HPLC測(cè)定芍藥甘草湯中甘草酸銨的含量

李墨+趙輝

[摘要]目的 建立芍藥甘草湯中甘草酸銨的含量測(cè)定方法。方法 采用高效液相色譜法，Phenomenex ODS柱（5 μm，250.0 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.05%磷酸溶液，時(shí)間梯度洗脫；流速為1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm；柱溫為30℃。結(jié)果 甘草酸銨進(jìn)樣量在6.992～174.800 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.9991），平均回收率為98.62%（n=6），RSD為0.28 %。結(jié)論 本方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于芍藥甘草湯的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]芍藥甘草湯；甘草酸銨；高效液相色譜；質(zhì)量控制

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）05（c）-0101-03

[Abstrac]Objective To establish an HPLC method for the content determination of ammonium glycyrrhetate in Shaoyao Gancao Decoction.Methods HPLC was performed on the Phenomenex ODS （250.0 mm×4.6 mm，5 μm）with acetonitrile-0.05% phosphoric acid with a gradient elution program as the mobile phase at a flow rate of 1.0 ml/min，237 nm as the detection wavelength，the temperature of column was at 30℃.Results The linear range of ammonium glycyrrhetate was 6.992-174.800 μg （r=0.9998） and the average recovery rate was 98.62% （n=6） with RSD 0.28%.Conclusion The results showed that this method was simple，accurate，reliable，and could be used for quality control of Shaoyao Gancao Decoction.

[Key words]Shaoyao Gancao Decoction；Ammonium glycyrrhetate；High performance liquid chromatography；Quality control

中藥方劑芍藥甘草湯出自東漢醫(yī)圣張仲景的《傷寒論·辨太陽(yáng)病脈證并治上》，該處方由芍藥、炙甘草兩味中藥材組成，主治陰液虧虛、肝失疏泄，脾失健運(yùn)，實(shí)驗(yàn)顯示其具有抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等藥理作用，在臨床上被廣泛應(yīng)用于消化、神經(jīng)、呼吸系統(tǒng)還有婦科類病癥的預(yù)防與治療[1-6]?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)顯示，芍藥甘草湯主要有松弛骨骼肌、解痙鎮(zhèn)痛、抗?jié)兊茸饔?，因此臨床使用非常廣泛[7-11]。兩味中藥在藥效方面有協(xié)同作用，甘草酸銨是方劑芍藥甘草湯中解痙鎮(zhèn)痛的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[12-17]，經(jīng)甘草配伍使用后療效生增強(qiáng)，體現(xiàn)了配伍“七情”中的相使。本研究采用高效液相色譜法測(cè)定對(duì)芍藥甘草湯中有效成分甘草酸銨進(jìn)行含量測(cè)定，該方法可靠、簡(jiǎn)單、靈敏，可用于芍藥甘草湯的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)研究。

1儀器與試藥

1.1儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器，四元梯度泵）；Bandelin Sonorex RK 1208BH超聲波清洗器；Memmert 8孔電熱水浴鍋；METTLER Toledo AB265-S電子天平（瑞士）。

1.2試劑與藥品

甘草酸銨（批號(hào)：110731-201116，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院）。液相用甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，液相用水為Millipore超純水，其余試劑均為分析純。白芍、炙甘草均購(gòu)于沈陽(yáng)東北大藥房，經(jīng)沈陽(yáng)市紅十字會(huì)醫(yī)院藥劑科副主任藥師趙輝鑒定為真品，分別為毛茛科芍藥屬植物白芍（Paeonia lactiflora Pall.）、豆科甘草屬植物炙甘草（Radix Glycyrrhizae Preparata）。

2方法與結(jié)果

2.1芍藥甘草湯的制備

按芍藥甘草湯方劑構(gòu)成取芍藥，甘草（炙）各10 g合并，每次加水8倍量、8倍量和6倍量煎煮3次，第1次的煎煮時(shí)間為1 h，后兩次的煎煮時(shí)間為1.2 h，合并煎液并過(guò)濾，減壓濃縮致干備用。

2.2色譜條件

Phenomenex ODS柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫見(jiàn)表1；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm。理論板數(shù)按甘草酸銨峰計(jì)算應(yīng)≥5000。

2.3對(duì)照品溶液的制備

甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定1.748 mg，精密加入10 ml 70%乙醇溶液，制成每1 ml含甘草酸銨174.8 μg的儲(chǔ)備液。

2.4供試品溶液的制備

取芍藥甘草湯提取物1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入70%甲醇100 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。對(duì)照品及樣品色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1方法專屬性 按選取的色譜條件，供試品溶液中的雜質(zhì)對(duì)甘草酸銨的測(cè)定無(wú)干擾。

2.5.2線性關(guān)系 精密吸取對(duì)照品溶液10 μl進(jìn)樣，以甘草酸銨的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，采用多元回歸運(yùn)算，得甘草酸銨的回歸方程分別為Y=2149X+1.725（r=0.9991）。結(jié)果顯示，甘草酸銨在6.992～174.8 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3精密度試驗(yàn) 取供試品溶液6份，按照選取的色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣10 μl，考察日內(nèi)及日間精密度。結(jié)果顯示，甘草酸銨日內(nèi)精密度（n=6）為0.96%；日間精密度（n=6）為1.24%。

2.5.4回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的芍藥甘草湯，精密加入一定量的甘草酸銨對(duì)照品，按供試品溶液的制備操作，制備中、低、高3種濃度（甘草酸銨）的樣品，每次平行操作（n=6），進(jìn)樣10 μl，分別記錄其峰面積并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出三種濃度對(duì)照品的質(zhì)量濃度，以測(cè)定量與加入量的比值計(jì)算方法回收率及高、中、低3種濃度的回收率與RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5.5樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，按選取的色譜條件測(cè)定，分別在0、1、2、4、8、12 h進(jìn)樣10 μl，記錄峰面積，甘草酸銨RSD分別為0.56%、1.02%、1.16 %、1.08%、1.20%、1.15%，結(jié)果顯示，芍藥甘草湯樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6芍藥甘草湯提取物含量測(cè)定

按芍藥甘草湯提取物的制備方法制備3批芍藥甘草湯提取物，按本實(shí)驗(yàn)所選取的色譜條件對(duì)3批芍藥甘草湯提取物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，甘草酸銨含量為（141.60±3.511）μg/ml，RSD為2.45%。

3討論

本研究中，預(yù)試驗(yàn)比較了乙腈-冰乙酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液的梯度洗脫系統(tǒng)，結(jié)果顯示乙腈-0.05%磷酸水溶液洗脫系統(tǒng)中出現(xiàn)的色譜峰較多且分離效果較好，能夠滿足液相圖譜對(duì)色譜峰的要求。采用DAD檢測(cè)器在210～400 nm范圍內(nèi)波長(zhǎng)采集光譜圖，在237 nm處有最大吸收，確定為最終檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相曾采用30%乙腈作溶劑，比較振搖與超聲預(yù)處理等試驗(yàn)，對(duì)最后測(cè)定值影響比較小。本方法非常簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于芍藥甘草湯的質(zhì)量控制。

芍藥甘草湯是出自《傷寒論》的經(jīng)典名方，由芍藥、甘草2味中藥組成，其中芍藥酸寒、養(yǎng)血斂陰，甘草甘溫、健脾益氣。目前對(duì)芍藥甘草湯物質(zhì)基礎(chǔ)的研究主要集中在對(duì)白芍、甘草的化學(xué)成分的孤立分析，并未對(duì)各化學(xué)成分之間的相互制約、相互協(xié)同作用作出整體評(píng)價(jià)，認(rèn)為中藥及其復(fù)方的臨床療效就是各化學(xué)成分的作用的簡(jiǎn)單加和，并以此來(lái)解釋芍藥甘草湯的臨床療效，這有悖于中醫(yī)藥整體觀理論，因此，隨著中藥研究的不斷深入以及中藥藥效組分理論的不斷發(fā)展，對(duì)芍藥甘草湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究也將更加明確，這對(duì)傳承中藥文化有積極意義。

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（收稿日期：2017-03-05 本文編輯：祁海文）