展過(guò)程中出現(xiàn)明顯的數(shù)量減少和功能減退，導(dǎo)致機(jī)體清除病原微生物的能力明顯下降，甚至引發(fā)膿毒癥患者的不良結(jié)局[14]。因此，給予膿毒癥患者積極抗感染治療的同時(shí)，針對(duì)免疫功能障礙的免疫調(diào)理治療成為膿毒癥患者綜合治療中必不可少的部分。但精氨酸補(bǔ)劑可能引發(fā)血管舒張和低血壓[15]。有研究報(bào)道，膿毒癥休克患者補(bǔ)充精氨酸不會(huì)造成血流動(dòng)力學(xué)的不穩(wěn)定，故可對(duì)膿毒癥患者補(bǔ)充精氨酸治療，但尚有待研究的進(jìn)一步證實(shí)[16]。

1.3芳香族氨基酸和支鏈氨基酸 人體內(nèi)凡含有芳香環(huán)的氨基酸都屬于芳香族氨基酸，芳香族氨基酸主要包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，支鏈氨基酸包括有亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸。膿毒癥患者尤其合并肝功能損害和肝功能衰竭時(shí)，機(jī)體對(duì)芳香族氨基酸清除能力下降，血芳香族氨基酸水平升高，同時(shí)肌肉組織對(duì)支鏈氨基酸利用增加，導(dǎo)致血支鏈氨基酸水平降低，最終出現(xiàn)體內(nèi)芳香族氨基酸與支鏈氨基酸比例失衡。支鏈氨基酸抑制芳香族氨基酸向腦內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用減弱，使芳香族氨基酸大量進(jìn)入腦組織。

由于膿毒癥患者肝內(nèi)酶系統(tǒng)受損不能正常解毒，苯丙氨酸、酪氨酸入腦，經(jīng)β-羥化酶作用產(chǎn)生與兒茶酚胺遞質(zhì)(多巴胺、去甲腎上腺素)相似的結(jié)構(gòu)，與兒茶酚胺遞質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)受體，但不能正常傳導(dǎo)神經(jīng)沖動(dòng)的苯乙醇胺和羥苯乙醇胺等假神經(jīng)遞質(zhì)，從而抑制正常神經(jīng)遞質(zhì)的合成，干擾腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的正?；顒?dòng)，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)神經(jīng)精神癥狀和不同程度的意識(shí)障礙[17]。膿毒性腦病程度越重，患者意識(shí)障礙越明顯，相應(yīng)的血漿芳香族氨基酸水平越高，均在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究得到證實(shí)[18-19]。由此可見(jiàn)，氨基酸水平的變化對(duì)膿毒性腦病的發(fā)生、進(jìn)展和惡化起重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，給予有神經(jīng)系統(tǒng)異常癥狀膿毒癥患者補(bǔ)充支鏈氨基酸治療，可使患者血漿氨基酸恢復(fù)平衡，腦病癥狀減輕。對(duì)于膿毒癥尤其是合并肝功能損害的患者，若將支鏈氨基酸作為補(bǔ)充腸外營(yíng)養(yǎng)的能量來(lái)源，可改善患者腦功能，起到積極保護(hù)作用，并有助于改善臨床結(jié)果和生存情況[20]。支鏈氨基酸通過(guò)參與胰島素作用、蛋白質(zhì)合成、線粒體生物發(fā)生、炎癥和脂質(zhì)代謝等信號(hào)通路，增強(qiáng)免疫細(xì)胞功能，幫助受損免疫系統(tǒng)恢復(fù)，改善膿毒癥患者營(yíng)養(yǎng)狀況和臨床結(jié)局[21]。

1.4瓜氨酸 瓜氨酸是一種非蛋白質(zhì)α氨基酸，具有形成肽鍵的能力，不能通過(guò)蛋白質(zhì)直接分解而生成。腸道是唯一能大量合成瓜氨酸的器官，谷氨酸在體內(nèi)經(jīng)過(guò)肝臟循環(huán)和腎臟近曲小管攝取后，與氨作用生成精氨酸和一氧化氮，從而發(fā)揮改善免疫功能、抗氧化、維護(hù)肺功能等重要的生理功能。在膿毒癥尤其是膿毒性休克狀態(tài)下，患者全身器官血供重新分布，胃腸道常處于低灌注、低氧供狀態(tài)，體內(nèi)大量炎癥介質(zhì)釋放，極易出現(xiàn)腸道黏膜損傷和腸功能障礙，導(dǎo)致瓜氨酸合成明顯減少[22]。Luiking等[23]的一項(xiàng)對(duì)健康人群、普通重癥患者和膿毒性休克患者氨基酸代謝的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者尤其膿毒性休克患者的血漿瓜氨酸合成水平大幅度下降，與健康人群相比，至少下降56%以上。Hull等[24]對(duì)兒童腸功能衰竭進(jìn)行深靜脈置管后發(fā)生導(dǎo)管源性感染的研究發(fā)現(xiàn)，血漿瓜氨酸水平越高，導(dǎo)管源性感染發(fā)生率越低，由此得出，瓜氨酸水平可以作為判斷發(fā)生導(dǎo)管相關(guān)性血流感染的獨(dú)立影響因素。Piton等[25]對(duì)67例多器官功能衰竭患者的研究發(fā)現(xiàn)，24 h低血漿瓜氨酸水平與患者28 d死亡率有關(guān)。血漿瓜氨酸還可作為膿毒癥急性腸功能障礙的診斷標(biāo)志物[26]。通過(guò)補(bǔ)充瓜氨酸與直接補(bǔ)充精氨酸在非膿毒癥人體和動(dòng)物模型的藥動(dòng)學(xué)的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，直接補(bǔ)充瓜氨酸可獲得更高的血漿精氨酸水平，導(dǎo)致一氧化氮合成增加，可見(jiàn)，更多富含瓜氨酸的氨基酸制劑的出現(xiàn)將對(duì)膿毒癥的治療發(fā)揮更好的作用[27]。

1.5谷氨酸 谷氨酸是人體血漿和組織中含量最豐富的氨基酸，參與機(jī)體氮代謝，是器官和組織間氮轉(zhuǎn)運(yùn)的載體，體內(nèi)多種細(xì)胞的代謝氧化燃料，參與細(xì)胞信息傳遞，是大多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞突觸的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。膿毒癥時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞受損，谷氨酸經(jīng)細(xì)胞膜漏出增加，大量谷氨酸被釋放到細(xì)胞外間隙，而細(xì)胞外高水平谷氨酸最終造成N-甲基-D-天冬氨酸受體數(shù)量和活性下調(diào)，正常神經(jīng)元細(xì)胞N-甲基-D-天冬氨酸受體途徑的信號(hào)傳遞反應(yīng)受到影響，造成機(jī)體出現(xiàn)不同程度腦功能障礙。體外實(shí)驗(yàn)亦表明，細(xì)胞外高水平谷氨酸導(dǎo)致離子通道受損，Na+、Ca2+內(nèi)流，過(guò)多水分進(jìn)入細(xì)胞使神經(jīng)細(xì)胞腫脹變性，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載導(dǎo)致細(xì)胞壞死等一系列病理?yè)p害，這些都是膿毒性腦病的可能發(fā)病機(jī)制[28]。Koppel等[29]研究發(fā)現(xiàn)，危重患者細(xì)胞外谷氨酸水平越高，發(fā)生驚厥的可能性越大。Ytreb?等[30]對(duì)膿毒癥合并急性肝功能障礙的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝功能失調(diào)時(shí)，血漿谷氨酸水平出現(xiàn)相應(yīng)下降，谷氨酸可作為膿毒癥評(píng)價(jià)肝功能失調(diào)的指標(biāo)之一。施東偉等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥急性肝功能障礙死亡組的血清谷氨酸水平顯著下降，合并谷氨酸/谷氨酰胺比例下降。因此，監(jiān)測(cè)血清谷氨酸水平降低情況以及谷氨酸/谷氨酰胺比例變化來(lái)評(píng)估膿毒癥急性肝功能障礙患者的預(yù)后，對(duì)臨床有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義。

2 氨基酸檢測(cè)方法

2.1高效液相色譜法 高效液相色譜法是臨床對(duì)血液中氨基酸水平進(jìn)行檢測(cè)的常用方法，主要衍生方式有鄰苯二甲醛法、異硫氰酸苯酯法、2,4-二硝基氟苯法等。鄰苯二甲醛作為快速反應(yīng)劑，先與帶有仲氨基團(tuán)的氨基酸反應(yīng)，然后進(jìn)行柱前或柱后的液相色譜法檢測(cè)，此方法雖然反應(yīng)速度快，但需要先將氨基酸初步分離，再進(jìn)行衍生化處理，最后完成紫外線監(jiān)測(cè)，因此干擾因素較多，處理步驟復(fù)雜，分析時(shí)間長(zhǎng)，缺乏特異度，且無(wú)法進(jìn)行某些微量氨基酸定量監(jiān)測(cè)。目前發(fā)現(xiàn)幾乎所有構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸都可分為D-型和L-型兩類(lèi)。某些微量的內(nèi)源性D-型氨基酸(如D-天冬氨酸和D-谷氨酸等酸性氨基酸)存在于人體的體液和組織中，有重要的生理功能和疾病標(biāo)志物作用，成為代謝組學(xué)和創(chuàng)新藥物開(kāi)發(fā)的研究熱點(diǎn)[32]。需要特異性和敏感性更高的氨基酸分析方法實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的氨基酸代謝組學(xué)分析，二維手性高效液相色譜法是近年來(lái)改進(jìn)的氨基酸液相色譜法，可以實(shí)現(xiàn)生物樣品中D-型氨基酸分析[33]。

2.2氨基酸分析儀 氨基酸分析儀是目前臨床和科研中較常用的一種氨基酸檢測(cè)專(zhuān)用儀器，工作原理是典型的利用柱后衍生檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基酸檢測(cè)，儀器核心部件為離子交換柱，大多選用磺酸型陽(yáng)離子樹(shù)脂分離柱，離子交換柱首先對(duì)樣本進(jìn)行初步分離，然后通過(guò)設(shè)定的洗脫程序，用不同離子強(qiáng)度、pH值的緩沖液，按照首先酸性氨基酸，之后中性氨基酸，最后堿性氨基酸的洗脫順序，將受檢標(biāo)本的氨基酸依次洗脫下來(lái)，將洗脫下來(lái)的氨基酸與茚三酮反應(yīng)液在135 ℃的加熱條件下進(jìn)行反應(yīng)，最終生成藍(lán)紫色物質(zhì)。氨基酸分析儀利用紫外檢測(cè)器分別在570 nm、440 nm對(duì)產(chǎn)生的藍(lán)紫色物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和外標(biāo)法定量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基酸的定量檢測(cè)[34]。目前，我國(guó)應(yīng)用的氨基酸分析儀有KLA-5型、835-50型、85000型和8000A型。利用氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸檢測(cè)的專(zhuān)一性比較強(qiáng)、靈敏度相對(duì)較高、操作方便，完成一次血氨基酸檢測(cè)的時(shí)間較短，最短可縮至半小時(shí)左右，但采取柱后衍生檢測(cè)的內(nèi)外影響因素較多，洗脫程序?qū)е聶z測(cè)需要時(shí)間也較長(zhǎng)，故尚不能實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床高靈敏性和高特異性分析的大樣本氨基酸進(jìn)行檢測(cè)。

2.3液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法是近年來(lái)出現(xiàn)的氨基酸檢測(cè)新方法，也是未來(lái)氨基酸檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)，該方法不采用柱前或柱后衍生的傳統(tǒng)檢測(cè)方法，利用揮發(fā)性離子對(duì)試劑(如七氟丁酸/九氟戊酸等)實(shí)現(xiàn)氨基酸直接上機(jī)檢測(cè)，可成功避免衍生過(guò)程繁多的影響因素，與傳統(tǒng)液相色譜、氨基酸分析儀相比，具有更強(qiáng)的抗干擾能力，準(zhǔn)確性、敏感性性和重現(xiàn)性更高，但液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法成本較高，因此未能廣泛開(kāi)展。Zoppa等[35]采用高校液相色譜-電噴霧-質(zhì)譜聯(lián)用法技術(shù)對(duì)新生兒干燥血點(diǎn)氨基酸進(jìn)行定量或定性分析，該方法不需要衍生化試劑的處理，可以快速實(shí)現(xiàn)(10 min內(nèi)完成)40種氨基酸及同分異構(gòu)體的分析。目前，臨床也借助液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)氯氮平中毒患者的快速準(zhǔn)確判定，并通過(guò)測(cè)定乙型肝炎病毒感染者血漿中抗乙型肝炎病毒核苷類(lèi)似物(恩替卡韋、拉米夫定、替比夫定和替諾福韋)來(lái)指導(dǎo)乙型肝炎患者的臨床治療[36]。由此可見(jiàn)，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法可通過(guò)快速測(cè)定各種樣品中的游離氨基酸，實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物等小分子化合物血藥濃度的監(jiān)測(cè)，為尋找臨床診斷證據(jù)和指導(dǎo)調(diào)整藥物劑量提供技術(shù)支持。

3 小 結(jié)

膿毒癥患者機(jī)體代謝紊亂的機(jī)制復(fù)雜。目前，各種氨基酸的生理作用尚不完全明確，且不同氨基酸之間以及氨基酸、糖類(lèi)、脂肪三大能量物質(zhì)相互交錯(cuò)影響，需要進(jìn)一步研究明確不同氨基酸的生理作用以及膿毒癥不同階段氨基酸的代謝水平變化等。不同氨基酸檢測(cè)方法各有優(yōu)劣，仍需進(jìn)一步發(fā)掘更為準(zhǔn)確、快速、全面和經(jīng)濟(jì)的氨基酸檢測(cè)方法，以便早期準(zhǔn)確地評(píng)估和治療膿毒癥患者，遵循個(gè)體化原則，補(bǔ)充更準(zhǔn)確的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而改善預(yù)后。