正交試驗優(yōu)選養(yǎng)血接骨膠囊的水提工藝Δ

甄小龍，侯守謙，竇 霞（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥炮制及質(zhì)控工程技術(shù)研究中心，蘭州 73000；.甘肅省康縣中醫(yī)院中醫(yī)骨病骨科，甘肅隴南 746500）

正交試驗優(yōu)選養(yǎng)血接骨膠囊的水提工藝Δ

甄小龍1＊，侯守謙2，竇 霞1#（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥炮制及質(zhì)控工程技術(shù)研究中心，蘭州 730020；2.甘肅省康縣中醫(yī)院中醫(yī)骨病骨科，甘肅隴南 746500）

目的：優(yōu)選養(yǎng)血接骨膠囊水提工藝。方法：以加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)為考察因素，以阿魏酸含量、淫羊藿苷含量和得膏率的綜合評分為考察指標(biāo)，采用正交試驗優(yōu)選養(yǎng)血接骨膠囊的最佳水提工藝并進行驗證試驗。結(jié)果：養(yǎng)血接骨膠囊最優(yōu)提取工藝為加10倍量水提取3次，每次1 h；驗證試驗中阿魏酸、淫羊藿苷含量分別為0.38、1.23mg/g（n＝3），得膏率為28.2%（n＝3），綜合評分為97.11（RSD＝2.77%，n＝3）。結(jié)論：優(yōu)選的提取工藝簡便可行、方法準(zhǔn)確可靠，可用于養(yǎng)血接骨膠囊的提取制備。

養(yǎng)血接骨膠囊；正交試驗；水提工藝

養(yǎng)血接骨膠囊是甘肅省康縣中醫(yī)院根據(jù)多年臨床驗方開發(fā)研制的中藥制劑，目前已完成工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，正在申請院內(nèi)制劑批準(zhǔn)文號。該藥處方由當(dāng)歸、骨碎補、淫羊藿、川續(xù)斷、脆蛇、土鱉蟲等12味中藥組成，共奏補益肝腎、通筋活絡(luò)、接骨續(xù)筋、散瘀消腫之功，臨床可達到止痛、活血、促進骨折愈合的作用[1]。方中當(dāng)歸補血、活血、行血，淫羊藿補肝腎、強筋骨，還可提高骨細胞的活性和數(shù)量、促進骨基質(zhì)鈣化、加速骨痂改造，從而促進骨折愈合[2]，二藥共為君藥。藥理研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸中的主要成分阿魏酸能夠抑制血小板的凝聚，從而達到活血的作用[3-4]；淫羊藿的主要藥效成分為黃酮類；骨碎補主要含黃酮、三萜、酚酸及其苷類成分；川續(xù)斷主要含三萜皂苷類。因為方中藥物的主要化學(xué)成分大多溶于水，根據(jù)處方中各味藥的性質(zhì)及有效成分的藥理活性，確定除脆蛇、土鱉蟲等5味藥部分打粉外，其余藥物均采用水提工藝制備。為更好地控制養(yǎng)血接骨膠囊的質(zhì)量，本研究以方中君藥當(dāng)歸和淫羊藿的主要成分阿魏酸、淫羊藿苷的含量以及得膏率的綜合評分為評價指標(biāo)，采用正交試驗對其水提工藝進行優(yōu)化，為該制劑的制備提供可靠的參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AD高效液相色譜（HPLC）儀，包括SIL-20A自動進樣器、SPD-M 20A二極管陣列檢測器、HP-1真空脫氣機、CTO-20ASUP柱溫箱等（日本島津公司）；BP210S電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品、藥材與試劑

阿魏酸對照品（批號：110773-201313，純度：＞98%）、淫羊藿苷對照品（批號：110737-201302，純度：＞98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；當(dāng)歸、骨碎補、淫羊藿、川續(xù)斷、脆蛇、土鱉蟲等12味藥材均購于蘭州市安泰堂中藥飲片有限公司，經(jīng)全檢，均符合2015年版《中國藥典》（一部）相關(guān)規(guī)定；乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 水提液的制備

按處方比例稱取藥材，共計123.5 g，加入一定量水提取，濾過，濃縮至250m L，備用。

2.2 阿魏酸含量測定

2.2.1 對照品貯備液的制備 精密稱取干燥至恒質(zhì)量的阿魏酸對照品11.5mg，置于100m L量瓶中，加甲醇溶解，定容，即得質(zhì)量濃度為115μg/m L的對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取“2.1”項下水提液5m L，置于25m L量瓶中，加入甲醇約15m L，超聲處理5min，放冷，甲醇定容，0.45μm濾膜濾過，即得。

2.2.3 當(dāng)歸陰性對照液的制備 按“2.1”項下方法制備除當(dāng)歸藥材外的其他藥材的水提液，按“2.2.2”項下方法制備，即得當(dāng)歸陰性對照液。

2.2.4 色譜條件 色譜柱：Thermo Hypersil Gold-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸（15∶85，V/V）[5-6]；流速：1.0m L/min；檢測波長：316 nm；柱溫：30；進樣量：10μL。在上述色譜條件下，取“2.2.1”“2.2.2”項下溶液進樣測定，結(jié)果，理論板數(shù)（按阿魏酸計）≥3 000，分離度＞1.5。色譜圖見圖1。

圖1 阿魏酸的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram sof ferulic acid

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項下對照品貯備液1、4、8、10、25m L，置于25m L量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得系列對照品溶液。分別精密吸取系列對照品溶液10μL進樣測定，以阿魏酸的質(zhì)量濃度（μg/m L）為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進行線性回歸，得回歸方程為y＝9 323.2x+7 006.6（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，阿魏酸在4.6～115μg/m L范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收試驗 按照相關(guān)方法進行操作。結(jié)果，精密度試驗峰面積的RSD為0.80%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗峰面積的RSD為1.38%（n＝6）；重復(fù)性試驗峰面積的RSD為1.48%（n＝6）；加樣回收率為96.1%～100.4%，平均值為98.7%（RSD＝1.71%，n＝6）。

2.2.7 樣品測定 按照“2.2.4”項下色譜條件，分別取對照品溶液（36.8μg/m L）及供試品溶液各10μL，進樣測定，記錄峰面積，計算樣品中阿魏酸含量。

2.3 淫羊藿苷含量測定

2.3.1 對照品貯備液的制備 精密稱取干燥至恒質(zhì)量的淫羊藿苷對照品10.8mg，置于100m L量瓶中，甲醇溶解、定容，即得質(zhì)量濃度為108μg/m L的對照品貯備液。2.3.2 供試品溶液的制備 分別精密量取“2.1”項下水提液5m L，置于50m L量瓶中，加入甲醇約40m L，超聲處理5m in，放冷，甲醇定容，0.45μm濾膜濾過，即得。

2.3.3 淫羊藿苷陰性對照液的制備 按“2.1”項下方法制備除淫羊藿藥材外的其他藥材水提液，按“2.3.2”項下方法制備，即得淫羊藿苷陰性對照液。

2.3.4 色譜條件 色譜柱：Thermo Hypersil Gold-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（25∶75，V/V）[7]；流速：1.0m L/m in；檢測波長：270 nm；柱溫：30；進樣量：10μL。在此色譜條件下，取“2.3.1”“2.3.2”項下溶液進樣測定，結(jié)果，理論板數(shù)（按淫羊藿苷峰計）≥3 000，分離度＞1.5。色譜圖見圖2。

圖2 淫羊藿苷的高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chrom atogram sof icariin

2.3.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.3.1”項下對照品貯備液2、4、8、10、25m L，置于25m L量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得系列對照品溶液。分別精密吸取系列對照品溶液10μL進樣測定，以淫羊藿苷的質(zhì)量濃度（μg/m L）為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進行線性回歸，得回歸方程為y＝326.6x+128.2（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，淫羊藿苷在8.64～108μg/m L范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.6 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收試驗 按照相關(guān)方法進行操作。結(jié)果，精密度試驗峰面積的RSD為0.65%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗峰面積的RSD為1.22%（n＝6）；重復(fù)性試驗峰面積的RSD為1.89%（n＝6）；加樣回收率為95.7%～99.1%，平均值為97.0%（RSD＝1.18%，n＝6）。

2.3.7 樣品測定 按“2.3.4”項下色譜條件，分別取對照品溶液（43.2μg/m L）及供試品溶液各10μL，進樣測定，記錄峰面積，計算樣品中淫羊藿苷含量。

2.4 得膏率測定

精密吸取“2.1”項下水提液25m L，置于干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計算得膏率[得膏率（%）＝干膏質(zhì)量/水提液質(zhì)量×100%]。

2.5 正交試驗優(yōu)選水提工藝

2.5.1 水提工藝正交試驗設(shè)計 結(jié)合文獻[8-12]報道及預(yù)試驗，以加水量（A，倍）、煎煮時間（B，h）、煎煮次數(shù)（C）為考察因素，以阿魏酸含量、淫羊藿苷含量及水提液得膏率的綜合評分為考察指標(biāo)，采用L（934）正交法對提取工藝進行考察。因素與水平見表1。

表1 因素與水平Tab 1 Factorsand levels

2.5.2 正交試驗結(jié)果與分析 采用多指標(biāo)綜合評分，其中阿魏酸含量和淫羊藿苷含量分別占40%，得膏率占20%，綜合評分＝阿魏酸含量/最大阿魏酸含量×100× 0.4+淫羊藿苷含量/最大淫羊藿苷含量×100×0.4+得膏率/最大得膏率×100×0.2。正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 2 Design and resultsof orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Resultsof variance analysis

由表2和表3可知，因素C（提取次數(shù)）對阿魏酸含量、淫羊藿苷含量及得膏率的綜合評分結(jié)果有顯著性影響，因素B（煎煮時間）、因素A（加水量）對于試驗結(jié)果影響不大，影響因素大小排序依次為C＞B＞A。綜合考慮，可確定最優(yōu)水提工藝為A2B2C3，即加10倍量水煎煮3次，每次煎煮1 h。

2.5.3 驗證試驗 按處方比例稱取藥材，按照上述試驗優(yōu)選的最優(yōu)工藝提取，合并提取液，濃縮至250m L。測定提取液中阿魏酸、淫羊藿苷的含量，并計算得膏率和綜合評分，結(jié)果見表4。

表4 驗證試驗結(jié)果（n＝3）Tab 4 Resultsof verification test（n＝3）

3 討論

本研究處方藥味多達12種，需要采用多指標(biāo)成分對工藝路線進行全面研究。當(dāng)歸和淫羊藿同為君藥，共同起到促進骨骼生長愈合的作用[13]。阿魏酸為當(dāng)歸的主要有效成分，淫羊藿苷為淫羊藿的主要藥效成分，因此以阿魏酸和淫羊藿苷的含量作為主要評價指標(biāo)；方中其余藥味也多以水溶性成分為活性成分，故以得膏率為輔助評價指標(biāo)；權(quán)重系數(shù)分別為阿魏酸和淫羊藿苷的含量各占40%，得膏率占20%。

筆者在預(yù)試驗中分別提取了3次和2次[14]，發(fā)現(xiàn)提取3次和2次的出膏率分別為28%、24%，故正交試驗設(shè)計中對提取次數(shù)進行考察。結(jié)果顯示，提取3次為最優(yōu)提取次數(shù)，這可能是由于提取3次得膏率較高。而且有研究報道，以水煎法提取淫羊藿中的淫羊藿苷時，提取3次轉(zhuǎn)移率較高[15]，故提取3次綜合評分較高。

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Optim ization ofWater Extraction Technology of Yangxue Jiegu Capsule by Orthogonal Test

ZHEN Xiaolong1，HOU Shouqian2，DOU Xia1（1.The Processing and Quality Control Engineering Technology Research Center，A ffiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730020，China；2.Dept.of Chinese Medicine Orthopedics，TCM Hospital of Gansu Kangxian County，Gansu Longnan 746500，China）

OBJECTIVE：To optim ize the water extraction technology of Yangxue Jiegu capsule.METHODS：Using adding amount of water，decoction time and decoction times as investigation factors，ferulic acid content，icariin content and yield rate as investigation indexes，orthogonal test was used to optimize the optimal water extraction technology of Yangxue Jiegu capsule；and verification test was conducted.RESULTS：The optim ized extraction technology was 10-fold water，extracting 3 times，1 h once. Contents of ferulic acid and icariin were 0.38，1.23mg/g（n＝3），yield rate was 28.2%（n＝3），average comprehensive score was 97.11（RSD＝2.77%，n＝3）.CONCLUSIONS：Optim ized extraction technology is feasible，accurate，reliable，and can be used for the extraction and preparation of Yangxue Jiegu capsule.

Yangxue Jiegu capsule；Orthogonal test；Water extraction technology

R284.2

A

1001-0408（2017）16-2249-03

2016-08-18

2017-04-01）

（編輯：劉明偉）

甘肅省中醫(yī)藥管理局科研項目（No.GZK-2014-50）

＊主管中藥師，碩士。研究方向：中藥鑒定與質(zhì)量研究。電話：0931-8639269。E-mail：115082774@qq.com

#通信作者：副主任中藥師，碩士。研究方向：中藥制劑與質(zhì)量研究。電話：0931-8639269。E-mail：doux125@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.24