棉花WOX轉錄因子家族基因的全基因組鑒定與分析

呂有軍 ，楊衛(wèi)軍，趙蘭杰 ，劉子洋，張永山

(1.安陽工學院，河南 安陽 455000；2.中國農(nóng)業(yè)科學院 棉花研究所，河南 安陽 455000；3.棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽 455000，4.薩斯喀徹溫大學，加拿大 薩斯卡通 S7N 5A5 )

棉花WOX轉錄因子家族基因的全基因組鑒定與分析

呂有軍1，2，3，楊衛(wèi)軍1，趙蘭杰2，劉子洋4，張永山2

(1.安陽工學院，河南 安陽 455000；2.中國農(nóng)業(yè)科學院 棉花研究所，河南 安陽 455000；3.棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽 455000，4.薩斯喀徹溫大學，加拿大 薩斯卡通 S7N 5A5 )

為了挖掘可用于棉花花器官或纖維發(fā)育研究的候選基因，基于已發(fā)布的陸地棉全基因組數(shù)據(jù)，利用生物信息學的分析方法鑒定了陸地棉WOX(WUSCHEL-related homeobox，WOX)轉錄因子基因家族，并從染色體分布、基因及蛋白理化性質、蛋白結構、多重序列比對、系統(tǒng)進化樹和基因表達模式等方面對該基因家族的特征進行了比較分析。結果表明，鑒定到37個陸地棉WOX轉錄因子家族基因，命名為GhWOX1～GhWOX37。亞基因組定位結果顯示，37個陸地棉WOX轉錄因子家族基因分布在除了A04、A06、A09、D04、D06和D09號亞基因組以外的20個亞基因組，A亞組比D亞組多1個GhWOX轉錄因子家族基因。多重序列比對分析棉花WOX轉錄因子家族成員均具有高度保守的同源異型結構域；系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)棉花WOX轉錄因子家族可以分為3個亞家族(Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類)，各亞類分別含有23，7，7個GhWOX轉錄因子家族基因成員。對NCBI中陸地棉的EST數(shù)據(jù)庫比對分析，有11個GhWOX轉錄因子家族成員沒有可匹配的EST序列，其他26個GhWOX轉錄因子家族成員在棉花的根、莖、葉、花、胚珠、纖維和種子等組織和器官中廣泛表達。為深入研究棉花和其他植物中WOX家族的鑒定和功能研究奠定了基礎。

棉花；WOX；花；纖維發(fā)育

WUSCHEL(WUS)相關的同源異型盒WOX(WUSCHEL-related homeobox)轉錄因子在植物界廣泛存在，并且是植物中一類比較大的轉錄因子家族，屬于同源異型盒HB(Homebox)轉錄因子超家族的一個亞家族[1-4]。這類轉錄因子的蛋白包括一段能夠特異結合DNA序列的60～66個氨基酸組成的同源異型結構域HD(Home domain)，具有調控頂端分生組織的分化、側生器官的發(fā)育、花器官的形成和胚發(fā)育等多種生物學功能[5-10]。

有關不同植物中WOX基因的功能研究越來越多?，F(xiàn)已經(jīng)在擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)15個WOX成員，分別是AtWUS和AtWOX1～AtWOX14[9-11]，各個基因的功能已經(jīng)研究得比較明確；水稻全基因組中共有13個WOX成員，其功能都有深入研究[12-15]；玉米全基因組中共預測有21個WOX成員[15-17]；番茄全基因組中已經(jīng)預測到10個WOX成員[18]。此外，在楊樹、高粱和茄子等植物中也有關于WOX基因的報道[15，19]。WOX家族成員眾多，具有不同的生物學功能，如AtWUS基因維持和形成莖尖頂端分生組織，影響花藥和子房的發(fā)育過程，通過WUS在根中異位表達，誘導產(chǎn)生莖尖分生組織，進而產(chǎn)生葉片，并產(chǎn)生花序[20-22]。擬南芥wus突變體表現(xiàn)出植株頂端分生組織和花序分生組織異常，花數(shù)目減少且花器官異常[23]。AtWOX3參與擬南芥兩側花瓣的發(fā)育過程，其突變體花瓣變窄或缺失[24]。AtWOX13和AtWOX14也參與影響根和花器官的發(fā)育[25]。擬南芥中AtWOX11和AtWOX12共同參與影響外植體根的器官發(fā)育[26]。水稻中OsWOX11是1個調控不定根生長發(fā)育的關鍵基因，對激活冠狀根的生長發(fā)育具有重要的作用，抑制OsWOX11表達及其缺失突變體WOX11都會造成冠狀根數(shù)目的減少和生長速率下降，而OsWOX11超表達促進冠狀根提前產(chǎn)生，在高位莖節(jié)及小花基部產(chǎn)生不定根[13]。

棉花是世界上最重要的纖維作物之一。陸地棉遺傳標準系TM-1全基因組序列測序工作的完成[27-28]，為棉花功能基因的研究提供了基礎。目前，關于棉花WOX轉錄因子家族的鑒定和分析研究還未見報道。本研究利用15個擬南芥WOX蛋白為探針，從陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫查找鑒定出可能的全部棉花WOX轉錄因子家族基因，并對這些基因進行生物信息學分析，并從染色體分布、基因及蛋白結構、序列比對、系統(tǒng)進化樹及表達模式等方面分析該家族成員的結構和功能，挖掘可用于棉花花器官或纖維發(fā)育研究的候選基因，旨在為進一步研究棉花WOX轉錄因子家族基因的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 陸地棉WOX轉錄因子家族成員的鑒定及序列分析

以TAIR數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org/index.jsp)下載的15個擬南芥WOX轉錄因子家族成員的蛋白序列為探針，與四倍體陸地棉的基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.cottongen.org)進行Blast比對，獲得陸地棉全基因組中WOX轉錄因子家族的所有成員及其CDS和氨基酸序列。

用ProtParam軟件在線(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質的基本理化性質；SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)在線預測和分析蛋白質的二級結構組成形式；運用EBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)和NCBI的BlastP分析氨基酸序列的蛋白質保守區(qū)；IBS 2.0軟件繪制蛋白結構域圖。

1.2 亞基因組定位

利用四倍體陸地棉的基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.cottongen.org)獲得染色體長度及GhWOX轉錄因子家族成員在亞基因組上的位置分布；用MapInspect軟件繪制基因的染色體物理分布圖。

1.3 跨膜結構及亞細胞定位

利用WOLF PSORT(http://psort.hgc.jp/)和TMHMM Server v.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services /TMHMM/)軟件進行信號肽、跨膜區(qū)及亞細胞定位分析。

1.4 多重序列比對及系統(tǒng)進化樹分析

將陸地棉、擬南芥及水稻的WOX蛋白序列利用ClustalW軟件進行多重序列比對，參數(shù)選為默認值。利用MEGA 6.0軟件鄰接法(Nerghbor-join，NJ)構建系統(tǒng)進化樹分析，Bootstrap值設定為1 000。

1.5 棉花WOX在棉花不同組織中的表達分析

以陸地棉GhWOX基因的CDS序列為Query，在NCBI網(wǎng)站的EST數(shù)據(jù)庫中通過Blast搜索，獲得GhWOX基因在不同組織表達的信息，明確GhWOX基因的表達情況。

2 結果與分析

2.1 棉花WOX基因家族的鑒定及序列分析

利用15個擬南芥AtWOX蛋白(AtWUS和AtWOX1～AtWOX14)作為探針，與四倍體陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫比對，共鑒定獲得37個棉花GhWOX家族基因，根據(jù)這些基因在染色體出現(xiàn)的先后順序分別命名為GhWOX1～GhWOX37(表1)。這37個GhWOX基因的編碼區(qū)長度為564～1 134 bp，編碼蛋白序列長度為187～377個氨基酸(表1)。

表1 陸地棉WOX家族基因序列信息

2.2 棉花WOX轉錄因子家族基因的物理定位

陸地棉的這37個GhWOX轉錄因子家族基因在A和D亞基因組存在不均勻分布，在A亞基因組中共有19個GhWOX轉錄因子家族基因，在D亞基因中共有18個GhWOX轉錄因子家族基因，A亞基因組中比D亞基因組中多分布了1個GhWOX轉錄因子家族基因。在A亞基因組中A04、A06和A09沒有GhWOX轉錄因子家族基因的存在，同樣對應的D亞基因組中D04、D06和D09也沒有GhWOX轉錄因子家族基因。在A亞基因組和D亞基因組有GhWOX轉錄因子家族基因分布的對應亞基因組間，都存在有成對的平行結合同源基因，在A05和D05、A10和D10這2對亞基因組中有3對平行進化的同源基因，在A01和D01、A07和D07這2對亞基因組中有2對平行進化的同源基因，其他成對的亞基因組中僅有1對平行同源基因(圖1)。這37個陸地棉WOX基因在染色體的物理定位如圖1所示。

圖1 陸地棉亞基因組上的GhWOX基因的分布

2.3 棉花WOX轉錄因子家族蛋白功能結構域分析

利用ProtParam預測分析37個棉花WOX家族基因蛋白的基本理化性質(表2)，結果表明，這37個棉花WOX蛋白的分子量為21.78～41.84 kDa，理論等電點為4.98～9.47，負電荷的氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為14～44，正電荷的氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為20～41，脂肪系數(shù)為46.37～79.48，總平均親水性為-0.279～-1.069，不穩(wěn)定系數(shù)為45.55～74.35，均為親水性不穩(wěn)定蛋白質。

表2 陸地棉WOX家族基因蛋白理化性質分析

表2(續(xù))

利用SOPMA在線預測分析棉花WOX家族基因蛋白的二級結構(表3)，結果表明，這37個棉花WOX基因家族蛋白的二級結構都是以α-螺旋、延伸直鏈、β-轉角和無規(guī)則卷曲4種結構形式組成。其中，GhWOX11、GhWOX30、GhWOX34蛋白二級結構以α-螺旋為主，其他GhWOX蛋白以無規(guī)則卷曲為主。

表3 陸地棉WOX家族基因蛋白二級結構、信號肽、跨膜區(qū)及亞細胞定位的預測

表3(續(xù))

為了進一步確定篩選的37個棉花WOX基因是否屬于WOX蛋白家族，利用EBL-EBI在線分析，結合NCBI 中BlastP比對，對該基因氨基酸序列進行蛋白質保守區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)37個棉花WOX家族基因成員均具有同源異型結構域，其位置如圖2所示。由于棉花WOX蛋白質氨基酸序列的長度不同，棉花WOX家族基因同源異型結構域出現(xiàn)的位置和長度也不同，GhWOX6和GhWOX26從第2個氨基酸開始就已是同源異型結構域，而GhWOX9和GhWOX28的同源異型結構域從99位氨基酸才開始；棉花WOX家族基因蛋白同源異型結構域最短的僅有68個氨基酸(GhWOX5和GhWOX24)，最長的有88個氨基酸(GhWOX13和GhWOX32)，之間相差20個氨基酸(圖2)。這些同源異型結構域是GhWOX家族基因蛋白行使其正常功能所必需的。

由WOLF PSORT軟件和TMHMM軟件在線預測該蛋白的信號肽、跨膜區(qū)及亞細胞定位情況。結果表明，這37個棉花WOX均沒有信號肽和跨膜區(qū)，其中有5個棉花WOX蛋白(GhWOX1、GhWOX12、GhWOX16、GhWOX21和GhWOX31)定位在細胞核上，其他的棉花WOX家族基因蛋白均定位在細胞質和微體上(表3)。由于這些蛋白定位的不同，故推測WOX蛋白具有不同的功能，且某些成員具有特殊功能。

黑色區(qū)域表示GhWOX家族基因蛋白HD結構域。Black areas represent the GhWOX family gene proteins HD domain of protein.

2.4 棉花WOX基因家族蛋白進化關系

利用DNAMAN和ClustalX將37個棉花WOX家族基因蛋白與擬南芥和水稻W(wǎng)OX蛋白同源異型結構域進行多重序列比較(圖3-A)，結果表明，其同源區(qū)域主要集中在同源異型結構域。為了明確37個陸地棉WOX家族基因蛋白的進化關系，利用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示，棉花WOX家族分為3個亞家族、依次命名為Ⅰ亞家族、Ⅱ亞家族、Ⅲ亞家族，各家族分別含有23，7，7個GhWOX成員，進一步明確了37個WOX棉花家族基因蛋白在植物WOX家族中的類別(圖3-B)。

2.5 棉花WOX家族基因的表達模式分析

以陸地棉37個WOX基因的CDS序列作為探針在NCBI陸地棉EST數(shù)據(jù)庫中Blast，獲得54條相關的EST序列，根據(jù)EST序列的信息分析這37個基因的轉錄表達情況(表4)。分析表明，有11個GhWOX基因沒有可匹配的EST序列，其他26個GhWOX基因在棉花的根、莖、葉、花、胚珠、纖維和種子等組織中廣泛表達。其中，有6個GhWOX基因(GhWOX2/3/4/7/23/25)在分生組織、根、莖、葉、花、胚珠和纖維中都有表達，GhWOX36在花藥中有表達，GhWOX13除了在花藥中有表達還在種子中表達，這些基因可能參與調控頂端分生組織的分化、花器官的形成和胚發(fā)育等多種生物學功能。除了GhWOX17和GhWOX36基因，其他的24個基因在纖維中都有表達，表明這些基因可能參與纖維的發(fā)育過程，與纖維發(fā)育相關。

表4 陸地棉GhWOX轉錄因子家族基因組織的表達模式

表4(續(xù))

注：+.WOX基因有表達；-.WOX基因沒有表達。

Note：+.Expression ofWOXgenes；-.No expression ofWOXgenes.

A.棉花WOX家族基因蛋白與擬南芥和水稻W(wǎng)OX蛋白的HD同源異型結構域多重序列比；B.棉花、擬南芥和水稻W(wǎng)OX家族基因蛋白的進化樹分析；系統(tǒng)樹各分支上數(shù)字是Bootstrap 1000次循環(huán)檢驗的置信度；標尺代表遺傳距離。

A.Amino acid sequences alignment ofGhWOX，AtWOXandOsWOXfamily genes proteins；B.Phylogenic relationship ofGhWOX，AtWOXandOsWOXfamily genes proteins；The numbers on the tree branches represent bootstrap confidence values as Bootstrap is 1000；The scale bar represents genetic distance.

圖3 棉花WOX家族蛋白與擬南芥和水稻W(wǎng)OX蛋白的同源異型結構域多重序列比對及系統(tǒng)進化樹

Fig.3 Amino acid sequences alignment and phylogenic relationship of GhWOX，AtWOXandOsWOXfamily genes proteins

3 結論與討論

通過對陸地棉全基因組數(shù)據(jù)庫進行分析，共鑒定出37個陸地棉WOX基因。本研究鑒定出的37個陸地棉WOX家族基因在四倍體陸地棉基因組中A亞組和D亞組存在不均勻分布，A亞基因組中比D亞基因組中多分布了1個GhWOX轉錄因子家族基因，并且具有GhWOX基因分布的成對的A、D亞組都有共線性基因存在，共有16對共線性基因；其中，A04亞組和D04亞組、A06亞組和D06亞組、A09亞組和D09亞組都是成對的沒有GhWOX轉錄因子家族基因的存在。本研究鑒定出的37個陸地棉WOX家族基因在四倍體陸地棉基因組中A亞組和D亞組的分布，與前人研究發(fā)現(xiàn)A亞組和D亞組的基因存在很高的共線性結果一致[29]。

WOX蛋白正常行使其生物學功能依賴自身的功能結構域。多重序列比對分析發(fā)現(xiàn)37個陸地棉WOX家族基因主要集中在保守性較高的同源異型結構域，該結構域能夠特異特得與DNA序列結合[30]，表明其在棉花WOX轉錄因子家族成員的功能行使中起著重要的作用。由于棉花WOX各個成員功能域的不同，表明棉花WOX基因家族成員間可能存在功能上的差異性；蛋白理化性質預測結果表明，37個陸地棉WOX蛋白都為親水性不穩(wěn)定蛋白，相似的理化性質預示各個成員間可能具有某些相似的功能。研究報道AtWUS、AtWOX3、AtWOX4、AtWOX6、OsWOX3、OsWOX9和OsWOX11亞細胞定位在核內(nèi)[13，31-35]，AtWOX1同時定位在細胞核內(nèi)和細胞質中[36]。而本研究中預測到的37個陸地棉WOX蛋白中有5個定位在細胞核，19個定位在細胞質，2個定位在微體，其他的均定位在細胞質和微體上。推測WOX在棉花生長發(fā)育調控以及逆境適應過程中具有重要作用。通過研究了解棉花中GhWOX家族基因結構特征及進化演變過程，從而為認識陸地棉基因組的復雜性和棉屬物種的進化多樣性奠定了基礎。

前人對其他植物中WOX基因的組織表達研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，AtWOX13和AtWOX14在擬南芥的根和花中表達，AtWOX13參與根的發(fā)育和花器官的形成，AtWOX14與側根的早起形成和花藥的發(fā)育相關[25]。本研究對棉花WOX基因的組織表達研究也發(fā)現(xiàn)，正常生長條件下26個棉花WOX基因中有6個GhWOX基因在分生組織、根、莖、葉、花、胚珠和纖維中都有表達，這符合WOX基因家族的特點。GhWOX16在花藥中有表達，GhWOX13除了在花藥中有表達還在種子中表達，這些基因可能參與調控頂端分生組織的分化、花器官的形成和胚發(fā)育等多種生物學功能。除了GhWOX17和GhWOX36基因，其他的24個基因在纖維中都有表達，表明這些基因在纖維的發(fā)育過程具有重要作用，可能參與纖維發(fā)育調控。

通過分析WOX基因在陸地棉基因組的存在情況，獲得了37個棉花WOX基因，從而為深入研究WOX轉錄因子家族的分子生物學功能提供了基礎理論依據(jù)。

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Genome-wide Identification and Analysis ofWOXFamily Genes inGossypiumhirsutumL.

Lü Youjun1，2，3，YANG Weijun1，ZHAO Lanjie2，LIU Ziyang4，ZHANG Yongshan2

(1.Anyang Institute of Technology，Anyang 455000；2.Institute of Cotton Research，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Anyang 455000；3.State Key Laboratory of Cotton Biology，Anyang 455000；4.University of Saskatchewan，Saskatoon，S7N 5A5,Canada)

The purpose of this study was to find the relevant candidate genes for development of fiber or floral organ in cotton.Based on the available genome data of cotton，theWOXgene family was identified by bioinformatics analysis.The chromosome distribution，gene and protein structures，phylogenetic relationship and gene expression patterns of this family were comprehensively compared.The results showed that a total of 37WOXgenes in cotton genome were found and then designated asGhWOX1-GhWOX37，which were distributed in 20 subgenomes except for A04，A06，A09，D04，D06 and D09.A subgenome had one moreGhWOXgene than D subgenme.The multiple sequence analysis ofGhWOXgene family presented the highly conserved homeodomain.Phylogenetic tree analysis showed that 37WOXgenes could be divided into Ⅰ，Ⅱ and Ⅲ subfamily and the subfamily respectively contained 23，7 and 7WOXfamily genes in cotton.A Blast search on the NCBI EST database showed that 11GhWOXgenes had no matching EST sequence，and other 26GhWOXgenes were expressed in various tissues of root，stem，leaf，flower，ovule，fiber and seed.The results would be helpful for further analysis of WOX family proteins in other plants.

Cotton；WOX；Flower；Fiber development

2017-02-06

河南省科技廳基礎與前沿項目(112300410019)；棉花生物學國家重點實驗室開放課題(CB2014A10)

呂有軍(1974-)，男，河南安陽人，副教授，碩士，主要從事棉花種質創(chuàng)新和植物生理生化方面的教學和研究。

張永山(1971-)，男，河南安陽人，研究員，博士，主要從事棉花遺傳育種研究。

Q78；S562.03

A

1000-7091(2017)02-0021-11

10.7668/hbnxb.2017.02.004