小鼠骨折及不同治療方式模型的研究進(jìn)展

趙 毅，夏永寧，，于鐵成（吉林大學(xué)：第一醫(yī)院，白求恩醫(yī)學(xué)部，吉林 長春 300）

小鼠骨折及不同治療方式模型的研究進(jìn)展

趙 毅1，夏永寧1，2，于鐵成1（吉林大學(xué)：1第一醫(yī)院，2白求恩醫(yī)學(xué)部，吉林 長春 130012）

最近，小鼠骨折模型越來越引起研究者的興趣．這是因?yàn)椋蒲腥藛T可利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和胚胎干細(xì)胞技術(shù)，將小鼠的基因序列利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行重構(gòu)，研究具體的基因在骨折愈合過程中所起的作用．在當(dāng)前的小鼠骨折模型中，小鼠的股骨骨折模型是最常用的．在研究普通骨折的愈合時(shí)，通過新的三點(diǎn)彎曲的工具造成小鼠的股骨或脛骨骨折，然后再用髓內(nèi)釘、鎖釘或髓內(nèi)加壓螺釘固定骨折的股骨或脛骨．另外，在研究骨折延遲愈合和骨不連時(shí)，經(jīng)常會將小鼠的股骨切斷并切開，然后用別針技術(shù)、帶鎖髓內(nèi)針、鎖定鋼板或外固定架固定．評估骨折愈合的方法有多種，從傳統(tǒng)的放射學(xué)、組織學(xué)和生物力學(xué)發(fā)展到了MRI、顯微CT、放射性核素顯像和特殊分子和基因的檢測層面上．小鼠的步態(tài)分析是另一種有效的研究方法．總的來說，當(dāng)今的小鼠骨折模型與時(shí)俱進(jìn)，為我們研究正常和病理性骨折愈合過程中的生理學(xué)、生物力學(xué)、組織學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)等各方面變化提供一大批可信的、標(biāo)準(zhǔn)化的方案．

動物模型；小鼠骨折模型；骨骼修復(fù)；實(shí)驗(yàn)鼠；骨折穩(wěn)定

0 引言

動物骨折模型一般用于骨折愈合過程的研究［1－7］．過去，學(xué)者們偏愛大型的動物模型，如狗、兔子、山羊、綿羊等［2－3，5，8－9］．利用大型動物的骨骼重建可以更逼真地模仿人類的骨骼重建過程，主要是因?yàn)槎叨季哂泄ニ瓜到y(tǒng)［10－12］．相對于大型動物，小鼠的骨骼重塑是通過骨吸收完成的［13－14］．盡管大型動物的骨骼可以被穩(wěn)定的植入［2－3，8，11］，但是其主要弊端是在骨骼愈合過程中需要較長時(shí)間的圈養(yǎng)，并且消耗大量的科研經(jīng)費(fèi)．

因此，較小體型的動物模型越來越被認(rèn)同和廣泛應(yīng)用［13－16］．在骨科應(yīng)用領(lǐng)域，大批小鼠被作為具有實(shí)用價(jià)值的模型工具，而這些小鼠模型也完全可以應(yīng)用于研究其他物種．

應(yīng)用小鼠制作一個標(biāo)準(zhǔn)模型具有很大的挑戰(zhàn)性．這個模型必須是可重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)骨折類型，位置以及骨折移位的程度，這其中還包括軟組織的損傷；對于外科手術(shù)治療中的復(fù)位和固定在不同的標(biāo)本之間也必須是可重復(fù)的；對于骨折移位和軟組織損傷的特征的重建，可以通過應(yīng)用一種標(biāo)準(zhǔn)的可彎曲或其他可以替代的制作骨折的機(jī)械工具而達(dá)到重建目的．由于小鼠的骨骼尺寸過于細(xì)小，這就使得重建一系列相同的骨骼模型成為一個極具挑戰(zhàn)性的任務(wù)，例如應(yīng)用長骨（諸如股骨和脛骨）來研究包括固定和生物力學(xué)評估在內(nèi)的骨折愈合過程［17－18］．

1 簡介

在小鼠的骨折模型中應(yīng)用了各式各樣的內(nèi)植物［4，13－15，19－25］．而不同的內(nèi)植物和手術(shù)技術(shù)會使骨折在不同的生物力學(xué)環(huán)境中愈合，這會直接影響到骨骼的愈合過程和結(jié)果［10，13－15，19－22，26－34］．

1．1 小鼠骨折模型的優(yōu)點(diǎn) 相較于大型的動物模型，小鼠模型具有顯著的優(yōu)勢．從基因角度來講，實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)的小鼠基因是已知的［35－39］．轉(zhuǎn)基因鼠給我們研究骨折愈合過程中所表達(dá)的不同分子機(jī)制提供了可能［35－36］．并且，尚有大量的商業(yè)化生產(chǎn)的小鼠單克隆抗體，為研究在整個愈合過程中機(jī)體所表達(dá)的具體生物分子提供了大量的標(biāo)記機(jī)會和工具．研究者可以利用各種各樣的抗體去定位在骨折重建過程中所表達(dá)的不同目的生物大分子［35］．而同樣類型的上述實(shí)驗(yàn)在應(yīng)用于大型動物模型時(shí)并不能進(jìn)行實(shí)施，這是由于大型動物缺乏標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因群體以及很少有針對該種大型動物的商業(yè)化生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體［35］．相對大型動物，小鼠的飼養(yǎng)成本更低，這也是研究人員逐漸青睞小鼠模型的又一個原因．例如，一只體質(zhì)量為20 g的小鼠明顯要比50 kg的綿羊無論是在購買、飼養(yǎng)，抑或是在處置方面都要經(jīng)濟(jì)實(shí)惠．?dāng)?shù)量眾多的小鼠可以同時(shí)飼養(yǎng)在一個狹小空間中，相比之下大型動物往往會被飼養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)中心之外，然后每次實(shí)驗(yàn)操作時(shí)再將它們運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)中心．另外，擁有特定基因的小鼠由于繁殖周期短，研究人員可以在短時(shí)間內(nèi)獲得足夠數(shù)量的實(shí)驗(yàn)體．

1．2 小鼠的選擇 小鼠的年齡、性別及種群的不同都會影響骨折的生物愈合機(jī)制［40］．例如，與DBA／2和C3H兩個近親繁殖種群的小鼠相比，C57BL／6小鼠種群的愈合速度會更快［40］，說明該種群小鼠體內(nèi)突變的基因明顯有助于骨骼的重塑和愈合［41］．另外，相比較而言，雌鼠的股骨和脛骨的骨髓所擁有的間葉干細(xì)胞相對更少［42］．

小鼠的年齡也會影響骨折的愈合．高齡小鼠的成骨細(xì)胞會表現(xiàn)為成骨細(xì)胞對生長刺激物質(zhì)反應(yīng)的下降，從而軟骨分化和成熟也會延遲，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨內(nèi)成骨的延遲．高齡還會使調(diào)節(jié)血管再生的因子表達(dá)減少，從而影響骨折愈合過程中血管的再生過程［43］．高齡鼠的間葉干細(xì)胞同樣顯示相對年輕鼠較低的組織修復(fù)和重建率［44］．因此，在研究骨折愈合過程時(shí)，需要考慮年齡這一與骨折愈合密切相關(guān)的因素．小鼠在6～8周齡時(shí)性成熟，同時(shí)骨垢閉合，由于它們的體型不再增長，研究人員經(jīng)常會選擇這個年齡段的小鼠進(jìn)行骨折的研究．相對恒定的骨骼形態(tài)是研究骨折愈合的一個必需條件，因?yàn)楣趋荔w積的變化同樣會影響骨骼的愈合過程；另外，這也避免了在每個實(shí)驗(yàn)體身上的外科固定物品的一致性．在研究中應(yīng)用到的所有小鼠的體質(zhì)量超過20 g是最理想的，因?yàn)檫@個體質(zhì)量級別的小鼠的股骨直徑會在2～2．5 mm之間．對于骨折固定的的動物研究而言，實(shí)驗(yàn)小鼠同時(shí)具備的年齡匹配和體質(zhì)量匹配是非常重要的．

2 幾種小鼠的骨折愈合模型

2．1 肋骨骨折模型 肋骨的骨折模型是研究骨折愈合的有力工具，因?yàn)樗⒉恍枰潭ê蜕锪W(xué)的試驗(yàn)［45］．在吸入麻醉狀態(tài)下，研究人員可以暴露小鼠的右側(cè)第八肋間，然后用剪刀沿肋骨長軸垂直切斷該肋骨［45］．這個模型已經(jīng)成功應(yīng)用在檢測骨折愈合過程中的基因表達(dá)方面的研究［46－49］．

2．2 脛骨骨折模型 閉合的脛骨骨折模型簡單易行，是研究骨折髓內(nèi)固定的一種好的方法［50］（圖1）．在一項(xiàng)研究中，使用一種直徑為0．2 mm的不銹鋼鋼針固定了用3點(diǎn)彎曲工具制造的骨折［51］．當(dāng)應(yīng)用脛骨骨折模型時(shí)一定要考慮到腓骨．比如，由于腓骨的存在與否會直接影響到脛骨固定的整體穩(wěn)定性與生理愈合的環(huán)境［52］，所以研究人員在應(yīng)用這種模型時(shí)需要注意把腓骨是否存在作為一個變量．這種脛骨骨折模型改良自大鼠的閉合股骨骨折模型［51］．應(yīng)用脛骨骨折模型可以進(jìn)行生理機(jī)能性的測試，而且這個骨折模型也早已應(yīng)用于檢測骨折愈合中的基因表達(dá)過程［53－56］．

脛骨骨折的技術(shù)優(yōu)勢在于它減少了手術(shù)的損傷，減輕了固定物的重量以及減少了經(jīng)費(fèi)應(yīng)用．其劣勢在于，應(yīng)用一根鋼針?biāo)鑳?nèi)固定缺乏縱向與軸向的固定，這就導(dǎo)致縱向與軸向的不穩(wěn)，同時(shí)手術(shù)入路通過膝關(guān)節(jié)，這很可能會導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)脫位和髓腔損壞．當(dāng)應(yīng)用小鼠的脛骨骨折模型時(shí)，植入物鋼針的形狀需要與小鼠脛骨長軸方向彎曲的髓腔相匹配，這樣才能更好地固定．

圖1 脛骨骨折模型

2．3 小鼠的股骨骨折模型 小鼠的脛骨骨折模型在髓內(nèi)固定通路更容易，但是脛骨彎曲的長軸使得生物力學(xué)分析變得更加復(fù)雜；脛骨周圍僅有少量的軟組織，會導(dǎo)致脛骨骨折不易愈合［20－22，57］．另外，如果相鄰的腓骨發(fā)生骨折，也會影響到脛骨骨折的愈合率，而在這個過程中，大鼠腓骨骨折的概率高達(dá)30%［57］．與之相比，股骨是一種長管狀的骨頭，而且周圍有大量的肌肉等軟組織包裹，相對脛骨而言，股骨的直徑自上而下大體一致且體積也足夠大，這就使得股骨骨折模型可以應(yīng)用于釘板等較大型的內(nèi)固定或外固定裝置．

2．3．1 髓內(nèi)針 在小鼠的閉合股骨骨折中應(yīng)用髓內(nèi)針固定是以已經(jīng)完全成熟的家兔／大鼠的股骨閉合骨折模型為基礎(chǔ)的［51］（圖2）．在用三點(diǎn)彎曲工具制作股骨骨折之前，研究人員會把一根直徑約0．2 mm的不銹鋼針事先插入股骨的髓腔內(nèi)［51］，目的是為了保持股骨的軸線穩(wěn)定和防止大的移位．相較于它在脛骨上的應(yīng)用，這種髓內(nèi)針在股骨上的應(yīng)用顯示其不能抵抗軸向分離和旋轉(zhuǎn)．這種固定方式有利于控制骨折點(diǎn)不移位，而且還會營造一種標(biāo)準(zhǔn)的骨折愈合環(huán)境．

這個模型可以幫助我們建立一種標(biāo)準(zhǔn)的骨折，而且這種髓內(nèi)針可以在后續(xù)研究骨折愈合過程中的其他類型和作用的影響因素時(shí)取出．

圖2 股骨骨折模型（鎖定髓內(nèi)釘）

2．3．2 鎖定髓內(nèi)釘 在Holstein所描述的鎖定髓內(nèi)釘系統(tǒng)中（圖2），以直徑為0．1 mm的鎢絲作為導(dǎo)針，將1 mL注射器的針頭作為主釘植入髓腔［58］．在手術(shù)過程中，首先將一根直徑為0．1 mm直徑的鎢金屬導(dǎo)絲經(jīng)事先用0．5 mm環(huán)鉆在股骨髁間切跡上打出的孔進(jìn)入股骨骨髓腔．然后應(yīng)用三點(diǎn)彎曲工具制作一個閉合的股骨干骨折，使用1 mL注射器的針頭在該導(dǎo)絲的引導(dǎo)下固定股骨干［58］．

導(dǎo)針移除后，主釘?shù)哪┒伺c近端的釘頭處呈水平，然后從近端向髁間方向加壓．給主釘?shù)慕撕瓦h(yuǎn)端水平加壓可以保證股骨骨折的抗旋穩(wěn)定性．雖然這項(xiàng)技術(shù)在小鼠股骨骨折模型固定過程中的穩(wěn)定性比單純的髓內(nèi)針固定的穩(wěn)定性好，但是鎖定釘系統(tǒng)也絕非是一種十分穩(wěn)固的固定方式，它只應(yīng)用于相對穩(wěn)定的骨折模型．與簡單髓內(nèi)針系統(tǒng)具有相同優(yōu)點(diǎn)的是，這項(xiàng)技術(shù)損傷小、術(shù)式簡單、內(nèi)植物重量小及成本低．主要的缺點(diǎn)是存在潛在的髓腔損傷的可能．

這個鎖定髓內(nèi)釘模型是現(xiàn)在臨床中治療管狀骨骨折時(shí)經(jīng)常用到的一種固定方式，具有微創(chuàng)及防旋等優(yōu)點(diǎn)．這項(xiàng)技術(shù)適用于研究骨折的愈合過程．

2．3．3 交鎖髓內(nèi)釘 為了使小鼠的股骨骨折得到更加穩(wěn)固的固定，Garcia使用微CT數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)出了一種新型的髓內(nèi)固定裝置［31］．這種裝置可以借用一種特殊設(shè)計(jì)的瞄準(zhǔn)裝置用兩枚直徑為0．3 mm的鎖釘將主釘?shù)慕撕瓦h(yuǎn)端牢牢地鎖定住，同時(shí)，這個裝置在臨床中也應(yīng)用到了治療人類骨折領(lǐng)域［57］（圖3）．這個系統(tǒng)包括一根直徑為0．8 mm的髓內(nèi)釘，同樣需要一個開放穩(wěn)定的骨折．在這個模型中，小鼠的股骨干骨折的固定會在一種切開固定的手術(shù)技術(shù)下進(jìn)行．因?yàn)樵谶@個手術(shù)中骨折端的間隙可以被手術(shù)者在直視下看到，因此這個模型被廣泛應(yīng)用于研究正常的骨折愈合過程、延遲的骨折愈合過程和骨不連的形成過程中．但是，這套裝置的成本較高，而且切開復(fù)位內(nèi)固定技術(shù)時(shí)切開軟組織會造成對軟組織的破壞，這往往都是研究人員不希望發(fā)生的損傷．這項(xiàng)技術(shù)的最大優(yōu)勢就是它能使骨折的復(fù)位達(dá)到較高的抗旋穩(wěn)定性．而最大的缺點(diǎn)則是對組織進(jìn)行的一系列侵入性操作，包括對髓腔的破壞性操作．

交鎖髓內(nèi)釘技術(shù)可以給骨折的固定帶來高度的抗旋穩(wěn)定性及軸向穩(wěn)定作用，可以廣泛應(yīng)用于小鼠骨折愈合的研究過程中．

圖3 股骨骨折模型（交鎖髓內(nèi)釘）

2．3．4 髓內(nèi)加壓螺釘 為了使小鼠股骨干骨折的閉合復(fù)位內(nèi)固定后具有抗旋穩(wěn)定性，研究人員可以使用一枚長為18 mm、直徑為0．5 mm的髓內(nèi)加壓螺釘固定骨折，從而在不需要進(jìn)行破壞性侵入性操作的前提下，就能建立一個閉合穩(wěn)定的骨折固定［21，59］（圖4）．同前所述，在制作一個股骨干骨折模型時(shí)首先需要在股骨踝部打孔，然后插入一根導(dǎo)絲，最后骨折模型制作成功后再用一枚具有螺紋的加壓螺釘固定．這枚螺釘可以防止固定后的骨折斷端旋轉(zhuǎn)和軸向加壓．這種螺釘?shù)墓潭ū徽J(rèn)為是一種較為牢固的內(nèi)固定方式．并且這種固定方式具有較低的組織損傷、簡單的手術(shù)操作和較輕的內(nèi)置物重量等優(yōu)點(diǎn)．其缺陷為較高的內(nèi)植物成本以及對骨髓腔潛在的破壞．這個模型比較適用于研究正常骨折愈合過程中的分子機(jī)制，但對于研究骨不連無任何作用．

在這個骨折模型的固定過程中，應(yīng)用了一種牢固的固定技術(shù)．因此，這種固定方式可以用來研究術(shù)后鍛煉時(shí)的影響因素，以及研究有效的術(shù)后康復(fù)療法．

圖4 股骨骨折模型（髓內(nèi)加壓螺釘）

2．3．5 “別針”裝置 為了制作一個可靠的小鼠股骨骨折骨不連模型，用一枚髓內(nèi)針制作而成的“別針”裝置的應(yīng)用可以同時(shí)兼顧軸向穩(wěn)定與抗旋能力［60］（圖5）．“別針”裝置對小鼠股骨干骨折的固定過程需要手術(shù)暴露股骨干．這種方式可以制作不同大小間隙的骨折，適用于研究普通骨折的愈合過程、骨折延遲愈合的過程以及骨不連的形成過程．這個模型的優(yōu)點(diǎn)包括高的軸向和抗旋穩(wěn)定性、重量較輕的內(nèi)植物以及較低的成本．最主要的缺點(diǎn)是需要開放性手術(shù)進(jìn)行固定，并且還會對髓腔造成一定的損傷．

該裝置能夠提供軸向的穩(wěn)定性，能夠制作一種標(biāo)準(zhǔn)的骨病模型，從而為研究骨折的畸形愈合和不愈合提供工具．因此，該裝置可以作為外固定技術(shù)的一種替代裝置．

圖5 股骨骨折模型（“別針”裝置）

2．3．6 鎖定鋼板 雖然髓內(nèi)釘?shù)人鑳?nèi)固定系統(tǒng)已經(jīng)成為現(xiàn)在小鼠的長管骨閉合骨折內(nèi)固定模型的主流，但是鎖定鋼板和外固定架系統(tǒng)（髓外固定系統(tǒng)）將用于固定小鼠骨干和干骺端開放骨折模型的種髓外固定系統(tǒng)［20－22］（圖6）．該系統(tǒng)致力于通過減少內(nèi)置鋼板與骨表面的接觸面來減少骨膜的損傷．這塊鎖定鋼板通過外科手術(shù)采用4枚鎖定螺釘固定以達(dá)到穩(wěn)定、堅(jiān)固的骨折內(nèi)固定．應(yīng)用鋼板固定骨折的方式適于研究普通骨折愈合過程、延遲愈合的骨折愈合過程和骨不連的形成過程，其中在研究骨不連的愈合過程中，鋼板內(nèi)固定的方式可以在不損傷髓腔及其內(nèi)在的血管系統(tǒng)的情況下穩(wěn)固的控制固定后的骨折間隙．

鋼板鎖定的方式使得在特定機(jī)制和標(biāo)準(zhǔn)條件下研究小鼠干骺端的骨折愈合過程成為可能．

圖6 股骨骨折模型（鎖定鋼板）

2．3．7 外固定裝置 應(yīng)用于小鼠骨折外固定的外固定架技術(shù)與臨床應(yīng)用于人本身的外固定架技術(shù)是相類似的（圖7）．這套外固定裝置包括一塊外在支撐物作為支撐及四根迷你的Schanz螺釘（AO Development Institute）［15，21］，四根螺釘分別打入骨折近端和遠(yuǎn)端的骨質(zhì)中，他們將外在的支撐物和碎裂的骨塊連接在一起，有外在支撐物起支撐作用，螺釘作為傳導(dǎo)支撐力的作用．這種外固定系統(tǒng)沒有影響到骨折區(qū)域，但是由于應(yīng)用到螺釘，這些打入骨質(zhì)的螺釘會對周圍的軟組織造成損傷．當(dāng)這種固定裝置與具有完整骨質(zhì)的股骨接觸后，用手工去掰彎股骨使其骨折．外固定裝置主要應(yīng)用于研究正常的骨折愈合過程、骨折的延遲愈合過程和骨不連的形成過程，其中在研究骨不連的愈合過程中，外固定的方式可以堅(jiān)固的控制固定后的骨折間隙［61］．這種外固定裝置最主要的缺點(diǎn)在于過于沉重的的固定裝置、植入物過高的成本，以及由于過于笨重的外固定裝置限制了實(shí)驗(yàn)動物的生理活動和步態(tài)，就會增加動物自我損傷的風(fēng)險(xiǎn)；另外，外固定裝置可能還會導(dǎo)致后續(xù)的感染．這套外固定架對小鼠股骨骨折固定的模型就好似臨床上用到的方式，而且同樣的適用于開放性的股骨骨折．

圖7 股骨骨折模型（外固定裝置）

2．4 利用三點(diǎn)彎曲工具制作小鼠的閉合骨折模型

三點(diǎn)彎曲重力驅(qū)動裝置［21］是廣泛應(yīng)用于小鼠骨折模型制作領(lǐng)域的工具，最早由Bonnarens等［51］應(yīng)用于制作兔子的脛骨骨折．簡單的三點(diǎn)彎曲裝置的設(shè)計(jì)易于研究人員制作、操作及掌握．然而，存在以下缺點(diǎn)：第一，由于小鼠股骨尺寸過小，所以該裝置在股骨上固定的點(diǎn)不容易定位；第二，該裝置的復(fù)位彈簧可能在頻繁應(yīng)用過程中產(chǎn)生金屬疲勞，因此可能導(dǎo)致在整個實(shí)驗(yàn)過程中非一致的骨折模型；第三，轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼相對較小，用該種工具制作一致性骨折極具挑戰(zhàn)［22］．

最新一代的重力驅(qū)動骨折裝置通過提供改善的股骨位點(diǎn)、持續(xù)的碰撞速度及可調(diào)節(jié)的動能輸入來解決上述問題［62］．這一裝置更適應(yīng)小鼠大腿的解剖結(jié)構(gòu)，新的復(fù)位彈簧提供更加持續(xù)的沖擊速度和優(yōu)化的設(shè)備性能．能夠調(diào)節(jié)動能輸入使得通過調(diào)節(jié)沖擊時(shí)的質(zhì)量和速度制作重復(fù)的橫行骨折成為可能．正是由于以上進(jìn)步，在制作一個閉合的骨折模型時(shí)小鼠的體質(zhì)量反而成為了一個可有可無的決定因素，這也成為了這個模型的一項(xiàng)附加優(yōu)勢．

2．5 骨折愈合模型中的麻醉 小鼠的腹腔內(nèi)注射麻醉是最早應(yīng)用于手術(shù)過程中的麻醉方法，主要在研究小鼠的脛骨或腓骨骨折時(shí)應(yīng)用，但是不能應(yīng)用于肋骨骨折的研究過程［22］．由于研究人員需要在實(shí)驗(yàn)過程中對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行操控，而且在整個制作和修復(fù)骨折的過程中需要實(shí)驗(yàn)小鼠不同的體位，所以整個過程需要在腹腔內(nèi)注射麻醉下進(jìn)行．吸入性麻醉最常應(yīng)用于小鼠肋骨骨折模型的研究中，需要使用適用于小鼠的錐形面罩．最常用到的注射類麻醉藥為甲苯噻嗪（2 mg／kg）和氯苯甲氨環(huán)己酮（氯胺酮 75 mg／kg），優(yōu)點(diǎn)為成本低、易于管理及對研究者無健康損傷［19－22，57］．

3 骨折愈合過程的評估

3．1 影像分析 在大多數(shù)的案例中，研究小鼠骨折愈合過程的影像學(xué)變化時(shí)，所用的小鼠標(biāo)本必須在制作成骨折模型后的各個研究時(shí)間點(diǎn)上分別被處以安樂死［19］．高分辨率成像和二維或三維X線斷層掃描技術(shù)（微CT）通常會被用來評估小鼠骨折的愈合進(jìn)程［22］．傳統(tǒng)的X?線攝片技術(shù)大致能夠區(qū)分骨折后形成的骨的大小尺寸及影像學(xué)密度［57］．而微CT掃描則可以反映出骨痂的具體信息，諸如骨痂組織的礦質(zhì)密度、總的骨痂容量以及骨痂占骨折骨的體積分?jǐn)?shù)［57］．

非侵入性的實(shí)時(shí)成像技術(shù)在過去的幾年間被引進(jìn)用來評估活生物體內(nèi)骨修復(fù)進(jìn)程中的基因表達(dá)、蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞移位以及細(xì)胞死亡．新技術(shù)諸如生物熒光技術(shù)、近紅外光成像技術(shù)及核磁共振技術(shù)在研究中都嶄露頭角［19－22，57］．盡管微CT技術(shù)可以應(yīng)用于體內(nèi)，但是體外微CT則擁有更高的影像分辨率［66］．成像還能夠可視和定量地評估出愈合組織內(nèi)的血管系統(tǒng)．此外，與造影劑聯(lián)合應(yīng)用的體外3D微CT成像能夠單獨(dú)使愈合組織內(nèi)的脈管系統(tǒng)成像．

3．2 骨折愈合過程中的組織形態(tài)學(xué)分析 組織形態(tài)學(xué)技術(shù)應(yīng)用于骨折愈合、組織愈合進(jìn)程的評估和分析中，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)足夠區(qū)分組織內(nèi)的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及這些細(xì)胞的合成代謝和分解代謝率［57］．

總之，在這些骨折愈合進(jìn)程中的標(biāo)本被從實(shí)驗(yàn)動物體上切除及移除內(nèi)植物后，一般都會遵循ASBMR的指導(dǎo)綱領(lǐng)對其進(jìn)行固定、染色和分析對比度［67］．在給出骨痂的三維結(jié)構(gòu)之后，可將骨痂的大小和組織構(gòu)成進(jìn)行重復(fù)計(jì)算，這對定義一項(xiàng)具有代表性、標(biāo)準(zhǔn)化的參數(shù)十分重要［19－22，57］．包括：①骨折間隙的骨痂大小與骨的直徑比值；②骨痂的大小與全部愈合組織大小的比值；③軟骨性骨痂面積與全部愈合組織大小的比值；④修復(fù)區(qū)域大小與全部愈合組織大小的比值．

3．3 生物力學(xué)分析 無損傷性的三點(diǎn)彎曲、損傷性的4點(diǎn)彎曲，以及扭曲、軸向測試等概念早已經(jīng)被應(yīng)用于研究小鼠的脛骨和股骨骨折修復(fù)的生物力學(xué)特性中［22］．作為對比，由于肋骨的生理解剖結(jié)構(gòu)不規(guī)則，所以肋骨骨折模型并不適用于進(jìn)行生物力學(xué)研究．一項(xiàng)沒有損傷性的三點(diǎn)彎曲測試可以測量小鼠股骨骨折模型在不同固定方式下愈合組織的剛度［20］．在這項(xiàng)沒有損傷的測試中，荷載?位移曲線線性曲度＞1%，增加負(fù)重就會停止．無損加載協(xié)議的構(gòu)造會在宏觀和組織學(xué)上表現(xiàn)出來［20］．損傷性四點(diǎn)彎曲測試已經(jīng)被用來進(jìn)行小鼠的脛骨和股骨骨折模型極限抗彎剛度（N／mm）和彎曲荷載（N／mm）的測量［68］．極限彎曲載荷被定義為失敗的最大荷載，在荷載?變形曲線中被確定．扭曲與軸向測試已經(jīng)被應(yīng)用于研究小鼠股骨骨折模型的髓內(nèi)固定，主要用來決定固定是否有效［22，58］．

總之，小鼠骨的尺寸過小，給生物力學(xué)測試帶來了很大的挑戰(zhàn)，所以需要更加精密的測量儀器．骨愈合過程中的任何生物力學(xué)分析結(jié)果的研究被表示為作為健側(cè)骨結(jié)果的百分比考慮動物的個體差異．

3．4 免疫組織化學(xué)研究 除了進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究，研究人員可以應(yīng)用免疫組織化學(xué)分析技術(shù)對骨折時(shí)細(xì)胞內(nèi)的不同蛋白質(zhì)進(jìn)行原位空間檢測，諸如細(xì)胞因子和細(xì)胞標(biāo)記物等［50，68－69］．免疫組織化學(xué)技術(shù)的評估結(jié)果能夠被Western blotting（蛋白印跡法）及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù)等蛋白半定量分析方法所支持［70］．而原位雜交技術(shù)為我們了解不同類型細(xì)胞中相應(yīng)信使RNA的表達(dá)提供了進(jìn)一步信息［68］．另外，原位信使RNA表達(dá)的評估可以被半定量的技術(shù)諸如Northern blotting（North?ern印跡雜交）和RT?PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）所支持［68］．而且，骨折愈合組中的細(xì)胞可以被作為培養(yǎng)細(xì)胞，從而進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域的研究．

3．5 步態(tài)的活躍度分析 步態(tài)分析是一項(xiàng)十分有用的技術(shù)，它可以幫助研究人員評估術(shù)后動物的運(yùn)動模式［71－72］．步態(tài)分析已經(jīng)被引進(jìn)用來研究利用髓內(nèi)針固定的小鼠股骨骨折模型中，去測試在骨折和固定后小鼠活動模式的改變［74］．動態(tài)的步態(tài)分析通過脛股角數(shù)字成像技術(shù)為研究提供持續(xù)的數(shù)據(jù)．在本項(xiàng)技術(shù)的研究中，脛股角的范圍和最大值是關(guān)鍵參數(shù)［72］．骨折的固定會導(dǎo)致脛股角活動范圍和峰值改變．通過對小鼠的步態(tài)分析，可以比較不同骨折固定技術(shù)對小鼠脛股角的活動范圍和峰值的影響．

4 結(jié)論

在研究骨折愈合的細(xì)胞和細(xì)胞分子機(jī)制時(shí)有大量不同的骨折模型可以應(yīng)用．而針對開放或閉合的骨折模型，研究人員可以在應(yīng)用或不應(yīng)用各種不同的固定方式的情況下去研究骨折的正常愈合過程、骨折延遲愈合的過程以及骨不連的形成過程．所有的對比分析必須在最大化減小或消除變量的基礎(chǔ)條件下進(jìn)行，比如實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用到的小鼠必須在年齡、重量、性別、種系上一致．為了成功的制作一個小鼠的閉合股骨骨折模型，使用新型的三點(diǎn)彎曲裝置可以制作可重復(fù)的股骨橫行骨折模型［73－74］．這樣，小鼠的瘦小骨骼并不是一項(xiàng)影響動物實(shí)驗(yàn)的重要因素．時(shí)下流行的小鼠股骨骨折模型為研究人員在分子生物和基因?qū)用嫜芯空９钦塾线^程、骨折延遲愈合過程以及骨不連的形成過程提供了標(biāo)準(zhǔn)模型．

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Research progresson bonefractureand different treatments in mouse models

ZHAO Yi1，XIA Yong?Ning1，2，YU Tie?Cheng11Department of Orthopedics，F(xiàn)irst Hospital，2Norman Bethune Health Science Center，Jilin Univeisity，Changchun 130021，China

Recently，mouse fracture models have increasingly attracted interests among researchers，for mouse genes can be inactivated，mutated or specifically expressed using transgenic and embryonic stem cell technology，which provides opportunities to observe the effect of an individual gene in the fracture healing process．Among current mouse fracture models，the mouse femur fracture models were mostly selected．To investigate the mecha?nism of normal fracture healing，the mouse femur or tibia is frac?tured using the new 3?point bending device（closed models）and is fixed with intramedullary pin，locking nail or intramedullary compression screw．In contrast，to investigate the mechanism of delayed healing and non?union formation，the mouse femur is osteotomized using an open surgical approach（open models）and is fixed with pin?clip device，interlocking nail，locking plate or external fixator．To evaluate the process of fracture healing，a lot of analytical methods are selectable，ranging from traditional meth?ods such as radiological，histological and biomechanical analyses to MRI，microscopic CT，radionuclide imaging，and detection of specific molecules and genes．Gait analysis is another useful study method．In summary，current mouse femur fracture models provide standardized methods for us to analyze physiology，biomechanics，histology，molecular biology，and genetics aspects of normal frac?ture healing，delayed healing or non－union formation．The opin?ions given in this review might help researchers to perform in vivo bone healing experiments．

animal model；mouse fracture model；bone repair；mice；fracture stabilization

2095?6894（2017）06?83?07

R247．1

A

2017－04－29；接受日期：2017－05－13

國家自然科學(xué)基金（81172183，31470932）

趙 毅．副教授．E?mail：tiechengyu＠163．com

于鐵成．博士，教授，主任醫(yī)師．E?mail：tiechengyu＠163．com