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    MicroRNA?31在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及功能研究

    2017-07-06 12:41:02侯文仲毛振敏曾敏敏關(guān)北漩廖國(guó)民陳向林
    關(guān)鍵詞:膠質(zhì)瘤惡性神經(jīng)

    侯文仲,毛振敏,曾敏敏,關(guān)北漩,廖國(guó)民,陳向林

    [廣州醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院(清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院)神經(jīng)外科,廣東 清遠(yuǎn) 511518]

    MicroRNA?31在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及功能研究

    侯文仲,毛振敏,曾敏敏,關(guān)北漩,廖國(guó)民,陳向林

    [廣州醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院(清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院)神經(jīng)外科,廣東 清遠(yuǎn) 511518]

    目的:探討MicroRNA?31在膠質(zhì)瘤中的作用.方法:利用realtime?PCR檢測(cè)不同來(lái)源的膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中microRNA?31(miR?31)的表達(dá),分析miR?31表達(dá)與膠質(zhì)瘤級(jí)別的關(guān)系;MTT檢測(cè) miR?31對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響.結(jié)果:miR?31在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中都是低表達(dá)的,且在膠質(zhì)瘤組織中其表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高而降低.在U87和U251中,miR?31均能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,而同時(shí)加入antisense RNA抑制miR?31作用后細(xì)胞增殖即恢復(fù).結(jié)論:MiR?31能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,可能成為未來(lái)膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn).

    MicroRNA?31;膠質(zhì)瘤;惡性;增殖;治療靶點(diǎn)

    0 引言

    腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見、預(yù)后較差的原發(fā)性惡性腫瘤.由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤呈侵潤(rùn)性生長(zhǎng),與腦組織無(wú)明顯分界,難以做到全部切除,僅通過傳統(tǒng)手術(shù)無(wú)法有效治愈,多主張聯(lián)合治療,配以化療和放療延緩復(fù)發(fā)和延長(zhǎng)生存期[1-4].由于現(xiàn)有的腫瘤藥物和放療多針對(duì)生長(zhǎng)期細(xì)胞,對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞沒有明顯的殺傷效果,導(dǎo)致侵潤(rùn)性極強(qiáng)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有高復(fù)發(fā)、低治愈的特點(diǎn),是細(xì)胞生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)面臨的一大難題,因此尋找新的膠質(zhì)瘤治療靶標(biāo)是膠質(zhì)瘤臨床治療的迫切需要[5-6].

    MicroRNA(miRNA)是一類含量豐富的非蛋白編碼(non?protein?coding)小RNA,可作為負(fù)性基因調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)多種生物進(jìn)程[7-8].生物信息數(shù)據(jù)顯示,每個(gè)miRNA能影響數(shù)百種基因的表達(dá),miRNA可能對(duì)每一條遺傳通路都有影響[9].研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA?31(miR?31)在多種腫瘤中表達(dá)異常,如口腔癌、乳腺癌等,其在不同腫瘤中的功能也有所不同.有研究發(fā)現(xiàn)miR?31作用可能與其內(nèi)源表達(dá)相關(guān),如在乳腺癌中的miR?31的異常表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移相關(guān).在作用機(jī)制方面,有部分研究提示miR?31可能參與調(diào)控細(xì)胞周期、表觀遺傳學(xué)修飾等.雖然關(guān)于miR?31在腫瘤中的功能有很多研究,但是其在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和作用機(jī)制尚不明確.本研究分析了miR?31在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)miR?31在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)低于正常腦細(xì)胞.功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR?31抑制了膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng),其作用的分子機(jī)制仍在繼續(xù)研究中.

    1 材料和方法

    1.1 組織標(biāo)本和細(xì)胞培養(yǎng) 收集廣州醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院2010~2015年間膠質(zhì)瘤手術(shù)切除膠質(zhì)瘤標(biāo)本.納入標(biāo)準(zhǔn):診斷經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí);手術(shù)患者術(shù)前未行化療或放療.所有標(biāo)本獲取均經(jīng)過倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn).人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 U251MG和U87MG 2012年購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞細(xì)胞庫(kù),正常膠質(zhì)細(xì)胞系A(chǔ)172、T98和HEB購(gòu)自北京創(chuàng)聯(lián)生物科技公司(中國(guó),北京).細(xì)胞系真實(shí)性均經(jīng)過短串聯(lián)重復(fù)序列驗(yàn)證.所有細(xì)胞均用高糖DMEM(Invitrogen公司,美國(guó)),添加 10%的胎牛血清(GIBCO公司,美國(guó))、100 U/mL的青霉素(NCPC公司,中國(guó))和100 μg/mL的鏈霉素(NCPC公司,中國(guó)),培養(yǎng)環(huán)境為含5%CO2的37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱.

    1.2 轉(zhuǎn)染 MicroRNA?31 mimics(sense:5'?CGGCAA GAUGUGGCAUAGC?3',antisense:5'?TGCUTUGCCA GAUGUUGCC?3')由 Invitrogen(上海)合成,陰性對(duì)照RNA duplexes購(gòu)自Ambion(USA).細(xì)胞按2×105鋪板于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,待生長(zhǎng)至密度為70%時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染試劑為L(zhǎng)ipofeatmin2000,均按說(shuō)明書操作.

    1.3 qRT?PCR 通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qRT?PCR)檢測(cè)miR?31在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和創(chuàng)傷性腦損傷組織中的表達(dá)水平.按照試劑盒操作規(guī)程使用Trizol(Invitrogen公司,美國(guó))從凍存的組織樣品和細(xì)胞中抽提總RNA.RNA用不含RNase的DNase處理(羅氏公司,瑞士).然后使用BcaBe?stRNA PCR試劑盒(TAKAR公司,中國(guó))來(lái)合成cDNA.所有引物都由上海生工生物科技有限公司合成,熒光定量PCR使用SYBR底物,使用iQ5實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio?Rad公司)檢測(cè)信號(hào).引物序列為:5'?GGAGAGGAGGCAAGATGCTG?3',5'?GGAAA GATGGCAATATGTTG?3'.

    1.4 MTT實(shí)驗(yàn) 將1×104個(gè)細(xì)胞重懸在200 μL培養(yǎng)基中種到96孔板中.處理后,培養(yǎng)基換成200 μL含0.5 mg/mL MTT的DMEM/FBS,37°C孵育4 h.棄掉上清,細(xì)胞用200 μL DMSO 37°C裂解10 min.測(cè)量490 nm處的OD值(SpectraMax公司,美國(guó)).

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件通過單邊非配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)獨(dú)立樣本進(jìn)行分析.所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果的定量分析均采用標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM),并在圖中標(biāo)注,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

    2 結(jié)果

    2.1 MiR?31在膠質(zhì)瘤組織中低表達(dá) 研究miR?31在膠質(zhì)瘤中的功能,首先要檢測(cè)miR?31在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平,本研究收集了40例膠質(zhì)瘤標(biāo)本和各腫瘤組織對(duì)應(yīng)的正常組織或癌旁組織.qRT?PCR檢測(cè)肝癌組織中miR?31的表達(dá)發(fā)現(xiàn),miR?31在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯低于在正常組織和癌旁組織中的表達(dá)(圖1).

    圖1 MiR?31在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

    2.2 MiR?31表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤惡性的關(guān)系 為了分析miR?31與膠質(zhì)瘤惡性之間的關(guān)系,本研究進(jìn)一步對(duì)不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中miR?31的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè).結(jié)果顯示,與一級(jí)膠質(zhì)瘤組織相比,miR?31在二級(jí)和三級(jí)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)量顯著降低(圖2).

    圖2 MiR?31表達(dá)隨膠質(zhì)瘤級(jí)別升高而降低

    2.3 MiR?31在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中低表達(dá) 前期結(jié)果表明,miR?31在膠質(zhì)瘤組織中低表達(dá).為了進(jìn)一步明確miR?31在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況,本研究檢測(cè)了幾種膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR?31的表達(dá)水平(圖3).結(jié)果顯示,與HEB細(xì)胞相比,miR?31在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 U87、U251、T98和A172中的表達(dá)水平均顯著降低.說(shuō)明miR?31在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中都是低表達(dá)的.

    圖3 MiR?31在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平

    2.4 MiR?31對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響 根據(jù)前期結(jié)果,miR?31在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá),因此推測(cè)miR?31在膠質(zhì)瘤中應(yīng)該起抑癌基因的作用.因此本研究在U87和U251檢測(cè)了miR?31對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響(圖4、5).結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR?31對(duì)U87和U251增殖起明顯的抑制作用,而在miR?31過表達(dá)的同時(shí)加入antisense miR?31抵消miR?31的作用后,細(xì)胞的增殖得到明顯恢復(fù),這些結(jié)果充分說(shuō)明miR?31能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖.

    圖4 MiR?31對(duì)U87細(xì)胞增殖的影響

    圖5 MiR?31對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響

    3 討論

    神經(jīng)膠質(zhì)瘤是大腦最常見的原發(fā)性惡性腫瘤.盡管治療技術(shù)不斷進(jìn)步,包括手術(shù)、放射治療、光動(dòng)力治療、化療等,但是惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預(yù)后依舊很差,其高發(fā)病率和高死亡率促使人們不斷尋找新的治療策略.MicroRNA是一種內(nèi)源性非編碼RNA,MicroRNA可以通過靶向目標(biāo)基因的3'UTR區(qū)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因的表達(dá)[7].多種人體癌癥被證明與miRNA的突變或錯(cuò)誤表達(dá)有關(guān).如卵巢癌[8]、肺癌[9-10]、肝癌[11],結(jié)腸癌[12-13]和 GBM[14]等.MicroRNA的下調(diào)已經(jīng)成為一個(gè)新的惡性腫瘤的特征,所以一些特定的microRNA可以成為腫瘤診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[15-19].

    MiR?31定位于染色體 9q21.3,該位置存在CDKN2等很多腫瘤抑制基因[20].報(bào)道[21]稱 miR?31在肺癌中可通過與LATS、PPP2R2A抑癌基因相互作用影響細(xì)胞增殖,在頭頸腫瘤中也有類似發(fā)現(xiàn).而在腸癌中,miR?31通過激活RAS信號(hào)通路抑制RASA1轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)和惡性.與此同時(shí),在某些腫瘤中,miR?31又可發(fā)揮抑癌作用,如miR?31可以抑制乳腺癌增殖和惡性轉(zhuǎn)移.值得注意的是,miR?31在膠質(zhì)瘤中的功能尚未見報(bào)道.本研究根據(jù)上述前期研究結(jié)果分析了miR?31在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR?31在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中都是低表達(dá)的,且表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高而降低.在U87和 U251中,miR?31均抑制細(xì)胞生長(zhǎng),而同時(shí)加入 antisense RNA抑制miR?31作用后細(xì)胞增殖即恢復(fù).這些結(jié)果說(shuō)明miR?31在膠質(zhì)瘤內(nèi)屬于抑癌因子.

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)miR?31在膠質(zhì)瘤中低表達(dá),并且能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖.miR?31在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和作用的研究將有助于揭示膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,使miR?31成為膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展生理過程的指標(biāo),為未來(lái)膠質(zhì)瘤的治療提供新靶點(diǎn).

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    Study on the expression and function of microRNA?31 in glioma

    HOU Wen?Zhong,MAO Zhen?Min,ZENG Min?Min,GUAN Bei?Xuan,LIAO Guo?Min,CHEN Xiang?Lin Department of Neurosurgery,The Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Qingyuan City People's Hospital,Qingyuan 511516,China

    AIM:To study the role of microRNA?31 in glioma.METHODS:The expression of miR?31 from different glioma tissues and glioma cells were detected by realtime?PCR,and the relationship between expression of miR?31 and the level of the gli?oma was analyzed.The effect on miR?31 for proliferation of glioma cells was detected by MTT.RESULTS:The expression of miR?31 in glioma tissues and cell lines were lower than normal tissues and cell lines.The higher the lever of glioma,the lower the expression of miR?31.In U87 and U251,miR?31 could inhibit the cell proliferation,while cell proliferation was recovered by inhibi?ting the expression ofmiR?31 added the antisense RNA.CONCLUSION:MiR?31 can inhibit the proliferation of glioma cells,and miR?31 may be a new target in the treatment of glioma in the future.

    MicroRNA?31;glioma;malignant;preliferation;therapy target

    2095?6894(2017)06?26?03

    R739.41

    A

    2017-05-13;接受日期:2017-05-17

    清遠(yuǎn)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016B025)

    侯文仲.博士.E?mail:harzard@sina.com

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