重組人可溶性Tim-3原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其重組蛋白的優(yōu)化表達(dá)*

白少云， 卿吉琳， 劉 振， 譚源?！?， 陳治中

1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南寧 530021 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 2婦產(chǎn)科 3檢驗(yàn)科，南寧 530021

重組人可溶性Tim-3原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其重組蛋白的優(yōu)化表達(dá)*

白少云1， 卿吉琳2， 劉 振1， 譚源福1△， 陳治中3△

1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南寧 530021 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院2婦產(chǎn)科3檢驗(yàn)科，南寧 530021

目的 構(gòu)建人可溶性Tim-3(sTim-3)的重組質(zhì)粒表達(dá)載體pET28a-sTim-3-EGFP，在大腸埃希菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。方法 取健康人外周血提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增Tim-3基因胞外段序列，克隆入已構(gòu)建的表達(dá)載體pET28a-EGFP中，鑒定陽(yáng)性克隆。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，通過(guò)調(diào)整IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化蛋白表達(dá)條件。結(jié)果 成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-sTim-3-EGFP，并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。溫度和IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)量影響不大；在培養(yǎng)至A600 nm值約為0.6～0.8時(shí)于25℃誘導(dǎo)5 h可獲得較高的蛋白表達(dá)。結(jié)論 成功表達(dá)可溶性重組蛋白sTim-3-EGFP，為該蛋白的進(jìn)一步純化生產(chǎn)及應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。

Tim-3； 原核表達(dá)； 增強(qiáng)綠色熒光蛋白; 融合蛋白

T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域家族(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecules family，TIM)是2001年McIntire等[1]在研究過(guò)敏和哮喘基因過(guò)程中發(fā)現(xiàn)并定位克隆的一個(gè)新的基因家族。該家族共包括8個(gè)成員(Tim-1～Tim-8)，其中僅Tim-1、Tim-3、Tim-4存在于人類，定位于與過(guò)敏、哮喘和自身免疫性疾病相關(guān)的人類5號(hào)染色體5q33.2上。全長(zhǎng)人Tim-3蛋白共由301個(gè)氨基酸組成，其結(jié)構(gòu)從N端到C端分別由信號(hào)肽、IgV亞單位、黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域、單跨膜結(jié)構(gòu)域和富含Tyr的胞質(zhì)尾區(qū)組成[2]。Tim-3蛋白是Ⅰ型膜蛋白，其基因序列的信號(hào)肽區(qū)多肽在其成為有功能的蛋白分子前已被剪切去除，IgV亞單位和黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的胞外部分為其發(fā)揮功能的重要區(qū)域，參與配體的識(shí)別和結(jié)合。先前的研究在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了缺乏黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)的Tim-3的可溶性形式[3]；近些年在人體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了Tim-3的可溶形式，是由金屬蛋白酶ADAM10和ADAM17將全長(zhǎng)膜型Tim-3在細(xì)胞膜表面裂解產(chǎn)生，其僅由IgV亞單位和黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域組成[4]。

2002年Monney等[5]首先報(bào)道了Tim-3主要表達(dá)于產(chǎn)γ干擾素(IFN-γ)的CD4+T輔助細(xì)胞1(Th1)和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tcl)表面。隨后在Th17細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞表面也相繼發(fā)現(xiàn)了Tim-3的表達(dá)[6-7]。半乳糖凝集素-9(galectin-9，Gal-9)是Tim-3的天然配體，可與Th1和Th17細(xì)胞表面的Tim-3分子特異性結(jié)合負(fù)性調(diào)節(jié)Th1和Th17細(xì)胞的免疫功能[8]。隨后又確認(rèn)磷脂酰絲氨酸(phosphatidyl serine，PtdSer)、高遷移率組蛋白B1(HMGB1)、Ceacam-1等為Tim-3的其他幾種配體，其中一些主要在固有免疫細(xì)胞中發(fā)揮作用。功能研究顯示Tim-3是一種具有多種生物學(xué)功能的免疫調(diào)節(jié)分子，在哮喘、自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病、器官移植、病毒感染、不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)及腫瘤等多種疾病的免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，且在免疫調(diào)節(jié)的不同階段發(fā)揮的作用有所不同[6]。在腫瘤組織中，高表達(dá)Tim-3往往提示預(yù)后不良，因而Tim-3有望作為腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。

本研究應(yīng)用基因工程技術(shù)，將Tim-3胞外段基因與增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)重組到原核表達(dá)載體，并誘導(dǎo)其初步表達(dá)產(chǎn)生sTim-3-EGFP融合蛋白，為sTim-3的后續(xù)研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NocⅠ和SacⅠ、250 bp DNA Ladder marker、1 kb DNA ladder marker及pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、T4DNA連接酶、HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗、感受態(tài)大腸埃希菌DH5α和BL21(DE3)均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。卡那霉素、氨芐西林購(gòu)自上海生工生物技術(shù)公司。人外周血淋巴細(xì)胞分離液、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopro-pyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)購(gòu)自索萊寶公司。蛋白預(yù)染Marker購(gòu)自Thermo公司。小鼠抗His標(biāo)簽單抗、小鼠抗EGFP標(biāo)簽單抗購(gòu)自O(shè)rigene公司。Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司。pET28a原核表達(dá)載體及已構(gòu)建好的pET28a-EGFP重組質(zhì)粒[9]由本實(shí)驗(yàn)室保存。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 Tim-3胞外段RT-PCR引物的設(shè)計(jì)

在GenBank中查找到Tim-3基因編碼序列，結(jié)合跨膜預(yù)測(cè)軟件如TMHMM Server v.2.0、TMpred、TMAP等預(yù)測(cè)胞外段序列，自行設(shè)計(jì)引物。上游引物：5′-CATGCCATGGATATGTTTTCACATCTTCCCTTTGAC-3′，下游引物：5′-GCG-AGCTCTCTGATGGTTGCTCCAGAGTCC-3′，劃線部分分別為NcoⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)，引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.3 RNA提取、RT-PCR擴(kuò)增Tim-3胞外段及產(chǎn)物的克隆測(cè)序

分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，根據(jù)Trizol試劑說(shuō)明書(shū)從單個(gè)核細(xì)胞中提取總RNA。將獲得的RNA進(jìn)行RT-PCR，產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物與pMD18-T載體(TaKaRa公司)連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，氨芐西林(Amp)篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行菌液PCR、提取質(zhì)粒雙酶切鑒定，后選取陽(yáng)性克隆菌液送上海生工生物技術(shù)公司測(cè)序。其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：先95 ℃預(yù)變性5 min；后94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72℃延伸45 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

1.4 pET28a-sTim-3-EGFP重組質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建

提取測(cè)序正確的質(zhì)粒，行NcoⅠ和SacⅠ雙酶切，同時(shí)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建保存的pET28a-EGFP重組質(zhì)粒經(jīng)相同的內(nèi)切酶雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳和DNA純化回收后進(jìn)行連接反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，卡那霉素篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行菌液PCR、提取質(zhì)粒行PCR和雙酶切鑒定后選取陽(yáng)性克隆菌液送公司測(cè)序。提取測(cè)序正確的陽(yáng)性菌株質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌BL21(DE3)，并再次行PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定陽(yáng)性菌株。同時(shí)取pET28a-EGFP重組質(zhì)粒和pET28a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌BL21(DE3)作為對(duì)照。

1.5 sTim-3-EGFP重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、鑒定及條件優(yōu)化

1.5.1 誘導(dǎo)sTim-3-EGFP重組蛋白表達(dá)的IPTG濃度最佳化 熒光顯微鏡下觀察單菌落培養(yǎng)菌液，選取熒光較強(qiáng)的一管進(jìn)行后續(xù)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們先于37 ℃、225 r/min培養(yǎng)約2 h 45 min至A600 nm值達(dá)0.6左右吸取1 mL誘導(dǎo)前菌液，隨后在0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 mmol/L等不同IPTG濃度下于25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h；每管吸取2.5 μL菌液于玻片上，在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度；另每組各吸取1 mL菌液，離心棄去上清，加入160 μL PBS和40 μL 5×蛋白上樣緩沖液，吹打混勻后沸水浴5 min，行SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍(lán)染色及Western blot檢測(cè)。

1.5.2 sTim-3-EGFP重組蛋白的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)最佳化 在25 ℃、0.1 mmol/L IPTG濃度下不同時(shí)機(jī)的誘導(dǎo)表達(dá)，分別取誘導(dǎo)前、A600 nm值分別為0.23、0.36、0.50、0.64、0.81、1.02、1.18時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)6 h的菌液1 mL，離心棄去上清行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色分析。

1.5.3 sTim-3-EGFP重組蛋白的誘導(dǎo)時(shí)間及溫度最佳化 0.1 mmol/L IPTG濃度下不同時(shí)間和溫度的誘導(dǎo)表達(dá)，在25℃的誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后1、2、3、4、5、6 h，31 ℃的誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后6 h，37 ℃的誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后6 h，各吸取1 mL菌液離心棄去上清，后進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色。同時(shí)取pET28a質(zhì)粒及pET28a-EGFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 Tim-3胞外段基因的RT-PCR結(jié)果

根據(jù)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增目的基因，Tim-3胞外段片段大小約620 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳顯示，在相對(duì)于DNA Marker 500 bp與750 bp之間有一特異性擴(kuò)增條帶，分子量大小與預(yù)期相符(圖1)。

①：Tim-3胞外段基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；②：250 bp DNA Ladder Marker圖1 Tim3胞外段基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products of the extracellular domain of Tim-3 gene

2.2 重組質(zhì)粒pET28a-sTim-3-EGFP的鑒定

將擴(kuò)增產(chǎn)物sTim-3經(jīng)NcoⅠ和SacⅠ雙酶切，并用DNA純化試劑盒按廠家說(shuō)明書(shū)純化回收備用。雙酶切純化的sTim-3片段亞克隆于經(jīng)過(guò)相同內(nèi)切酶雙酶切后的pET28a-EGFP載體上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，后對(duì)單菌落培養(yǎng)菌液行sTim-3片段和EGFP片段的PCR鑒定(圖2)，可見(jiàn)2、3號(hào)管菌液鑒定陽(yáng)性；后對(duì)鑒定陽(yáng)性的2號(hào)管菌液擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行sTim-3片段PCR鑒定及雙酶切鑒定(圖3)，結(jié)果與預(yù)期相符。將2號(hào)管菌液送上海生物工程技術(shù)公司測(cè)序，序列與GenBank中序列比對(duì)一致，無(wú)突變與移位。

M：DNA Marker；①～⑤：分別對(duì)應(yīng)第1～5號(hào)管菌液的EGFP片段擴(kuò)增產(chǎn)物；⑥～⑨：分別對(duì)應(yīng)1～5號(hào)管菌液的sTim-3片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中第2、3號(hào)管菌液的sTim-3片段和EGFP片段擴(kuò)增產(chǎn)物均有目的條帶出現(xiàn)圖2 重組質(zhì)粒pET28a-sTim-3-EGFP的菌液PCR鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid pET28a-sTim-3-EGFP by bacteria liquid PCR

①：pET28a-EGFP質(zhì)粒的SacⅠ和NcoⅠ雙酶切產(chǎn)物；②：pET28a-EGFP質(zhì)粒；③：新構(gòu)建質(zhì)粒的SacⅠ和NcoⅠ雙酶切產(chǎn)物；④：提取的新構(gòu)建質(zhì)粒；⑤：新構(gòu)建質(zhì)粒的sTim-3片段圖3 重組質(zhì)粒pET28a-sTim-3-EGFP的PCR鑒定及雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET28a-sTim-3-EGFP by double restriction enzyme digestion and PCR

2.3 重組質(zhì)粒pET28a-sTim-3-EGFP在BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)、鑒定與條件優(yōu)化

2.3.1 誘導(dǎo)sTim-3-EGFP重組蛋白表達(dá)的IPTG濃度最佳化 將鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后，在不同IPTG濃度誘導(dǎo)下sTim-3-EGFP重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)在藍(lán)色激發(fā)光下菌體發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光(圖4)，SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果示重組蛋白大小與預(yù)期相符(sTim-3-EGFP融合蛋白大小理論值約為50.0 kD)；在一定范圍內(nèi)的IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)量沒(méi)有影響；同時(shí)取誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后菌液行Western blot檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果采用His標(biāo)簽單抗及EGFP單抗的驗(yàn)證均在目標(biāo)位置出現(xiàn)單一條帶(圖5)。為了減少IPTG對(duì)細(xì)菌毒性作用，確定IPTG最佳濃度為0.1 mmol/L。

2.3.2 sTim-3-EGFP重組蛋白的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)最佳化 為了找出IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的最佳時(shí)機(jī)，我們?cè)诓煌珹600 nm值進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)sTim-3-EGFP。研究發(fā)現(xiàn)在A600 nm值為0.64和0.81時(shí)重組蛋白獲得較高表達(dá)，隨著A600 nm值增加，誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后的重組蛋白略有增加，但遠(yuǎn)不如菌體自身蛋白的增加明顯(圖6)。大約在2 h 45 min即A600 nm值在0.64與0.81之間時(shí)進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)為最佳。

2.3.3 sTim-3-EGFP重組蛋白的誘導(dǎo)時(shí)間及溫度最佳化 經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)IPTG誘導(dǎo)6 h以上，蛋白表達(dá)無(wú)變化。為了找出IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的最佳溫度與誘導(dǎo)時(shí)間，我們分別進(jìn)行不同時(shí)間及溫度的誘導(dǎo)表達(dá)(圖7)，可見(jiàn)25 ℃誘導(dǎo)5 h蛋白達(dá)到最大表達(dá)量，隨時(shí)間增加表達(dá)量不再增加，不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)表達(dá)量區(qū)別不大。為了減少sTim-3-EGFP重組蛋白的降解，確定IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的最佳溫度與誘導(dǎo)時(shí)間為25 ℃誘導(dǎo)5 h。

圖4 熒光顯微鏡觀察sTim-3-EGFP融合蛋白的表達(dá)(×400)Fig.4 Microscopic evaluation of sTim-3-EGFP fusion protein expression(×400)

A：SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色；①：蛋白Marker；②～⑨：pET28a-sTim-3-EGFP重組質(zhì)粒組誘導(dǎo)前及0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 mmol/L的IPTG濃度下28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h；⑩：pET28a空質(zhì)粒對(duì)照組。B：采用His標(biāo)簽單抗及EGFP單抗對(duì)重組蛋白進(jìn)行的驗(yàn)證圖5 不同IPTG濃度誘導(dǎo)下蛋白的表達(dá)及Western blot驗(yàn)證Fig.5 Expression of sTim-3-EGFP protein induced by different concentrations of IPTG and identification by Western blotting

①：蛋白Marker；②：pET28a-sTim-3-EGFP重組質(zhì)粒組誘導(dǎo)前(A600 nm值為0.64)；③～⑨：A600 nm值分別為0.23、0.36、0.50、0.64、0.81、1.02、1.18時(shí)25 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)6 h；⑩：pET28a空質(zhì)粒對(duì)照組圖6 SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)不同時(shí)機(jī)誘導(dǎo)的重組蛋白表達(dá)Fig.6 Determination of expression of sTim-3-EGFP fusion protein with respect to different A600 nmvalues by SDS-PAGE electrophoresis and coomassie brilliant blue staining

①：蛋白Marker；②：pET28a-sTim-3-EGFP重組質(zhì)粒組誘導(dǎo)前；③～⑧：25℃誘導(dǎo)后1、2、3、4、5、6 h；⑨：31℃誘導(dǎo)后6 h；⑩：37℃誘導(dǎo)后6 h圖7 SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)不同誘導(dǎo)時(shí)間和溫度下的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.7 Determination of expression of sTim-3-EGFP fusion protein with respect to different induction time and temperature by SDS-PAGE electrophoresis and coomassie brilliant blue staining

3 討論

Tim-3是在多種免疫細(xì)胞上表達(dá)的一種跨膜蛋白，在機(jī)體的固有免疫和特異性免疫應(yīng)答方面都起著重要的調(diào)節(jié)作用。由于Tim-3在多種類型疾病的免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，尤其是在腫瘤免疫治療領(lǐng)域作為治療靶點(diǎn)的潛在意義巨大，因此Tim-3的研究成為近幾年的研究熱點(diǎn)。作為一種負(fù)性免疫調(diào)節(jié)分子，Tim-3與配體Gal-9的結(jié)合產(chǎn)生的信號(hào)可以阻止Th1細(xì)胞的激活而負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能，阻斷或增加這一結(jié)合有望改變與Th1/Th2比例失衡相關(guān)疾病的發(fā)展方向。Tim-3與Ceacam-1的相互作用被證明可以導(dǎo)致T細(xì)胞對(duì)各類疾病產(chǎn)生免疫耐受[10]，這在自身免疫性疾病中具有積極的作用，而在癌癥的發(fā)展過(guò)程中卻存在消極影響。而Tim-3與這些配體結(jié)合發(fā)生作用的具體下游信號(hào)傳導(dǎo)通路尚需深入研究。

作為與PD-1、CTLA-4相似的分子，Tim-3已成為免疫治療與藥物研發(fā)領(lǐng)域熱門的靶點(diǎn)分子。在腫瘤免疫治療領(lǐng)域，以PD-1/PD-L1為靶點(diǎn)的單抗已經(jīng)應(yīng)用于臨床，對(duì)黑色素瘤及非小細(xì)胞肺癌等實(shí)體瘤顯示出良好的療效，但仍有很多患者對(duì)于這一治療無(wú)響應(yīng)。而實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，抗Tim-3單抗和抗PD-1藥物聯(lián)合使用比單獨(dú)使用抗Tim-3或抗PD-1可以起到更好的抗腫瘤效果。其他的研究也顯示抗Tim-3與抗CTLA-4的組合使用可以提高抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤消退[11-12]；其中的一項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)抗Tim-3治療與立體定向放射外科(stereotactic radiosurgery，SRS)聯(lián)合應(yīng)用或抗Tim-3與抗PD-1的聯(lián)合應(yīng)用相比單獨(dú)的抗Tim-3治療能夠改善患膠質(zhì)瘤小鼠的存活，而3種治療方法的結(jié)合可以達(dá)到100%的總生存率[12]。另外，最近的研究顯示Tim-3阻斷和絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK)抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用能夠增強(qiáng)對(duì)黑色素瘤的療效[13]。這些研究提示針對(duì)Tim-3與其他免疫檢查點(diǎn)進(jìn)行腫瘤治療可能具有重要作用，并有巨大的應(yīng)用潛力。

目前已知序列基因組中膜蛋白占所有開(kāi)放閱讀框中的20%～25%，在疾病中起重要作用[14]。而且，所有藥物靶標(biāo)約有70%是膜蛋白[15]。然而，由于其本身含量低，膜蛋白常常很難分離足夠量的天然蛋白質(zhì)。Tim-3作為一種膜蛋白，在真核細(xì)胞中的表達(dá)量很低，使其功能研究受到了很大的限制。Tim-3可溶性形式(sTim-3)的發(fā)現(xiàn)，也尚有待更深入的研究。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用pET28a作為表達(dá)載體對(duì)sTim-3進(jìn)行高效表達(dá)，同時(shí)引入EGFP標(biāo)簽以監(jiān)測(cè)可溶性蛋白的表達(dá)，以獲得高豐度且具有較多可溶性的sTim-3-EGFP重組蛋白。因?yàn)楸Ａ袅薈端的His標(biāo)簽，可以很方便地采用Ni-NTA(或Ni-IDA)親和層析介質(zhì)進(jìn)行蛋白純化和后續(xù)功能研究?？紤]到外源基因的異源表達(dá)受多種因素的影響，我們對(duì)IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白的表達(dá)量影響不大，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)時(shí)間可能是影響重組蛋白在大腸埃希菌中表達(dá)的最重要因素。但過(guò)高濃度的IPTG對(duì)細(xì)菌有潛在的毒性，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)我們采用了較低濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。溫度雖然對(duì)蛋白的最大表達(dá)量影響不大，但溫度高時(shí)大腸埃希菌表達(dá)的異源蛋白容易被降解，同時(shí)較高溫度下重組蛋白的高速表達(dá)不利于蛋白的正確折疊，易產(chǎn)生不具有生物活性的不可溶性形式(包涵體表達(dá))，而包涵體純化后的復(fù)性較為復(fù)雜且不能確保復(fù)性成功，故我們建議盡可能采用低溫誘導(dǎo)。誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的探索中，我們發(fā)現(xiàn)在A600 nm值約為0.6～0.8時(shí)重組蛋白可獲得較高表達(dá)，隨著A600 nm值繼續(xù)增加，誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后重組蛋白的增加遠(yuǎn)不如因A600 nm值增加導(dǎo)致的菌體自身蛋白的增加明顯，不利于后續(xù)的蛋白純化，建議培養(yǎng)至此范圍時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)。綜上，sTim-3-EGFP重組蛋白最佳誘導(dǎo)條件為：A600 nm值約為0.6～0.8時(shí)，用0.1 mmol/L IPTG在25 ℃誘導(dǎo)約5 h。

總之，我們成功構(gòu)建pET28a-sTim-3-EGFP表達(dá)載體，在C末端引入EGFP標(biāo)簽以監(jiān)測(cè)sTim-3的可溶性表達(dá)，EGFP下游的His6標(biāo)簽便于Ni-NTA純化。并且對(duì)sTim-3-EGFP原核表達(dá)的最佳條件進(jìn)行摸索，為sTim-3-EGFP純化和功能研究及臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

[1] McIntire J J，Umetsu S E，Akbari O，et al.Identification of Tapr(an airway hyperreactivity regulatory locus)and the linked Tim gene family[J].Nat Immunol，2001，2(12)：1109-1116.

[2] Lee J，Phong B，Egloff A M，et al.TIM polymorphisms--genetics and function[J].Genes Immun，2011，12(8)：595-604.

[3] Sabatos C A，Chakravarti S，Cha E，et al.Interaction of Tim-3 and Tim-3 ligand regulates T helper type 1 responses and induction of peripheral tolerance[J].Nat Immunol，2003，4(11)：1102-1110.

[4] Moller-Hackbarth K，Dewitz C，Schweigert O，et al.A disintegrin and metalloprotease(ADAM)10 and ADAM17 are major sheddases of T cell immunoglobulin and mucin domain 3(Tim-3)[J].J Biol Chem，2013，288(48)：34529-34544.

[5] Monney L，Sabatos C A，Gaglia J L，et al.Th1-specific cell surface protein Tim-3 regulates macrophage activation and severity of an autoimmune disease[J].Nature，2002，415(6871)：536-541.

[6] Rodriguez-Manzanet R，DeKruyff R，Kuchroo V K，et al.The costimulatory role of TIM molecules[J].Immunol Rev，2009，229(1)：259-270.

[7] Han G，Chen G，Shen B，et al.Tim-3：an activation marker and activation limiter of innate immune cells[J].Front Immunol，2013，4：449.

[8] Zhu C，Anderson A C，Schubart A，et al.The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates T helper type 1 immunity[J].Nat Immunol，2005，6(12)：1245-1252.

[9] Qing J，Xiao H，Zhao L，et al.Construction and characterization of an enhanced GFP-tagged TIM-1 fusion protein[J].J Microbiol Biotechnol，2014，24(4)：568-576.

[10] Huang Y H，Zhu C，Kondo Y，et al.CEACAM1 regulates TIM-3-mediated tolerance and exhaustion[J].Nature，2015，517(7534)：386-390.

[11] Liu J，Zhang S，Hu Y，et al.Targeting PD-1 and Tim-3 pathways to reverse CD8 T-cell exhaustion and enhanceexvivoT-cell responses to autologous dendritic/tumor vaccines[J].J Immunother，2016，39(4)：171-180.

[12] Kim J E，Patel M A，Mangraviti A，et al.Combination therapy with anti-PD-1，anti-TIM-3，and focal radiation results in regression of murine gliomas[J].Clin Cancer Res，2017，23(1)：124-136.

[13] Liu Y，Cai P，Wang N，et al.Combined blockade of Tim-3 and MEK inhibitor enhances the efficacy against melanoma[J].Biochem Biophys Res Commun，2017，484(2)：378-384.

[14] Tan S，Tan H T，Chung M C.Membrane proteins and membrane proteomics[J].Proteomics，2008，8(19)：3924-3932.

[15] Lundstrom K.Structural genomics and drug discovery[J].J Cell Mol Med，2007，11(2)：224-238.

(2017-03-08 收稿)

Construction and Optimized Expression of Recombinant Human sTim-3-EGFP Fusion Protein

Bai Shaoyun1，Qing Jilin2，Liu Zhen1etal

1DepartmentofNeurosurgery，theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China2DepartmentofGynecology，ThePeople’sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion，Nanning530021，China

Objective To construct and optimize the condition for inducing expression of recombinant human sTim-3-EGFP inE.coli.Methods Total RNA was extracted from peripheral blood of healthy people.The extracellular fragment of human Tim-3 gene was amplified by RT-PCR and cloned into the constructed prokaryotic expression vector pET28a-EGFP，and identified by PCR，double digestion and sequencing.The recombinant plasmid was transformed into BL21(DE3)to optimize protein expression by adjusting IPTG concentration，induction starting time，induction temperature and induction expression time.Results The prokaryotic expression vector pET28a-sTim-3-EGFP was successfully constructed and transformed into BL21(DE3)for expression.The temperature and IPTG concentration had little effect on the protein expression.When theA600 nmvalue was about 0.6-0.8，temperature 25°C and induction time 5 h，higher protein expression could be obtained.Conclusion The human sTim-3-EGFP is successfully constructed and expressedinvitro.This study provides a good experimental basis for further purification，production and application of Tim-3.

T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3； prokaryotic expression； enhanced green fluorescent protein； fusion protein

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81260007)；廣西衛(wèi)生廳課題資助項(xiàng)目(No.Z2012316)

R

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.007

白少云，男，1988年生，碩士研究生，E-mail：baishaoyun1988@126.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：neurosurgui@vip.163.com(譚源福)；E-mail：tjchenzz@126.com(陳治中)