氣相色譜—質(zhì)譜法檢測(cè)肉制品中的殺鼠酮

賀 燕

徐文泱

孫桂芳

周興旺

唐萬里

(湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410017)

氣相色譜—質(zhì)譜法檢測(cè)肉制品中的殺鼠酮

賀 燕

徐文泱

孫桂芳

周興旺

唐萬里

(湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410017)

建立了氣相色譜—質(zhì)譜法測(cè)定肉制品中殺鼠酮的方法。考察了不同的提取及凈化方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。試樣經(jīng)丙酮—正己烷超聲提取，采用一種新型分散固相萃取管進(jìn)行凈化，采用EI源以氣相色譜質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。添標(biāo)水平為0.5～5.0 mg/kg時(shí)平均回收率為81%～89%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～8.4%，殺鼠酮檢出限為0.005 mg/kg，該方法快速、簡(jiǎn)單且靈敏度高，符合檢測(cè)方法參數(shù)的確認(rèn)要求。

氣相色譜—質(zhì)譜法；殺鼠酮；肉制品；檢測(cè)

近年來，由誤食鼠藥引發(fā)的食品安全事故屢有發(fā)生。殺鼠酮是一種抗凝血類殺鼠劑[1-2]，其母體結(jié)構(gòu)為茚滿二酮[3]，其作用機(jī)制是競(jìng)爭(zhēng)性抑制維生素K1，影響凝血因子在肝臟內(nèi)的合成，使凝血時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致出血[4]。殺鼠酮見效快，對(duì)人的毒性和殘留較小，因此被廣泛使用，目前這種鼠藥未有任何國家、地方標(biāo)準(zhǔn)或較為系統(tǒng)通用的定性定量檢測(cè)方法。對(duì)此類鼠藥檢測(cè)的相關(guān)文獻(xiàn)[4-7]報(bào)道主要針對(duì)一些生物樣本，特點(diǎn)是基質(zhì)簡(jiǎn)單，雜質(zhì)干擾少，對(duì)樣品的處理較為簡(jiǎn)單，基本無需采取進(jìn)一步的凈化手段，但對(duì)脂肪含量較多或組成成分復(fù)雜的食品尚未涉及，因此對(duì)其建立食品中的檢測(cè)方法十分必要。

謝維平等[8]以QuEChERS方法對(duì)血漿中的抗凝血滅鼠劑進(jìn)行凈化，其加標(biāo)回收率為70.4%～101.5%。黃克建等[9]以乙腈沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，稀釋、離心后直接進(jìn)樣，建立了同時(shí)測(cè)定全血和尿液樣品中7種抗凝血?dú)⑹笏幍脑诰€固相萃取/液相色譜—線性離子阱質(zhì)譜分析方法。

抗凝血?dú)⑹笏幍臋z測(cè)方法以液相色譜[10-13]及液相色譜—質(zhì)譜法[14-16]為多，Virginie Vandenbroucke等[6]采用LC-HESI-MS/MS(液相色譜—加熱電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜)方法檢測(cè)肝臟中的8種抗凝血?dú)⑹笏幊煞?，檢出限最低可達(dá)0.37 ng/g(殺鼠靈);陳曉紅等[5, 17-18]致力于離子色譜質(zhì)譜檢測(cè)多種鼠藥的方法;謝珍茗等[19]以α-溴苯乙酮酯為衍生化試劑，建立了柱前衍生—高效液相色譜法測(cè)定生物檢材中的氟乙酸鈉。前處理方法主要有QuEChers凈化[8, 20]、SPE[21]、液液萃取[7]等。食品中對(duì)鼠藥的氣相色譜—質(zhì)譜法鮮有建立。氣相色譜—質(zhì)譜法是一種常用的檢測(cè)食品中有害物質(zhì)的儀器方法，檢測(cè)分子量小，沸點(diǎn)低且熱穩(wěn)定性好的化學(xué)物質(zhì)有較強(qiáng)優(yōu)勢(shì)[22-24]。本研究擬以氣相色譜—質(zhì)譜法建立脂肪含量較多的肉制品中殺鼠酮的檢測(cè)方法，為中毒案(事)件的殺鼠酮的快速篩查提供技術(shù)支撐，提高食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)能力及突發(fā)事件應(yīng)急處置能力，填補(bǔ)監(jiān)測(cè)空白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殺鼠酮：99.8%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；

乙腈、丙酮、正己烷：色譜純，德國Merck公司；

二氯甲烷：色譜純，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；

石油醚、氯化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

增強(qiáng)性去脂質(zhì)凈化管：5982-0101，美國Agilent公司；

FLORISIL柱、NH2小柱：500 mg/6 mL，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；

色譜柱：HP-5 MS型，60 m×0.25 μm×0.25 mm，美國Agilent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 7890A 5975C-MSD型，美國安捷倫科技有限公司；

離心機(jī)：Centrifuge 5804R型，德國艾本德股份公司；

超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山美美超聲儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

分析天平：SPS401F型，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

數(shù)顯型多管旋渦混合器：945066型，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：HP-5 MS；程序升溫條件：60 ℃保持1 min，20 ℃/min到180 ℃保持 6 min，10 ℃/min到280 ℃保持8 min；進(jìn)樣口：220 ℃；分流方式：不分流。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為電子轟擊離子(EI)源，電子轟擊能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，分別采用全掃描SCAN和選擇離子SIM模式，溶劑延遲時(shí)間為5 min。

1.3.3 樣品萃取條件優(yōu)化 選取丙酮—正己烷(體積比1∶1)、乙腈、石油醚、石油醚—丙酮(體積比1∶1)、二氯甲烷、乙腈—甲苯(體積比3∶1)為提取溶劑。按1.3.4中的方法一進(jìn)行處理后，以GC-MS進(jìn)行分析，計(jì)算回收率。

1.3.4 樣品凈化條件優(yōu)化 試驗(yàn)考察了3種較為常見的正相固相萃取小柱[NH2柱、FLORISIL柱、PSA(脂質(zhì)增強(qiáng))柱]對(duì)加標(biāo)樣品香腸和生豬肉進(jìn)行凈化，考察了3種萃取柱對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。具體方法：

(1) 稱取5 g樣品，酌情加入少量水及NaCl，靜置10 min。加入25 mL丙酮—正己烷(體積比1∶1)超聲提取20 min。離心并提取上清液。將上述步驟重復(fù)后對(duì)上清液進(jìn)行收集，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其于45 ℃濃縮，以丙酮定容至2 mL，轉(zhuǎn)移至增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管中，渦混后離心取上清液上機(jī)。

(2) 稱取5 g樣品，酌情加入少量水及NaCl，靜置10 min。加入25 mL丙酮—正己烷(體積比1∶1)超聲提取20 min。離心并提取上清液。將上述步驟重復(fù)后對(duì)上清液進(jìn)行收集，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其于45 ℃濃縮，分3次共加入12 mL丙酮—正己烷(體積比1∶1)，并以活化后的NH2小柱凈化。收集洗脫液，濃縮后定容上機(jī)。

(3) 稱取5 g樣品，酌情加入少量水及NaCl，靜置10 min。加入25 mL丙酮—正己烷(體積比1∶1)超聲提取20 min。離心并提取上清液。將上述步驟重復(fù)后對(duì)上清液進(jìn)行收集，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其于45 ℃濃縮，分3次共加入12 mL丙酮—正己烷(體積比1∶1)，以活化后的FLORISIL小柱凈化。收集洗脫液，濃縮后定容上機(jī)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取溶劑的選擇

在提取過程中，提取溶劑的選擇對(duì)殺鼠酮提取效率的影響較大。由于肉制品的蛋白、油脂含量較高，基體雜質(zhì)干擾大，因此試驗(yàn)中選擇的溶劑應(yīng)對(duì)油脂類大分子的提取效率影響小。由表1可知，丙酮—正己烷(體積比1∶1)為提取溶劑時(shí)，目標(biāo)物的回收率和重現(xiàn)性較好。丙酮沸點(diǎn)較低，可保證減壓濃縮過程快速、順利地進(jìn)行，由于處理溫度較低也防止了殺鼠酮的揮發(fā)。選取極性較低的混合溶劑可使得部分干擾物與目標(biāo)物分離，有利于樣品的凈化和回收率的提高。乙腈—甲苯(體積比3∶1)的提取效率最低，可能是此混合溶劑對(duì)基質(zhì)中雜質(zhì)的提取效果較好，降低了儀器的靈敏度。進(jìn)一步考察超聲提取、索氏提取、振蕩提取、均質(zhì)提取4種常見的提取方式對(duì)提取效率的影響，結(jié)果表明4種提取方式對(duì)結(jié)果的影響接近，由于超聲提取操作簡(jiǎn)單，故選擇該提取方式。分別比較了超聲提取次數(shù)為1，2，3次及超聲時(shí)間為5，20，45 min對(duì)提取效率的影響，確立超聲時(shí)間20 min、提取次數(shù)2次即可達(dá)到理想的提取效率。

表1 不同提取溶劑提取加標(biāo)肉制品中殺鼠酮的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

Table 1 Average recoveries and RSD of pindone in spiked meat products with different solvents (n=6) %

2.2 凈化方法的選擇

固相萃取相比其他的凈化方法，其優(yōu)勢(shì)在于處理簡(jiǎn)單，凈化效果較好。因此，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)殘獸殘的前處理。其選擇主要取決于樣品基質(zhì)及目標(biāo)物的性質(zhì)。殺鼠酮為中等極性化合物。肉制品中的雜質(zhì)較多，比較適合正相固相萃取。通過對(duì)回收率的比較，發(fā)現(xiàn)FLORISIL小柱的凈化效果最差，回收率僅為59%，NH2小柱凈化對(duì)香腸中殺鼠酮的回收率為58%；采用PSA柱兩類肉制品的回收率可達(dá)到81%以上，對(duì)于脂類物質(zhì)的凈化效果較好。因此試驗(yàn)采用PSA柱凈化。PSA柱是弱陰離子交換吸附劑，可有效去除樣品中的極性色素、糖類、有機(jī)酸、脂肪酸及可形成氫鍵的組成成分。此外，在凈化前，將提取液置于冰箱中冷凍1 h，使油脂類物質(zhì)盡量分離，降低對(duì)色譜柱的污染，回收率有明顯提高。不同固相萃取小柱或凈化管對(duì)肉制品中殺鼠酮回收率的影響見圖1。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基體對(duì)待測(cè)組分的影響稱為基質(zhì)效應(yīng)。常用的校準(zhǔn)曲線測(cè)量只在基質(zhì)效應(yīng)不影響測(cè)定結(jié)果時(shí)才能使用。以2.2凈化條件處理空白試樣，并得到洗脫溶劑。用洗脫溶劑配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率考察化合物的基質(zhì)效應(yīng)。對(duì)樣品在儀器上的信號(hào)值進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，空白基質(zhì)配制溶液信號(hào)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于洗脫溶劑配制的同一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，由此可得，方法基質(zhì)效應(yīng)顯著，標(biāo)準(zhǔn)溶液宜用空白基質(zhì)溶液配制。

圖1 凈化方式對(duì)肉制品中殺鼠酮回收率的影響Figure 1 The effects of purification methods on pindone in meat products

2.4 儀器條件的優(yōu)化

殺鼠酮為中等極性化合物，采用HP-5 MS色譜柱進(jìn)行雜質(zhì)的分離。其沸點(diǎn)不高，出峰時(shí)間較早。待測(cè)物出峰后再設(shè)置較快升溫程序使雜質(zhì)不在色譜柱中滯留，雜質(zhì)逐漸與色譜柱固定相分離，避免色譜柱污染。

將標(biāo)準(zhǔn)溶液在掃描模式下進(jìn)行測(cè)定，確定其質(zhì)譜結(jié)構(gòu)信息和保留時(shí)間，選擇豐度高、碎片質(zhì)量較大、干擾少的離子作為定量和定性離子。樣品測(cè)定時(shí)，如滿足以下條件則判斷樣品為陽性結(jié)果：① 色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜峰的保留時(shí)間一致，且偏差在±2.5%之內(nèi)；② 所選擇的監(jiān)測(cè)離子均出現(xiàn)；③ 離子豐度比符合表2要求。

表2 定性測(cè)定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差Table 2 Selective ion and relative abundance ratio for target determination %

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及加標(biāo)樣品的TIC圖及SIM圖見圖2～5。由圖2～5可知，加標(biāo)樣品的色譜圖峰形良好，無雜質(zhì)干擾。說明此儀器方法條件的適用性較好。

2.5 線性范圍和檢出限

在優(yōu)化條件下，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=1.02×105x-3.24×104，在質(zhì)量濃度為0.05～20.00 μg/mL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均>0.99。以3倍信噪比計(jì)算檢出限，得檢出限為0.005 mg/kg。

2.6 回收率和精密度

在空白樣品中，添加低、中、高3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定，每水平做6組平行。由表3可知，各組分測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.0%～8.4%，空白加標(biāo)回收率為81%～89%，滿足GB/T 27404—2008對(duì)方法技術(shù)參數(shù)的相關(guān)要求。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)殺鼠酮的TIC圖Figure 2 Total ionic chromatogram of standard reference

圖3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)殺鼠酮的SIM圖Figure 3 Selected ion monitoring chromatogram of pindone

圖4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)殺鼠酮的SCAN圖Figure 4 SCAN chromatogram of pindone

圖5 加入殺鼠酮的肉制品TIC圖Figure 5 Total ionic chromatogram of pindone-spiked sample

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對(duì)前處理方式及色譜條件的優(yōu)化，建立了肉制品中殺鼠酮的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法，對(duì)樣品的提取及凈化方法均進(jìn)行了研究，并確立了精密度、檢出限、回收率等技術(shù)參數(shù)，研究結(jié)果表明，該方法快速簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠、符合殘留檢測(cè)的要求，為快速檢測(cè)提供了簡(jiǎn)便的樣品前處理方法和分析手段。

圖6 殺鼠酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 6 Standard curve of pindone表3 加標(biāo)回收率及精密度一覽表Table 3 Recoveries of different spiked levels and relative standard deviation

樣品加入量/(mg·kg-1)平均回收率/%RSD/%0.5828.4香腸1.0887.75.0878.20.5817.4臘肉1.0867.25.0896.90.5827.4火腿1.0813.05.0855.2

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Determination of pindone in meat product by GC-MS

HEYan

XUWen-yang

SUNGui-fang

ZHOUXing-wang

TANGWan-li

(HunanResearchInstituteofFoodQualitySupervisionandInspection,Changsha,Hunan410017,China)

To establish a GC-MS method for determination of pindone in meat products. The effects of ways of extraction and purification on the recovery have been studied. The samples were extracted by acetone and (hexane 1∶1) with dSPE purified column. GC-MS was used for determination by EI. The average recoveries were in the range of 81%～89% at spiked levels of 0.5～5.0 mg/kg. The relative standard deviation of the methods were 3.0%～8.4%, and the limit of quantification reached 0.005 mg/kg which meet the requirement of technical parameters for analysis with fast and simple determination and high sensitivity.

GC-MS; pindone; meat products; determination

湖南省食品藥品安全科技項(xiàng)目(編號(hào)：湘食藥科R201608)

賀燕(1982—)，女，湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院工程師，碩士。E-mail:45023091@qq.com

2017—04—01

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.020