HPV45-L1和HPV58-L1蛋白植物表達(dá)載體的構(gòu)建及水稻轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

王聚財(cái)，劉運(yùn)超，陳玉梅，，孟鳳麗，，王愛(ài)萍，張二芹，許倩茹，鄧瑞廣，張改平，

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002;3.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001)

HPV45-L1和HPV58-L1蛋白植物表達(dá)載體的構(gòu)建及水稻轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

王聚財(cái)1，劉運(yùn)超2，陳玉梅2，3，孟鳳麗2，3，王愛(ài)萍3，張二芹1，許倩茹1，鄧瑞廣2，張改平1，2

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002;3.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001)

利用水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器，構(gòu)建含有HPV45-L1和HPV58-L1基因的重組植物表達(dá)載體，為HPV-45L1和HPV58-L1蛋白的表達(dá)提供一種新的高效、低廉的表達(dá)方式。利用PCR技術(shù)克隆人乳頭瘤病毒HPV45-L1和HPV58-L1蛋白編碼基因，將其重組于中間載體pMP3和植物表達(dá)載體pCAMBIA-1300中，構(gòu)建含HPV45-L1和HPV58-L1基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1、pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1，隨后采用根癌農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷組織介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化，獲得HPV-L1轉(zhuǎn)基因水稻植株。PCR檢測(cè)結(jié)果表明，HPV45-L1和HPV58-L1基因已整合到水稻基因組中，說(shuō)明已成功構(gòu)建水稻胚乳特異性表達(dá)載體。

人乳頭瘤病毒；轉(zhuǎn)基因水稻；水稻胚乳特異性啟動(dòng)子；根癌農(nóng)桿菌

水稻是我國(guó)主要的糧食作物之一，是一種低成本、高收益、高安全的農(nóng)作物。目前，水稻基因組的全序列已經(jīng)被測(cè)定，這為開(kāi)展水稻遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究工作提供了基礎(chǔ)。近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因水稻作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用生物大分子的研究發(fā)展迅速[1]，利用其胚乳表達(dá)的蛋白遭受蛋白酶降解的可能性較低[2]，因此，水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，但大多還停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可將重組蛋白質(zhì)定向儲(chǔ)藏在蛋白體，避免了蛋白酶的降解，在種子成熟過(guò)程中不斷地積累，從而獲得較高表達(dá)[3-4]。同時(shí)，水稻作為生物反應(yīng)器，具有成本低、操作簡(jiǎn)便、蛋白活性高等優(yōu)點(diǎn)[5]。

人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的直接病因[6]，體外表達(dá)的HPV主要衣殼蛋白L1可組裝成病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)[7]，這種VLPs結(jié)構(gòu)在動(dòng)物模型中可刺激機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)效的中和抗體[8-9]，已用于開(kāi)發(fā)預(yù)防性HPV疫苗。目前已經(jīng)上市的HPV疫苗主要是利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)或酵母表達(dá)系統(tǒng)在體外表達(dá)L1蛋白，制備VLPs疫苗[10-11]，但是由于生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本較高等因素，使該類(lèi)VLPs疫苗在發(fā)展中國(guó)家的推廣應(yīng)用受到限制。目前，轉(zhuǎn)基因植物已被公認(rèn)是制備各種基因工程蛋白中最價(jià)廉、最方便的生物反應(yīng)器，常用的轉(zhuǎn)基因植物有馬鈴薯、水稻、番茄、擬南芥、煙草等[12-14]。本研究嘗試在轉(zhuǎn)基因水稻中制備HPV -L1蛋白制備VLPs疫苗。利用水稻胚乳生物反應(yīng)器，應(yīng)用遺傳工程和DNA重組技術(shù)，將經(jīng)過(guò)優(yōu)化人工合成的HPV45-L1和HPV58-L1基因克隆于水稻表達(dá)載體中，通過(guò)根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織，獲得表達(dá)HPV45-L1和HPV58-L1蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻植株，為獲得HPV-L1蛋白提供一種更為廉價(jià)的途徑。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒及菌株 TP309水稻種子、根癌農(nóng)桿菌EHA105、中間載體pMP3、植物表達(dá)載體pCAMBIA1300由武漢禾元科技股份有限生物公司提供。大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于TaKaRa公司。pUC57-HPV45-L1、pUC57-HPV58-L1經(jīng)水稻密碼子優(yōu)化后由南京金斯瑞科技有限公司合成。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 各種限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自NEB公司。頭孢霉素(Cep)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)和植物激素6-芐氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)、萘乙酸(1-Naphthylacetic acid，NAA)、吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、6-糖基氨基嘌呤(Kinetin，KT)等購(gòu)自Biosharp公司。潮霉素B(Hygromycin B)購(gòu)自Roche公司。質(zhì)粒提取試劑盒和切膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB、MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、共培養(yǎng)基、農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基參照武漢禾元科技股份有限生物公司提供方法配制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因序列分析及優(yōu)化合成 通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，獲得HPV45-L1及HPV58-L1基因及氨基酸序列，結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道中對(duì)不同變異體蛋白產(chǎn)生及組裝效率的分析篩選出合適的基因序列，再根據(jù)水稻密碼子偏愛(ài)性情況，利用生物信息學(xué)分析優(yōu)化并合成含有HPV45-L1及HPV58-L1蛋白編碼基因的pUC57-HPV45-L1、pUC57-HPV58-L1，在合成基因N端引入MlyⅠ酶切位點(diǎn)；在C端引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)。同時(shí)設(shè)計(jì)合成2對(duì)特異性鑒定引物(表1)

表1 重組植物表達(dá)載體鑒定用引物

1.2.2 水稻胚乳特異性表達(dá)載體pCAMBIA1300-pMP3-HPV45-L1及pCAMBIA1300-pMP3-HPV58-L1的構(gòu)建 將優(yōu)化合成的基因pUC57-HPV45-L1和pUC57-HPV58-L1分別經(jīng)XhoⅠ和MlyⅠ雙酶切，中間載體pMP3經(jīng)XhoⅠ和NaeⅠ雙酶切，37 ℃2 h后切膠回收，經(jīng)T4連接酶16 ℃過(guò)夜連接，構(gòu)建中間載體pMP3-HPV45-L1、pMP3-HPV58-L1。用限制性?xún)?nèi)切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA1300和重組載體pMP3-HPV45-L1、pMP3-HPV58-L1，切膠回收經(jīng)T4連接酶16 ℃過(guò)夜連接，構(gòu)建水稻胚乳特異性表達(dá)載體。經(jīng)菌液PCR、雙酶切鑒定后送樣測(cè)序，將成功構(gòu)建的表達(dá)載體命名為pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1、pCAMBIA1300-pMP3-HPV58-L1。重組植物表達(dá)載體構(gòu)建策略如圖1所示。

1.2.3 水稻胚乳特異性表達(dá)載體pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1及pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1電轉(zhuǎn)根癌農(nóng)桿菌 分別提取表達(dá)載體pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1和pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1質(zhì)粒，取2 μL陽(yáng)性質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化200 μL根癌農(nóng)桿菌(EHA105)感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)菌液PCR鑒定為陽(yáng)性后，分別命名為EHA105-pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1和EHA105-1300-pCAMBIA-pMP3-HPV58-L1用于介導(dǎo)水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。

圖1 植物表達(dá)載體構(gòu)建策略

1.2.4 水稻愈傷組織的獲得 取成熟的TP309水稻種子，脫殼后置于37 ℃恒溫箱2 d。在超凈臺(tái)上用20%的次氯酸鈉(加入1～2滴吐溫20)浸泡30 min，用無(wú)菌水沖洗6次，后用無(wú)菌濾紙吸干水分，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，26 ℃光照培養(yǎng)9～10 d，挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織用于根癌農(nóng)桿菌侵染試驗(yàn)。

1.2.5 水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化 將重組根癌農(nóng)桿菌1∶100接種于含有50 mg/L Kan和50 mg/L Rif的液體LB中，28 ℃，200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，取200 μL均勻涂抹在含有50 mg/L Kan和50 mg/L Rif的LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)2 d。用無(wú)菌勺子將重組根癌農(nóng)桿菌刮至300 mL農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基(AMM)中，于28 ℃，200 r/min 培養(yǎng)3 h，待菌液長(zhǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，侵染水稻的愈傷組織30～40 min，此間要不時(shí)地?fù)u動(dòng)，后棄菌液，用無(wú)菌濾紙吸干多余的菌液。將侵染后的愈傷組織接種到共培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)3 d后移至無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)，先用4 L無(wú)菌水沖洗至溶液澄清，每隔5 min換一次液，再用2 L含有0.5 g/L頭孢水沖洗，每隔15 min換一次液最后用無(wú)菌濾紙吸干愈傷組織表面的水分，置于無(wú)菌濾紙上晾干后轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基，26 ℃暗培養(yǎng)30～35 d，挑選質(zhì)地緊實(shí)、嫩黃的愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中，26 ℃、光照條件下培養(yǎng)約30 d再轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，26 ℃、光照條件下培養(yǎng)30 d。待根系完全長(zhǎng)出后，移栽至溫室培養(yǎng)10～14 d。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因水稻葉片DNA的提取 利用十六烷基三甲基溴化銨法(Cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide，CTAB)提取水稻葉片DNA，取500 mg T0轉(zhuǎn)基因水稻新鮮葉片，用組織研磨器研碎，加入500 μL預(yù)熱的2 % CTAB分離提取液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)混勻后置于65 ℃水浴鍋中45 min，加入等體積氯仿-異戊醇(24∶1)抽提，12 000 r/min離心10 min。上清移至新的EP管中，加入2/3體積的異戊醇輕輕混勻，-20 ℃靜置1～2 h。12 000 r/min離心10 min，棄上清。用700 μL 70%無(wú)水乙醇洗滌沉淀2～3次，干燥后溶于80 μL TE中。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因水稻的PCR檢測(cè) 取1 μL總DNA，分別用HPV45-L1和HPV58-L1上下游引物(F45/R45；F58/R58)進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以未轉(zhuǎn)入HPV-L1基因的水稻植株葉片DNA為陰性對(duì)照，以相應(yīng)質(zhì)粒 DNA 為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 中間表達(dá)載體pMP3-HPV45-L1及pMP3-HPV58-L1的鑒定

中間表達(dá)載體pMP3-HPV45-L1、pMP3-HPV58-L1的菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在約499，466 bp處可見(jiàn)特異性條帶，大小與預(yù)期相符(圖2)。經(jīng)Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切鑒定電泳結(jié)果顯示，陽(yáng)性質(zhì)粒有2條帶其中3 100 bp條帶包括水稻特異性啟動(dòng)子Gt13a、HPV-L1基因、信號(hào)肽SP及終止子，大小與預(yù)期相符(圖3)。

2.2 重組植物表達(dá)載體pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1及pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1的鑒定

重組植物表達(dá)載體pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1 、pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約499，466 bp處可見(jiàn)特異性條帶，大小與預(yù)期相符(圖4)。植物表達(dá)載體pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1、pCAMBIA1300-pMP3-HPV58-L1質(zhì)粒雙酶切(Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)2條帶，大小分別與預(yù)期載體片段和目的基因片段相符(圖5)。

M.DL2000；1～3.pMP3-HPV45-L1單菌落；4. pUC57-HPV45-L1質(zhì)粒(陽(yáng)性對(duì)照)；5～7.pMP3-HPV58-L1單菌落；8. pUC57-HPV58-L1質(zhì)粒(陽(yáng)性對(duì)照)。

M.DL2000；1-3：The single colony of pMP3-HPV45-L1 strains；4.pUC57-HPV45-L1 plasmid(PC)；5-7.The single colony of pMP3-HPV58-L1 strains；8.pUC57-HPV58-L1 plasmid(PC).

圖2 重組質(zhì)粒 pMP3-HPV45-L1、pMP3-HPV58-L1菌液PCR鑒定

Fig.2 Identification of recombinant plamids pMP3-HPV45-L1 and pMP3-HPV58-L1 by PCR amplification

M.DL10000；1～3.Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切pMP3-HPV45-L1質(zhì)粒;4～6.Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切pMP3-HPV58-L1質(zhì)粒。

M.DL2000；1～4.pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1單菌落；5～8.pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1單菌落。

2.3 重組根癌農(nóng)桿菌表達(dá)載體EHA105-pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1及EHA105-pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1的鑒定

分別取2 μL成功構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1和pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1陽(yáng)性質(zhì)粒電轉(zhuǎn)根癌農(nóng)桿菌EHA105，菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約499，466 bp處可見(jiàn)特異性條帶，大小與預(yù)期相符(圖6，7)。

M.DL10000；1～4.Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1質(zhì)粒;5～8.Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1質(zhì)粒。

M.DL10000；1-4.pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1 plasmids enzymed byHind Ⅲ andEcoR Ⅰ；5-8.pCAMBIA1300-pMP3-HPV58-L1 plasmids enzymed byHind Ⅲ andEcoR Ⅰ

圖5 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

Fig.5 Identification of recombinant plasmid by enzyme digestion

2.4 水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化

分別用含有HPV45-L1、HPV58-L1基因的根瘤農(nóng)桿菌浸染水稻愈傷組織，在潮霉素的抗性篩選下選擇培養(yǎng)30～35 d，愈傷組織分化出新的嫩黃、質(zhì)地堅(jiān)硬的抗性愈傷組織，抗性愈傷組織經(jīng)分化、生根培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)基因水稻(圖8)。

M.DL2000；1～5.EHA105-pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1單菌落。

M.DL2000；1～4.EHA105-pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1單菌落。

圖8 水稻胚乳介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

2.5 轉(zhuǎn)基因水稻陽(yáng)性植株的鑒定

將含有潮霉素抗性的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻移栽到溫室練苗7～14 d，利用CTAB法分別提取轉(zhuǎn)基因水稻T0葉片DNA。經(jīng)PCR鑒定(圖9，10)，28株抗性水稻植株中共篩選20株含有HPV45-L1基因(499 bp左右有目的條帶)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻植株；40株抗性水稻植株中共篩選22株含有HPV58-L1基因的(466 bp左右有目的條帶)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻植株；而陰性對(duì)照未擴(kuò)增出任何條帶，說(shuō)明HPV-L1基因已整合到水稻基因組中。

3 結(jié)論與討論

目前已上市的HPV預(yù)防性疫苗主要是基于L1蛋白自組裝或是L1、L2蛋白共同組裝形成的VLPs疫苗[15]，與傳統(tǒng)疫苗相比，VLPs疫苗相對(duì)比較安全，而且具有較高的免疫原性[16]?，F(xiàn)有的預(yù)防性VLPs疫苗采用昆蟲(chóng)細(xì)胞或酵母表達(dá)體系制備，生產(chǎn)成本較高，極大地限制了疫苗在發(fā)展中國(guó)家的推廣應(yīng)用。有研究顯示：HPV-L1蛋白可在不同植物中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)：Warzecha等[17]在鮮馬鈴薯塊莖中表達(dá)的HPV11-L1-NLS-，L1蛋白含量可達(dá)20 ng/g；Kohl等[18]已成功地利用轉(zhuǎn)基因煙草、擬南芥表達(dá)HPV11-L1-NLS-蛋白，其在擬南芥中含量高達(dá)12 μg/g，而在轉(zhuǎn)基因煙草中為2 μg/g；Lamprecht等[19]利用轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)HPV16假病毒(Pseudovirions，PsVs)，首次證實(shí)轉(zhuǎn)基因植物可用于制備哺乳動(dòng)物假病毒，并證明利用轉(zhuǎn)基因植物制備DNA疫苗具有可能性。水稻是世界上重要的糧食作物，并已為分子生物學(xué)研究的模式作物之一，因此，遺傳轉(zhuǎn)化已成為水稻分子生物學(xué)研究和基因工程的必需手段。He等[20]已成功應(yīng)用水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Osr HSA，占水稻可溶性蛋白的10.58%，且純度高達(dá)99%，AN等[21]表達(dá)的OsrbFGF產(chǎn)量可達(dá)8.33 mg/kg，表明水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)作為一種新的植物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源重組蛋白。

圖9 HPV45-L1轉(zhuǎn)基因水稻PCR鑒定

圖10 HPV58-L1轉(zhuǎn)基因水稻PCR鑒定

經(jīng)研究實(shí)踐證實(shí)，利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)HPVVLPs疫苗或DNA疫苗在理論上是可行的，同時(shí)基于轉(zhuǎn)基因水稻作為生物反應(yīng)器的諸多優(yōu)勢(shì)，本研究構(gòu)建了HPV45-L1、HPV58-L1水稻胚乳特異性表達(dá)載體，該表達(dá)載體具有完整的植物表達(dá)調(diào)控元件，如水稻胚乳特異性啟動(dòng)子Gt13a、信號(hào)肽序列SP、潮霉素篩選基因及左右邊界序列等植物表達(dá)系統(tǒng)所必須的元件以及目的基因HPV45-L1或HPV58-L1編碼區(qū)序列。將成功構(gòu)建的重組表達(dá)菌株EHA105-pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1及EHA105-pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1分別浸染水稻愈傷組織，在潮霉素抗性培養(yǎng)基篩選分別獲得28，40株轉(zhuǎn)基因水稻植株；隨后提取轉(zhuǎn)基因水稻葉片DNA并進(jìn)行PCR鑒定，最終篩選出20株含的HPV45-L1基因和22株含的HPV58-L1基因的轉(zhuǎn)基因水稻，說(shuō)明構(gòu)建的水稻胚乳特異性表達(dá)載體適用于根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化，為HPV45或HPV58亞型L1蛋白在水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)中的成功表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

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Construction of HPV45-L1 and HPV58-L1 Plant Expression Vectors and Identification of Transgenic Rice Plants

WANG Jucai1，LIU Yunchao2，CHEN Yumei2，3，MENG Fengli2，3，WANG Aiping3，ZHANG Erqin1，XU Qianru1，DENG Ruiguang2,ZHANG Gaiping1，2

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；2.Key Laboratory of Animal Immunology of Ministry of Agriculture,Henan Key Laboratory of Animal Immunology，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；3.School of Life Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China)

The rice seeds were used as the cell bioreactor to construct the recombinant plant expression vector containingHPV45-L1 andHPV58-L1 genes to provide a new efficient and inexpensive method forHPV45-L1 andHPV58-L1 protein expression.TheHPV45-L1 andHPV58-L1 coding sequence(ORF)was amplified by PCR and then subcloned into middle vector pMP3 and plant expression vector pCAMBIA-1300 to construct the rice endosperm-specific expression vector pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1 and pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1.Subsequently，the transgenic rice plants containingHPV-L1 ORF gene were obtained by agrobacterium-mediated genetic transformation of rice callus.The PCR test showed that theHPV45-L1 andHPV58-L1 genes had integrated into the rice genome，suggesting the successful construction of rice endosperm specific expression vectors.

Humanpapillomavirus；Transgenic rice；The rice specific endosperm-promoter；Agrobacteriumtumefaciens

2016-11-08

河南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)和創(chuàng)新人才支持計(jì)劃(14HASTIT027)

王聚財(cái)(1990-)，女，河南洛陽(yáng)人，碩士，主要從事疫病與疫苗研究。

張改平(1960-)，男，河南內(nèi)黃人，院士，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物免疫學(xué)及動(dòng)物病毒分子致病機(jī)制研究。

Q78；S511.03

A

1000-7091(2017)02-0055-06

10.7668/hbnxb.2017.02.009