“三通針法”對(duì)脊髓損傷大鼠p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體表達(dá)的影響①

閔友江，程立紅，姚海華，楊柳，閔志云，裴佳

·專題·

“三通針法”對(duì)脊髓損傷大鼠p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體表達(dá)的影響①

閔友江，程立紅，姚海華，楊柳，閔志云，裴佳

目的探討“三通針法”治療對(duì)大鼠脊髓損傷后p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體(p75NTR)mRNA及蛋白表達(dá)的影響。方法72只Sprague-Dawley雌性大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(A，n=8)和造模組(n=64)。造模組大鼠采用改良Allen重物打擊法制作脊髓損傷大鼠模型，造模成功后存活48只大鼠，隨機(jī)分為模型組(B，n=12)、電針組(C，n=12)、阻斷劑NEP1-40組(D，n=12)、電針+阻斷劑NEP1-40組(E，n=12)。電針治療取大椎、腰陽(yáng)關(guān)及雙側(cè)次髎、足三里，選擇疏密波，持續(xù)時(shí)間20 min，每天1次。分別于治療后7 d、14 d提取損傷處脊髓組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、原位雜交、Western blotting方法分別檢測(cè)p75NTR mRNA及蛋白的表達(dá)，采用BBB評(píng)分評(píng)估大鼠后肢活動(dòng)功能。結(jié)果BBB評(píng)分顯示，治療后各組評(píng)分均較B組提高，且E組BBB評(píng)分分別高于C組和D組(P＜0.05)，各組14 d評(píng)分均高于7 d(t＞2.623,P＜0.05)。脊髓損傷后，各治療組與B組比較，脊髓組織中p75NTR mRNA及蛋白的表達(dá)均降低(P＜0.05)；C組、D組和E組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論“三通針法”電針能改善脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能，抑制脊髓損傷后p75NTR的表達(dá)活動(dòng)，這可能是電針治療脊髓損傷的機(jī)制之一。

脊髓損傷；電針；神經(jīng)再生；p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體；大鼠

[本文著錄格式]閔友江，程立紅，姚海華，等.“三通針法”對(duì)脊髓損傷大鼠p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(6):621-627.

CITED AS:Min YJ,Cheng LH,Yao HH,et al.Effect of Santong electroacupuncture on expression of p75 neurotrophin receptor in rats with spinal cord injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(6):621-627.

脊髓損傷所致外傷性截癱是一種嚴(yán)重的傷殘，并有很高的致殘率及致死率。近年來臨床報(bào)道，針灸治療對(duì)于脊髓損傷所造成截癱，特別是不完全性截癱的恢復(fù)有促進(jìn)作用[1]，同時(shí)在改善二便功能、緩解肢體痙攣、減輕截癱性疼痛等并發(fā)癥、后遺癥方面有較好的療效[2-3]。筆者根據(jù)脊髓損傷“督脈瘀阻不通為本、腸腑和膀胱功能失調(diào)為標(biāo)”的病機(jī)特點(diǎn)，采用一種以“通督、通(腸)腑、通調(diào)膀胱”為取穴特點(diǎn)的“三通針法”來治療脊髓損傷患者，取得較好的療效[4]。但其具體的作用機(jī)制有待探討。

實(shí)驗(yàn)研究表明，Nogo/Nogo受體(Nogo receptor, NgR)信號(hào)通路在促進(jìn)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)、調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞骨架方面起到非常重要的作用[5-6]。細(xì)胞外三種結(jié)構(gòu)不同的髓鞘相關(guān)抑制因子(myelin-associated inhibiting factors,MAIFs)，如Nogo、髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp)均通過NgR發(fā)揮軸突的抑制活性。NgR是糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)錨定蛋白，位于細(xì)胞膜外側(cè)。NgR結(jié)構(gòu)上缺乏胞漿部分，需要協(xié)同p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)共同激活胞質(zhì)內(nèi)信號(hào)[7]。拮抗MAIFs或阻斷MAIFs的信號(hào)通路，可促進(jìn)中樞神經(jīng)損傷后的軸突再生。

Nogo分子胞外段氨基端前40個(gè)殘基多肽(Nogo extra cellular peptide residues 1-40,NEP1-40)為實(shí)驗(yàn)室針對(duì)Nogo-66的氨基酸序列設(shè)計(jì)合成的NgR競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑[8]。NEP1-40不僅可以阻斷3種MAIFs與NgR的結(jié)合，而且還阻斷它們介導(dǎo)的生長(zhǎng)錐潰變作用，能促進(jìn)受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突生長(zhǎng)及功能恢復(fù)。有研究表明，電針能通過下調(diào)Nogo-A的表達(dá)來達(dá)到治療脊髓損傷的作用[9-10]。本研究觀察電針治療對(duì)脊髓損傷后p75NTR表達(dá)的影響，探討電針治療脊髓損傷的可能作用機(jī)制，為臨床針灸治療脊髓損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性健康清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠72只，體質(zhì)量(200±20)g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)SCXK(湘)2011-0003。標(biāo)準(zhǔn)配方桿狀飼料喂養(yǎng)，保持室溫20～25℃，自然光照、自由進(jìn)食及飲水。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

Trizol：INVITROGEN公司。SYBR Green PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：Thermo公司。RNaseⅠ：FERMENTAS公司。p75NTR：ABCAM公司。NEP1-40：上海SIGMA-ALDRICH公司。PE10導(dǎo)管：英國(guó)SMITHS MEDICAL公司(ID 0.28 mm;OD 0.61 mm)。華佗牌無(wú)菌針灸針(直徑0.30 mm、長(zhǎng)13 mm)、華佗牌電針治療儀：蘇州醫(yī)療器械廠。酶標(biāo)儀：芬蘭LABSYSTEMS MULTISKAN MS公司。P型移液器：吉爾森。ABI-7300 Real-time檢測(cè)儀：ABI公司。大腦皮質(zhì)挫傷撞擊儀：FLEXCELLINT INTERNATIONAL, INC.,USA。90N-102世新雕刻機(jī)：韓國(guó)SAE SHIN精密有限公司。

1.3 方法

1.3.1 造模

所有大鼠采用10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，以T10棘突為中心，備皮，碘伏消毒后取背部正中切口，長(zhǎng)約2 cm，依次切開皮膚、皮下組織，切開并分離脊柱兩側(cè)肌肉及筋膜，顯露T9～T11椎體棘突及椎板。用世新雕刻機(jī)刀形磨頭在近椎弓根處磨切2～3 mm的小口，磨切時(shí)注意滴水降溫，以免產(chǎn)生的熱量灼傷脊髓，然后用咬骨鉗小心咬除T10及附近棘突及椎板，暴露并保持硬脊膜的完整。

取64只大鼠采用改良Allen脊髓損傷造模方法[9]，將大腦皮質(zhì)挫傷撞擊儀的撞擊頭(直徑約3 mm)對(duì)準(zhǔn)脊髓背部中心位置，將其貼近硬脊膜表面后回縮撞擊頭，設(shè)定撞擊深度1.5 mm，撞擊速度5 m/s，滯留時(shí)間0.5 s，實(shí)施撞擊，造成脊髓T10節(jié)段損傷。模型成功判斷標(biāo)準(zhǔn)：打擊處硬脊膜快速水腫瘀血，同時(shí)伴大鼠尾巴痙攣性擺動(dòng)，后肢回縮性顫動(dòng)或身體痙攣性抽動(dòng)，如出現(xiàn)三種情況之一為建模成功。同法咬除L5～S1關(guān)節(jié)處棘突并暴露脊髓，避開正中血管，用顯微剪在硬膜表面和蛛網(wǎng)膜上剪一小孔，將PE 10軟管夾扁，緊貼硬脊膜下緩慢插入蛛網(wǎng)膜腔隙，見清亮腦脊液從導(dǎo)管外口溢出，說明置管成功?？p合固定于筋膜處，外口距皮膚約1 cm并用導(dǎo)絲封閉，防止腦脊液溢出。術(shù)后用生理鹽水和青霉素清洗傷口并單獨(dú)分籠飼養(yǎng)。

剩余8只大鼠為假手術(shù)組(A組)，只進(jìn)行椎板咬除，但不進(jìn)行脊髓撞擊。術(shù)后每只大鼠進(jìn)行青霉素2× 105U肌肉注射，每天2次，持續(xù)3 d以抗感染；如出現(xiàn)血尿等情況，視情況繼續(xù)予青霉素抗感染。造模大鼠每天進(jìn)行3次人工輔助排尿，直至恢復(fù)自主排尿?yàn)橹?。保持室溫?0～25℃，自然光照、自由進(jìn)食及飲水，及時(shí)更換墊料。

1.3.2 分組與干預(yù)

造模大鼠有16只死亡。剩余48只大鼠Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評(píng)分后再隨機(jī)分為模型組(B組)、電針組(C組)、阻斷劑NEP1-40組(D組)和電針+阻斷劑NEP1-40組(E組)，每組各12只。

C組采用電針治療，根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)[11]，穴位選取大椎、腰陽(yáng)關(guān)以及雙側(cè)次髎、足三里，穴位定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]相關(guān)內(nèi)容，穴位局部備皮，進(jìn)針約0.5～0.7 cm，大椎及腰陽(yáng)關(guān)接一對(duì)電極，雙側(cè)次髎、足三里各接一對(duì)電極，正極在上，負(fù)極在下，電針參數(shù)選擇疏密波，頻率為100/2 Hz，交替持續(xù)時(shí)間為1.5 ms，波寬0.4 ms，電流強(qiáng)度以肢體肌肉出現(xiàn)輕微跳動(dòng)為度，持續(xù)時(shí)間20 min，每天1次，共14 d。

D組大鼠通過微量進(jìn)藥器經(jīng)PE10導(dǎo)管緩慢推注NEP1-40 18 μg(溶入PBS溶液30 μl中)[13]，每天1次，共治療14 d。

E組采用電針和NEP1-40注射治療。

A組和B組大鼠不進(jìn)行任何治療，但與其他組進(jìn)行同樣抓取和相同的固定。

1.3.3 BBB評(píng)分

為盡量減少主觀因素的影響，分別于治療第1、7、14天采用雙人、單盲法對(duì)所有大鼠進(jìn)行BBB評(píng)分[14]，評(píng)分前每只大鼠排空膀胱，以免因膀胱充盈造成大鼠行為異常。將大鼠放于空曠的平地上自由活動(dòng)，每次活動(dòng)3 min，每次每只大鼠評(píng)測(cè)3次，取平均值。0分表示完全性截癱，21分表示正常。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.4.1 標(biāo)本采集

按實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，治療第7、14天結(jié)束后隨機(jī)處死每組大鼠各4只，迅速置于冰盤上取脊髓T10(中央為損傷區(qū))節(jié)段區(qū)的脊髓組織，置于液氮中冷凍，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)(RT-qPCR)

首先用Trizol抽提總mRNA，以逆轉(zhuǎn)錄(RT法)先合成cDNA，然后再PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，然后95℃15 s，60℃45 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)，在60℃時(shí)收集熒光信號(hào)，熒光通道選擇SYBR，最后延伸72℃7 min。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件(ABI Prism 7300 SDS Software)分析，用2-△Ct值法對(duì)脊髓組織中p75NTR mRNA表達(dá)量分析，即相對(duì)mRNA表達(dá)=2-△Ct×100%，其中△Ct＝靶基因Ct值－管家基因Ct值[15]。引物由上海基爾頓生物科技有限公司合成，p75NTR上游引物序列為5'-GCTCCATTTCCATCTCAG-3'，下游引物序列為5'-AGGTCCGTAATCCTCTTC-3'；GAPDH上游引物序列為5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3'，下游引物序列為5'-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3'。

1.4.3 原位雜交檢測(cè)

切片采用二甲苯脫蠟3次，每次5 min；100%、96%和70%的酒精梯度去除二甲苯；PBS清洗2～5 min，空氣中干燥；去蛋白酶，梯度酒精脫水；每張玻片上加雜交液50～100 μl，探針濃度為10 μmol/L；膠水封片，放到雜交儀上進(jìn)行雜交；條件為95℃5 min、37℃12～16 h。在37℃下按5×SSC、1×SSC、0.2×SSC溶液梯度洗片各5 min；室溫下，0.2×SSC洗片5 min，PBS沖洗5 min；甩干玻片，封閉液封閉15 min；用紙吸干封閉液，加羅丹明抗-地高辛抗體或FITC卵白素30～60 μl，室溫下孵育1 h；加DAB顯色液/DAPI染色液，覆蓋蓋玻片并在室溫下孵育2～5 min；蘇木精襯染，酒精脫水，二甲苯透明，防淬滅封片劑封片后熒光顯微鏡拍照[16]。每張切片隨機(jī)選取上、中、下、左、右5個(gè)視野，采用Image pro plus 6.0軟件對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后取平均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。p75NTR探針信息：5'-CAA CAG CCG CCC CGT GAA CCA GAC GCC CCC ACC GGA GGG AGA GAA ACT GCA CAG CGA CAG TGG CAT CTC TGT GGA CAG CCA GAG CCT GCA CGA CCA GCA GAC CCATAC GCAGAC TGC CTCAGG CCAGGC C-3'。

1.4.4 Western blotting

將RT-qPCR提取后剩余物以1200 r/min離心15 min，取上清，樣品勻漿后采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。將PAGE膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液至其充分浸入，拔掉梳子。根據(jù)先前蛋白定量結(jié)果決定取量，每孔上樣蛋白80 μg，加入相應(yīng)上樣緩沖液調(diào)至相等的濃度，將其煮沸變性后離心取上清上樣，將準(zhǔn)備好的樣品加入對(duì)應(yīng)孔中。電泳條件：8%濃縮膠恒壓800 V，20 min；15%分離膠恒壓120 V，60 min。當(dāng)染料移動(dòng)到凝膠底部時(shí)，停止電泳，取下凝膠，半干轉(zhuǎn)的電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將其置于麗春紅染色工作液(2%的麗春紅貯備液1∶10稀釋，即加9倍的ddH2O)中，染色5～10 min，隨后用大量的水洗膜直至蛋白條帶出現(xiàn)。將膜浸沒在TBST溶解的5%脫脂奶粉中，37℃振蕩封閉1 h，依次加p75NTR兔抗鼠多克隆一抗(1∶500)和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶1000)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色、壓片、曝光、顯影、沖洗膠片，采用凝膠成像儀采集圖像[17]。使用分析軟件對(duì)相關(guān)條帶的灰度值進(jìn)行分析，以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算p75NTR與GAPDH的灰度比值，表示相對(duì)p75NTR蛋白水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均用(xˉ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊采用LSD t檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett's T3檢驗(yàn)；組內(nèi)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性水平ɑ=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BBB評(píng)分

造模1 d后各模型組BBB評(píng)分都為0分，各組大鼠均未見后肢運(yùn)動(dòng)，表明脊髓損傷模型是成功的。治療7 d、14 d后，與B組比較，不同治療組BBB評(píng)分均明顯提高(P＜0.01)；E組BBB評(píng)分較同時(shí)間點(diǎn)C組、D組運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分均提高(P＜0.05)；同時(shí)間點(diǎn)C組與D組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。各治療組在治療14 d后BBB評(píng)分較7 d時(shí)明顯提高(P＜0.01)。見表1。

表1 各組BBB評(píng)分比較

2.2 p75NTR mRNA的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，B組、C組、D組和E組大鼠在治療7 d、14 d后p75NTR mRNA表達(dá)較同時(shí)間點(diǎn)A組均提高(P＜0.05)；各治療組在治療7 d、14 d后p75NTR mRNA表達(dá)較同時(shí)間點(diǎn)B組明顯降低(P＜0.01)；E組在治療7 d、14 d后p75NTR mRNA表達(dá)較同時(shí)間點(diǎn)C組、D組均降低，但三者間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。各組內(nèi)7 d與14 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表2RT-qPCR各組p75NTR mRNA相對(duì)表達(dá)(PCR方法) (2-△Ct，×100)

注：與A組比較，a.P＜0.01;b.P＜0.05；與B組比較，c. P＜0.01

原位雜交檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果顯示，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒樣著色，陰性結(jié)果不顯色或顯色不清。7 d和14 d時(shí)，A組脊髓只有少量p75NTR mRNA表達(dá)，而B組、C組、D組和E組p75NTR表達(dá)增加(P＜0.05)。各治療組p75NTR的表達(dá)較B組下降(P＜0.05)；除E組在14 d的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較C組下降(P＜0.05)外，C、D、E三組之間陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。D組和E組14 d的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較同組7 d比較均降低(P＜0.05)；其他三組于7 d與14 d前后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)之間均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見表3和圖1。

表3 原位雜交檢測(cè)各組p75NTR mRNA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

圖1 原位雜交檢測(cè)各組大鼠脊髓p75NTR mRNA表達(dá)(400×)

2.3 p75NTR蛋白的表達(dá)

B組、C組、D組和E組在治療7 d、14 d后p75NTR蛋白表達(dá)較同時(shí)間點(diǎn)A組均提高(P＜0.05)。各治療組大鼠在治療7 d、14 d后p75NTR蛋白表達(dá)較同時(shí)間點(diǎn)B組均明顯降低(P＜0.01)。治療7 d后，E組p75NTR蛋白表達(dá)較C組、D組均有降低趨勢(shì)，但只與C組比較有顯著性差異(P＜0.05)，與D組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；治療14 d后，E組p75NTR蛋白表達(dá)較C組、D組均有降低，但三者比較均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。同組于7 d與14 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見表4和圖2。

表4 各組p75NTR蛋白表達(dá)的比較(p75NTR/GAPDH，×100)

圖2Western blotting法檢測(cè)各組治療7 d和14 d p75NTR蛋白表達(dá)

3 討論

脊髓損傷屬于中醫(yī)“痿證”范疇，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為肢體運(yùn)動(dòng)、感覺和大小便功能障礙。根據(jù)其病因及臨床表現(xiàn)，筆者將其病機(jī)歸納為“督脈瘀阻不通為本、腸腑和膀胱功能失調(diào)為標(biāo)”[4]。根據(jù)這一病機(jī)特點(diǎn)，通過大量文獻(xiàn)及臨床研究，筆者自擬了一種以“通督、通(腸)腑、通調(diào)膀胱”為取穴特點(diǎn)的“三通針法”針灸處方[4,18]。本實(shí)驗(yàn)所選3組穴位均為課題組經(jīng)過臨床研究及參考大量文獻(xiàn)[1,11,19]選取，其選穴意義為：取督脈經(jīng)穴大椎、腰陽(yáng)關(guān)，符合外傷性脊髓損傷致截癱之督脈痹阻病機(jī)，乃“經(jīng)通所過，主治所及”之意；針之要?dú)庵劣行?，針刺可直達(dá)病灶，既可培補(bǔ)督脈之陽(yáng)，又可疏通經(jīng)氣使之上下貫通，陽(yáng)氣暢通；而構(gòu)建督脈與臟腑經(jīng)脈(腎與腦髓)之間功能聯(lián)系，使氣血津液精髓運(yùn)行恢復(fù)，從而充養(yǎng)督脈，使督脈脈氣充盈，故截癱可愈。脊髓損傷后期，因督脈痹阻，督陽(yáng)失運(yùn)日久，必然導(dǎo)致精虧髓枯、氣血虧虛，選用足陽(yáng)明經(jīng)穴足三里，陽(yáng)明經(jīng)為多氣多血之經(jīng)，取“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”之意，以調(diào)胃健脾，養(yǎng)血榮筋；又取《四總穴歌》“肚腹三里留”之意，以通調(diào)腸腑。選取膀胱經(jīng)穴次髎，通暢腸腑、通調(diào)膀胱，使大小便功能逐漸恢復(fù)。加之電針的持續(xù)刺激，使損傷局部形成脈沖電場(chǎng)，通過電針刺激可以改善損傷局部組織的血液微循環(huán)，且又能促進(jìn)腦脊液流動(dòng)，減輕脊髓損傷部位的水腫和血腫的壓迫及粘連，從而抑制脊髓繼發(fā)性損傷[20-21]；另外電針又增強(qiáng)脊髓損傷后尼氏體的恢復(fù),促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)的修復(fù)與再生和肢體功能的恢復(fù)[22]。

p75NTR主要在神經(jīng)細(xì)胞的早期發(fā)育過程中豐富表達(dá)，在神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)、增殖、遷移、分化，突觸的建立和神經(jīng)的形成、凋亡等一系列過程中發(fā)揮關(guān)鍵性的生物學(xué)效應(yīng)。p75NTR是NgR的協(xié)同受體，共同免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明p75NTR與NgR的結(jié)合共同調(diào)節(jié)所有MAG的抑制活性[7]。在肌萎縮側(cè)索硬化、阿爾茨海默病、脊髓損傷、腦缺血中，都存在p75NTR的表達(dá)增高[23-24]；敲除或阻斷p75NTR信號(hào)可以延緩病情發(fā)生和促進(jìn)細(xì)胞存活。p75NTR與脊髓損傷間的病理關(guān)系密切。脊髓損傷中除了壞死和炎癥造成的細(xì)胞死亡，凋亡造成的二次損傷發(fā)揮了極重要的作用。本研究顯示，脊髓損傷后p75NTR呈高表達(dá)狀態(tài)；經(jīng)治療后p75NTR表達(dá)下降，除蛋白表達(dá)在治療7 d后E組較C組有明顯降低外，其余各治療組在各治療點(diǎn)，p75NTR的表達(dá)比較均無(wú)顯著性差異；且各組組內(nèi)治療7 d和14 d相比較，二者無(wú)顯著性差異。原因可能是脊髓損傷后p75NTR表達(dá)很快就出現(xiàn)，且高峰在治療7 d前已過。呂威等[25]研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后大鼠p75NTR的表達(dá)在術(shù)后3 d時(shí)達(dá)到高峰，而本實(shí)驗(yàn)是大鼠造模幾天后才開始治療，這可能提示針對(duì)個(gè)別指標(biāo)，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上還有待于改進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)BBB評(píng)分結(jié)果表明，治療第1天各組大鼠均為0分，干預(yù)7 d、14d后各治療組評(píng)分均明顯提高；且E組評(píng)分明顯優(yōu)于C組、D組，說明電針、NEP1-40治療后均能促進(jìn)損傷后神經(jīng)的再生修復(fù)作用，改善大鼠后肢的活動(dòng)功能；且電針+NEP1-40干預(yù)治療優(yōu)于單一方法。另外，治療14 d后BBB評(píng)分較同組治療7 d時(shí)評(píng)分均有所提高，結(jié)合各干預(yù)治療方法對(duì)p75NTR表達(dá)的影響，電針可能還通過其他途徑來促進(jìn)損傷處脊髓神經(jīng)的修復(fù)與再生。

因此，本研究表明，電針通過降低p75NTR信號(hào)的調(diào)控，有效降低對(duì)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的抑制作用，可能是其發(fā)揮治療脊髓損傷作用的重要分子機(jī)制之一。

[1]高潔,程立紅,閔友江.針灸治療脊髓損傷恢復(fù)期的臨床研究概況[J].按摩與康復(fù)醫(yī)學(xué),2015,6(3):18-21.

[2]王智琴,閔友江.熱敏灸治療不完全性脊髓損傷性尿潴留的療效觀察[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,36(3):60-63.

[3]王文春,盧家春,王倩,等.“截癱三聯(lián)針法”對(duì)外傷性脊髓損傷患者日常生活活動(dòng)能力的影響[J].中國(guó)針灸,2012,32(10): 877-881.

[4]閔友江,程立紅,高潔,等.三通針法治療脊髓損傷恢復(fù)期截癱患者臨床觀察[J].上海針灸雜志,2013,32(10):1010-1013.

[5]閔志云,程立紅,閔友江.Nogo/NgR通路在脊髓神經(jīng)再生中的研究進(jìn)展[J].江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2016,28(3):103-105.

[6]楊俊鋒,張亞峰,馬勇,等.大鼠脊髓損傷后勿動(dòng)蛋白受體的動(dòng)態(tài)表達(dá)[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2014,20(10):919-923.

[7]Wang KC,Kim JA,Sivasankaran R,et al.p75 interacts with the Nogo receptor as a coreceptor for Nogo,MAG and OMgp[J].Nature,2002,420(691):74-78.

[8]GrandPré T,Li S,Strittmatter SM.Nogo-66 receptor antagonist peptide promotes axonal regeneration[J].Nature,2002,417 (6888):547-551.

[9]尹明錫,時(shí)素華,宋萌,等.電針對(duì)大鼠脊髓損傷后Nogo-A表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J].陜西中醫(yī),2010,31(3):371-373.

[10]伍芳,龔標(biāo),李學(xué)智,等.電針對(duì)局灶性腦梗死大鼠Nogo-A及其受體NgR和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013,35(3):228-232.

[11]高潔,張?jiān)平?閔友江,等.針灸治療截癱的腧穴研究及應(yīng)用[J].江西中醫(yī)藥,2013,44(2):54-56.

[12]張露芬.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010: 219-220.

[13]郭愛麗,朱薇薇,王麗,等.Nogo-A受體拮抗劑NEP1-40對(duì)新生大鼠HIBD中神經(jīng)元軸突再生的影響[J].中國(guó)兒童保健雜志,2008,16(6):679-681.

[14]Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats[J].J Neurotrauma,1995,12:1-21.

[15]閔志云,程立紅,閔友江.電針對(duì)脊髓損傷大鼠Nogo/NgR信號(hào)通路相關(guān)因子基因表達(dá)的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2016,39(11):926-932.

[16]Zhang L,Ni YQ,Li YF.Ligustrazine facilitates hair cell regeneration in the cochlea following gentamicin ototoxicity[J]. Neural Regen Res,2010,5(10):735-740.

[17]Yang TW,Song XS,Wang P,et al.Effect of extracellular signal-regulated kinase and nitric oxide on compressive neuralgia formation and maintenance[J].Neural Regen Res,2010,5(10): 757-763.

[18]閔友江,程立紅,張舉玲,等.基于臨床路徑模式的脊髓損傷恢復(fù)期針灸、康復(fù)、護(hù)理三位一體治療方案制訂的初探[J].醫(yī)學(xué)信息,2012,12(25):273-274.

[19]于金娜,馬曉晶,劉志順,等.電針“次髎”穴對(duì)逼尿肌反射亢進(jìn)大鼠骶髓排尿中樞c-fos表達(dá)的影響[J].針刺研究,2010, 35(3):204-208.

[20]鄧娜,高敏.電針治療脊髓損傷的基礎(chǔ)理論研究[J].甘肅中醫(yī),2009,22(3):11-12.

[21]李志剛,劉如春,耿直,等.電針對(duì)急性脊髓損傷大鼠差異表達(dá)基因及鈣離子作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2008,31(7):486-489.

[22]杜旭,王瑞輝.電針對(duì)脊髓損傷大鼠尼氏體和神經(jīng)功能的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2011,22(4):995-996.

[23]Beattie MS,Harrington AW,Lee R,et al.ProNGF induces p75-mediated death of oligodendro-cytes following spinal cord injury[J].Neuron,2002,36(3):375-386.

[24]Harrington AW,Leiner B,Blechschmitt C,et al.Secreted proNGF is a pathophysiological death-inducing ligand after adult CNS injury[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(16): 6226-6230.

[25]呂威,莫雨平,李冰,等.督脈電針對(duì)不同時(shí)間段脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能及p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2016,22(8):876-883.

Effect of Santong Electroacupuncture on Expression of p75 Neurotrophin Receptor in Rats with Spinal Cord Injury

MIN You-jiang,CHENG Li-hong,YAO Hai-hua,YANG Liu,MIN Zhi-yun,PEI Jia
Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang,Jiangxi 330006,China

YAO Hai-hua.E-mail:1850396047@qq.com

Objective To investigate the effect of Santong electroacupuncture(EA)on mRNA and protein expression of p75 neurotrophin receptor(p75NTR)in rats with spinal cord injury(SCI).Methods A total of 72 female Sprague-Dawley rats were randomly assigned to sham operation group(group A,n=8)and model group(n=64).In the model group,Allen's method was used to make SCI rats model,in which 48 survived model rats were further subdivided into model control group(group B,n=12),EA group(group C,n=12),inhibitor Nogo extra cellular peptide residues 1-40(NEP1-40)group(group D,n=12)and EA+inhibitor NEP1-40 group(group E,n=12)according to design proposal.The treatment groups were electroacupunctured on Dazhui(GV14)and Yaoyangguan(GV3),bilateral Ciliao(BL32)and Zusanli(ST36)with loose-tight wave,for 20 minutes every day.After 7 and 14 days of treatment,injured spinal cord tissue was extracted for detecting.The mRNA and protein expression of p75NTR was detected by real-time fluorescent quantitative PCR,in situ hybridization and Western blotting respectively.The hind limb motor function was assessed with Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)score.Results The BBB score increased in the treatment groups compared with group B,and was higher in group E than in groups C and D(P＜0.05),as well as on the 14th day than on the 7thday in all the treatment groups(t＞2.623,P＜0.05).The mRNA and protein expression of p75NTR in spinal cord tissues decreased in the treatment groups compared with group B(P＜0.05),and no significant difference was found among the treatment groups(P＞0.05).Conclusion Santong elerctroacupuncture treatment could improve the hind limb motor function,which may associate with inhibition of the mRNAand protein expression of p75NTR in rats after SCI.

spinal cord injury;electroacupuncture;neural regeneration;p75 neurotrophin receptor;rats

R651.2

A

1006-9771(2017)06-0621-07

2016-10-08

2016-12-14)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.06.001

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81360562)。

江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院針灸康復(fù)分院，江西南昌市330006。作者簡(jiǎn)介：閔友江(1975-)，男，漢族，江西安義縣人，副主任中醫(yī)師、副教授、碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：神經(jīng)及運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病的針灸治療。通訊作者：姚海華(1981-)，女，江西新干縣人，主治中醫(yī)師，主要研究方向：中醫(yī)外科疾病的治療與研究工作。E-mail:1850396047@qq.com。