長(zhǎng)鏈非編碼RNA-HOTAIR對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響*

呂 峰， 孔舒欣， 于 洋， 梁 棟， 張 斌

河南省人民醫(yī)院乳腺外科，鄭州 450003

長(zhǎng)鏈非編碼RNA-HOTAIR對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響*

呂 峰， 孔舒欣， 于 洋， 梁 棟， 張 斌△

河南省人民醫(yī)院乳腺外科，鄭州 450003

目的 檢測(cè)乳腺癌腫瘤組織中HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)的表達(dá)，并觀察HOTAIR對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。方法 應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)32對(duì)乳腺癌患者的腫瘤組織和癌旁正常組織中HOTAIR的表達(dá)差異；通過慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)HOTAIR的MCF-7細(xì)胞株，Transwell檢測(cè)高表達(dá)HOTAIR對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化， Western blot法檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白的變化。裸鼠尾靜脈注射HOTAIR高表達(dá)的MCF-7細(xì)胞，觀察肝臟轉(zhuǎn)移瘤的形成。結(jié)果 在32對(duì)乳腺癌臨床標(biāo)本中，有24例腫瘤組織中HOTAIR的表達(dá)高于癌旁正常組織；MCF-7高表達(dá)HOTAIR后，細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，細(xì)胞發(fā)生EMT為特征的形態(tài)學(xué)變化，EMT相關(guān)的E-cadherin表達(dá)降低，而Vimentin及Slug的表達(dá)升高。高表達(dá)HOTAIR的MCF-7細(xì)胞肝臟轉(zhuǎn)移瘤成瘤能力更強(qiáng)。結(jié)論 乳腺癌臨床標(biāo)本中HOTAIR的表達(dá)增高，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中高表達(dá)HOTAIR可誘使其發(fā)生EMT，并促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA； HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA； 乳腺癌； 侵襲轉(zhuǎn)移； 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200 nt的RNA，其本身雖然不編碼蛋白，但能以轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳學(xué)修飾、蛋白降解等多種形式調(diào)控基因的表達(dá)[1]。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)存在于HOX基因中，是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的lncRNA。既往研究證實(shí)HOTAIR在鼻咽癌、惡性淋巴瘤、肝細(xì)胞癌等多種腫瘤中表達(dá)異常，并參與腫瘤的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移等[2-4]。但HOTAIR在乳腺癌中的表達(dá)及功能尚不完全清楚，本文旨在研究HOTAIR對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

32對(duì)乳腺癌臨床標(biāo)本由河南省人民醫(yī)院乳腺外科于手術(shù)中取得，每對(duì)標(biāo)本中包括乳腺癌腫瘤組織及腫瘤旁正常組織，標(biāo)本取得前獲患者及家屬同意，并簽署知情同意書。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購(gòu)于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)公司，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃、5%二氧化碳溫箱內(nèi)?？笶-cadherin抗體(CST，No.3195)、抗Vimentin抗體(CST，No.5741)、抗Snail抗體(CST，No.3879)、抗Slug抗體(CST，No.9585)、抗Zeb1抗體(CST，No.3396)及抗內(nèi)參GAPDH抗體(CST，No.5174)、預(yù)鋪好Matrigel的Transwell(8 μm孔徑)等均購(gòu)自武漢啟動(dòng)子生物有限公司。PCR引物(由廣州銳博生物有限公司設(shè)計(jì)并合成)：HOTAIR上游引物 5′-GGAGTGAGTCCCATCCATCT-3′，下游引物5′-TGCCCAATGGTACTACAGAAG-AT-3′；U6上游引物5′-GACAAGCCCTACCTACAG-3′，下游引物5′-GATGATACAGTACAA-GTCGC-3′。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

共分為3組，分別為穩(wěn)定高表達(dá)HOTAIR的MCF-7細(xì)胞株(HOTAIR)、感染對(duì)照空病毒的MCF-7細(xì)胞株(Vector)及未處理原始MCF-7細(xì)胞株(Blank)。穩(wěn)定細(xì)胞系均由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，病毒感染MCF-7細(xì)胞株24 h后換液，并加入濃度為1 μg/mL的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定株，2周后進(jìn)行凍存保種。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR) 檢測(cè)

剪碎腫瘤組織及腫瘤旁正常組織或收集各組MCF-7細(xì)胞，利用Trizol法提取組織或細(xì)胞的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，No.K1633)將RNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA文庫(kù)，之后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(Fermentas，No.K2190)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)擴(kuò)增3 min； 95℃ 1 min，57℃ 30 s，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，機(jī)型為ABI7300熒光定量PCR儀。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算細(xì)胞中HOTAIR的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 侵襲能力實(shí)驗(yàn)

收集各組MCF-7細(xì)胞，重懸于無血清RPMI-1640培養(yǎng)液，細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)細(xì)胞并將各組細(xì)胞稀釋為相同密度；Transwell小室下室內(nèi)每孔加入約500 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液，上室內(nèi)先每孔加入10 μL的Matrigel，并置于37℃溫箱孵育30 min，待Matrigel完全凝固后，再每孔加入5×105細(xì)胞混懸液，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)液上清，加入足量多聚甲醛固定細(xì)胞，以0.01%結(jié)晶紫行細(xì)胞染色，最終在光學(xué)顯微鏡(20×10倍)下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞數(shù)平均值，每組樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，相同獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將各組處理后的MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，將6孔板置于倒置光學(xué)顯微鏡下，觀察MCF-7細(xì)胞在高表達(dá)HOTAIR后的形態(tài)學(xué)變化并拍照。

1.7 免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)

收集各組處理后的MCF-7細(xì)胞，加入適量NP-40全細(xì)胞蛋白裂解液，獲取細(xì)胞總蛋白樣品，BCA法測(cè)定各裂解液的蛋白濃度，加入適量SDS-loading buffer在100℃水浴鍋中孵育10 min，后行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，PVDF膜濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，并用5%BSA溶液封閉30 min后，分別孵育E-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、Zeb1及GAPDH一抗及二抗，最后用ECL顯色液化學(xué)法顯影。

1.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

以穩(wěn)定高表達(dá)HOTAIR的MCF-7細(xì)胞株(HOTAIR)和感染對(duì)照空病毒的細(xì)胞株(Vector)為工具，以裸鼠為動(dòng)物對(duì)象，通過尾靜脈注射細(xì)胞103個(gè)/只，8周后脫頸法處死小鼠，解剖分離肝臟，通過肉眼計(jì)數(shù)肝臟轉(zhuǎn)移灶(metastasis clone formation)及肝臟組織切片蘇木精-伊紅染色計(jì)數(shù)微小轉(zhuǎn)移灶(micrometastasis formation)，比較HOTAIR對(duì)MCF-7腫瘤細(xì)胞肝臟轉(zhuǎn)移能力的影響。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOTAIR在乳腺癌臨床標(biāo)本中表達(dá)增加

通過Real-time PCR檢測(cè)32對(duì)乳腺癌腫瘤組織及對(duì)應(yīng)相鄰正常組織中HOTAIR的表達(dá)，利用U6作為內(nèi)參，結(jié)果提示在其中24例標(biāo)本中，腫瘤組織中的HOTAIR的表達(dá)高于相鄰正常組織(圖1)。

2.2 HOTAIR穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功

在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中通過慢病毒感染獲得穩(wěn)定高表達(dá)HOTAIR的細(xì)胞株，該細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室既往構(gòu)建。通過Real-time PCR檢測(cè)MCF-7中HOTAIR的表達(dá)，結(jié)果提示穩(wěn)定細(xì)胞中HOTAIR的表達(dá)較對(duì)照組升高17倍(t=10.735，P<0.05)，證明HOTAIR穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功(圖2)。

圖1 HOTAIR在乳腺癌臨床標(biāo)本中高表達(dá)Fig.1 Up-regulated expression of HOTAIR in breast cancer tissues

2.3 高表達(dá)HOTAIR可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的侵襲

Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力結(jié)果提示：Vector對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為(32±8)個(gè)/視野，高表達(dá)HOTAIR組為 (122±7)個(gè)/視野，穿膜細(xì)胞數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.359，P<0.05)，見圖3。

圖2 構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)HOTAIR的MCF-7細(xì)胞株Fig.2 Construction of high HOTAIR expression MCF-7 cell line

2.4 高表達(dá)HOTAIR可使MCF-7細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化

將各組MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中48 h后，用普通光學(xué)顯微鏡觀察。結(jié)果提示：MCF-7細(xì)胞高表達(dá)HOTAIR后，與對(duì)照組相比，發(fā)生明顯的EMT變化，如細(xì)胞變長(zhǎng)呈梭形，偽足變長(zhǎng)且數(shù)目增多，細(xì)胞間有較大的間隙等，而感染對(duì)照空病毒及未感染的細(xì)胞形態(tài)學(xué)沒有明顯變化(圖4)。

圖3 高表達(dá)HOTAIR促進(jìn)MCF-7的侵襲能力(×200)Fig.3 High expression of HOTAIR promotes MCF-7 cell invasion(×200)

圖4 高表達(dá)HOTAIR促進(jìn)MCF-7發(fā)生細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(×200)Fig.4 High expression of HOTAIR promotes the morphological changes of MCF-7 cells(×200)

2.5 高表達(dá)HOTAIR可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞發(fā)生EMT

Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高表達(dá)HOTAIR細(xì)胞中E-cadherin的蛋白表達(dá)明顯下降，Vimentin的表達(dá)明顯上升，前者是上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，而后者是間質(zhì)來源細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白；Snail、Slug及Zeb1均為細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)重要的轉(zhuǎn)錄因子，檢測(cè)結(jié)果顯示，高表達(dá)HOTAIR細(xì)胞中Slug的表達(dá)水平明顯上升，而Snail及Zeb1的表達(dá)水平無變化(圖5)。

圖5 高表達(dá)HOTAIR誘導(dǎo)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)改變Fig.5 High expression of HOTAIR induces changes of EMT-related protein expression

2.6 高表達(dá)HOTAIR可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞肝臟轉(zhuǎn)移瘤的形成

將高表達(dá)HOTAIR的細(xì)胞株及感染對(duì)照空病毒的細(xì)胞株分別注射于裸鼠尾靜脈中，8周后觀察肝臟形成的轉(zhuǎn)移灶(圖6)。結(jié)果提示：高表達(dá)HOTAIR細(xì)胞株形成肉眼可見轉(zhuǎn)移灶的比例(5/10)高于對(duì)照組(1/10)；形成微小轉(zhuǎn)移灶的比例(10/10)也高于對(duì)照組(4/10)。

A：肝臟轉(zhuǎn)移灶大體觀；B：顯微鏡下觀察正常肝組織(左)及轉(zhuǎn)移灶(右)(蘇木精-伊紅染色，×200)圖6 高表達(dá)HOTAIR促進(jìn)肝臟轉(zhuǎn)移瘤形成Fig.6 High expression of HOTAIR promotes liver metastasis

3 討論

隨著人類基因組計(jì)劃的完成和近年來高通量新一代測(cè)序技術(shù)的普及，人們發(fā)現(xiàn)基因組中包含大約20 000個(gè)蛋白編碼基因，約占基因組的5%左右，另外95%的序列均為非編碼RNAs(non-coding RNAs，ncRNAs)[5]。ncRNAs根據(jù)其核苷酸片段的長(zhǎng)度，大致分為lncRNA(長(zhǎng)鏈非編碼RNA)及microRNA(微小RNA)，近年來對(duì)microRNA的研究表明，其可以通過一系列的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與蛋白質(zhì)的翻譯[6-7]，而針對(duì)lncRNA的研究較少。lncRNA不同于microRNA，其可以通過多種方式參與細(xì)胞的生物學(xué)功能調(diào)控，如表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄前調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等等[5]。

HOTAIR作為第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的lncRNA，針對(duì)其功能的研究較多，且多半集中于其在各種腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR不僅在鼻咽癌、肝細(xì)胞癌及前列腺癌等多種上皮來源實(shí)體腫瘤中表達(dá)升高，在惡性淋巴瘤、白血病等間葉組織來源腫瘤中也具有一定的作用。一般來說，高表達(dá)HOTAIR能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞增殖，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的局部浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力，并且能夠減低腫瘤細(xì)胞對(duì)各種細(xì)胞周期毒性化療藥物的敏感性，這些提示HOTAIR在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要的角色[2-4]。在乳腺癌的研究中亦有報(bào)道HOTAIR可以增強(qiáng)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞放療抵抗，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)在體外高表達(dá)HOTAIR能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖[8-9]。本文針對(duì)HOTAIR在乳腺癌中的表達(dá)及功能做了進(jìn)一步的體外和體內(nèi)研究。

我們首先在乳腺癌臨床標(biāo)本中檢測(cè)HOTAIR的表達(dá)差異，結(jié)果表明，相對(duì)于腫瘤旁的正常組織，腫瘤內(nèi)HOTAIR的表達(dá)更高，這提示HOTAIR有可能參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步，我們?cè)隗w外傳代培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中，通過慢病毒感染構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)HOTAIR的細(xì)胞株，觀察并驗(yàn)證HOTAIR的功能。Transwell是檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的常用實(shí)驗(yàn)方法，Matrigel形成的膜性結(jié)構(gòu)與體內(nèi)腫瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)需要通過的組織、血管基底細(xì)胞膜相類似，我們發(fā)現(xiàn)，MCF-7細(xì)胞高表達(dá)HOTAIR后，MCF-7細(xì)胞的穿膜個(gè)數(shù)增加，該體外實(shí)驗(yàn)表明，高表達(dá)HOTAIR能夠促進(jìn)細(xì)胞的侵襲能力。

為了探索HOTAIR促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的具體機(jī)制，我們?cè)陲@微鏡下觀察高表達(dá)HOTAIR后MCF-7的細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果提示MCF-7細(xì)胞高表達(dá)HOTAIR后，與對(duì)照組相比，發(fā)生明顯的EMT變化，如細(xì)胞變長(zhǎng)呈梭形，偽足變長(zhǎng)且數(shù)目增多，細(xì)胞間有較大的間隙等，而感染對(duì)照空病毒及未感染的細(xì)胞形態(tài)學(xué)沒有明顯變化。EMT是一種重要的生物學(xué)效應(yīng)，一般認(rèn)為在胚胎發(fā)育及器官形成中發(fā)揮著重要的功能。近年來研究表明，EMT是上皮來源腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一種細(xì)胞學(xué)機(jī)制[10]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，細(xì)胞間的黏連性降低，細(xì)胞間的接觸抑制減弱，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及受募集因子影響的能力增加，從而為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。我們通過免疫印跡法檢測(cè)高表達(dá)HOTAIR后對(duì)MCF-7細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin、Snail、Slug及Zeb1等EMT相關(guān)的主要蛋白水平的影響，結(jié)果提示，上皮標(biāo)志E-cadherin表達(dá)降低，間質(zhì)標(biāo)志Vimentin表達(dá)增高；在Snail及Zeb1沒有明顯變化的同時(shí)，Slug的表達(dá)明顯增加，而后者是細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)表達(dá)變化的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，提示HOTAIR可能通過調(diào)控Slug進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌EMT及侵襲轉(zhuǎn)移。最后我們?cè)诼闶蟮霓D(zhuǎn)移瘤模型中驗(yàn)證了上述結(jié)果，證實(shí)高表達(dá)HOTAIR可以促進(jìn)肝臟轉(zhuǎn)移瘤形成。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌臨床標(biāo)本中HOTAIR的表達(dá)增高，在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中高表達(dá)HOTAIR，細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，并發(fā)生類似EMT的形態(tài)學(xué)變化及蛋白表達(dá)改變。在高表達(dá)HOTAIR后Slug的表達(dá)明顯上升，提示Slug可能作為主要調(diào)控因子參與HOTAIR介導(dǎo)的EMT改變。但HOTAIR如何調(diào)控Slug的蛋白表達(dá)，通過何種具體的分子生物學(xué)機(jī)制尚待闡明，也是我們進(jìn)一步的研究?jī)?nèi)容。本文提示HOTAIR可能參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，為乳腺癌的臨床治療提供了新的藥物靶點(diǎn)及監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

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(2017-03-06 收稿)

Effect of HOTAIR on Invasion and Metastasis of Breast Cancer MCF-7 Cells

Lv Feng，Kong Shuxin，Yu Yangetal

DepartmentofBreastSurgery，HenanProvincialPeople’sHospital，Zhengzhou450003，China

Objective To test the expression of HOTAIR in the human breast cancer tissues，and to observe the effect of HOTAIR on the invasion and metastasis of breast cancer cell line MCF-7.Methods Total RNA from the breast cancer tissues and paracancerous normal tissues of 32 patients with breast cancer was prepared respectively，and the expression of HOTAIR was tested by real time PCR.MCF-7 cells were transfected with lentivirus，and then HOTAIR was stably and highly expressed.Effect of high HOTAIR expression on invasion of MCF-7 cells was detected by Transwell assay.The change of cell morphology was observed by optical microscope.The expression of epithelial-mesenchymal transition(EMT)related protein was detected by Western blotting.The cells highly expressing HOTAIR were injected into the tail vein of nude mice to observe formation of liver metastasis tumor. Results In all 32 pairs of breast cancer samples，the expression of HOTAIR was higher in tumor tissues than in the paracancerous normal tissues of 24 patients.The invasion of MCF-7 cells was enhanced after HOTAIR overexpression，with cell morphology changes，and the expression of E-cadherin was depressed，with elevation of Vimentin and Slug，which are related to the progress of EMT.The cells highly expressing HOTAIR had a better ability of formation of liver metastasis tumor.Conclusion The expression of HOTAIR is elevated in breast cancer，and the high expression of HOTAIR can induce EMT，and enhance the invasion and metastasis of MCF-7 cells.

long non-coding RNA； HOTAIR； breast cancer； invasion and metastasis； epithelial-mesenchymal transition

*河南省科技廳基金資助項(xiàng)目(No.152300410153)

R737.9

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.006

呂 峰，男，1978年生，主任醫(yī)師，E-mail：fenglv1978@gmail.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：9362159@qq.com