基于MOCPs-MWCNTs的大腸桿菌電化學(xué)免疫傳感器

楊 華 徐霞紅 郭玉娜 肖英平 唐 標(biāo) 王 強(qiáng)

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所， 杭州 310021)

基于MOCPs-MWCNTs的大腸桿菌電化學(xué)免疫傳感器

楊 華 徐霞紅 郭玉娜 肖英平 唐 標(biāo) 王 強(qiáng)

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所， 杭州 310021)

食源致病菌引起的食品安全問(wèn)題已成為全世界關(guān)注的焦點(diǎn)。設(shè)計(jì)了一種基于多壁碳納米管(MWCNTs)-有機(jī)配位聚合物(MOCPs)高效固定抗體的大腸桿菌電化學(xué)免疫傳感器。利用NaAuCl4與1,4-苯二硫醇(BDT)反應(yīng)生成金屬有機(jī)配位聚合物，同時(shí)在BDT的還原作用下生成大量納米金，并包埋大量吸附在MWCNTs表面的大腸桿菌抗體，最終將抗體高效包埋在MOCPs-MWCNTs中，基于MOCPs-MWCNTs固定抗體研制修飾電極，在目標(biāo)物大腸桿菌O157:H7的存在下，辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的抗體(HRP-Ab)隨后特異性捕獲于電極表面形成典型夾心結(jié)構(gòu)，通過(guò)HRP催化底物產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)從而實(shí)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7的檢測(cè)。MOCPs-MWCNTs特有的高比表面積高效固定了大量抗體，增加了傳感器結(jié)合抗體的效率并提高了傳感器的靈敏度。該傳感器對(duì)大腸桿菌O157:H7的檢測(cè)線性范圍為67～6.7×106cfu/mL，最低檢出限為40 cfu/mL。

大腸桿菌O157:H7； 金屬有機(jī)配位聚合物； 多壁碳納米管； 電化學(xué)免疫傳感器

引言

細(xì)菌污染是威脅人類健康的最嚴(yán)峻食品安全問(wèn)題之一[1-2]。在眾多的食源性致病菌中，大腸桿菌O157：H7是危害最大的致病菌之一，可引起嚴(yán)重的食源性疾病，甚至導(dǎo)致死亡[3]。傳統(tǒng)的大腸桿菌定量方法如平板計(jì)數(shù)法大多基于微生物培養(yǎng)技術(shù)，通常至少需要2～3 d才能獲得準(zhǔn)確結(jié)果，難以滿足農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管需求。目前，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[4]、化學(xué)發(fā)光[5]、石英晶體微天平(QCM)[6]、酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)[7]等技術(shù)發(fā)展了多種大腸桿菌快速檢測(cè)方法，但在靈敏度、穩(wěn)定性、現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)能力上難以同時(shí)滿足需求。因此，迫切需要開發(fā)新方法用于高靈敏、高特異性檢測(cè)大腸桿菌O157：H7。

免疫測(cè)定法是基于抗原與抗體的高特異性識(shí)別來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原或抗體的定量分析方法，由于能避免復(fù)雜前處理過(guò)程以及具有高靈敏性和特異性響應(yīng)，被認(rèn)為是生物分析法和臨床的一個(gè)非常強(qiáng)大的工具[8-9]。而電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)(EIA)憑借檢測(cè)速度快、兼容性好、成本低、易小型化等優(yōu)點(diǎn)引起廣大研究者關(guān)注[10]?？贵w的固定是決定電化學(xué)免疫傳感器性能的關(guān)鍵步驟之一，研制高效固定材料，最大量將抗體修飾在電極表面是亟待解決的問(wèn)題。

金屬有機(jī)配位聚合物(MOCPs)是由金屬離子(或金屬氧簇)與有機(jī)物配體通過(guò)自組裝相互連接構(gòu)筑具有規(guī)則孔道或孔穴結(jié)構(gòu)的框架材料[11]。MOCPs作為一種新型微孔材料，具有豐富的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和多孔性[12-13]，近年來(lái)，在氣體儲(chǔ)存[14]、化學(xué)分離[15]、傳感[16]、催化[17]和藥物釋放與傳送[17-18]等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。另一方面，碳納米管(CNTs)由于獨(dú)特的導(dǎo)電性、高比表面積及強(qiáng)吸附能力，是生物分子高效固定的最佳選擇之一[19-20]。結(jié)合MOCPs及CNTs性能，研制高效固定抗體基質(zhì)材料具有重要的價(jià)值。

本文引入高比表面積的多壁碳納米管(MWCNTs)與MOCPs作為抗體固定基質(zhì)，采用1,4-苯二硫醇(BDT)單體與NaAuCl4配位，快速配位過(guò)程中包埋大量吸附在MWCNTs上的抗體，在此基礎(chǔ)上制備大腸桿菌O157：H7抗體修飾電極，以發(fā)展更高效靈敏的EIA方法，并研究其在牛奶實(shí)際樣品中的應(yīng)用。

1 原理

圖1為電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建過(guò)程，圖2為構(gòu)建的傳感器通過(guò)HRP催化底物產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)圖。MOCPs-MWCNTs固定基質(zhì)的制備過(guò)程如圖1a所示。NaAuCl4與BDT反應(yīng)生成金屬有機(jī)配位聚合物，同時(shí)在BDT的還原作用下生成大量納米金，并包埋大量吸附在MWCNTs表面的大腸桿菌抗體，將抗體高效包埋在MOCPs-MWCNTs中。基于免疫傳感技術(shù)高靈敏、高選擇性檢測(cè)大腸桿菌O157:H7的新型電化學(xué)傳感器實(shí)驗(yàn)原理如圖1b所示，制備的MOCPs-MWCNTs修飾于金電極的表面，不僅能夠增強(qiáng)電子傳遞效率，還能夠通過(guò)嵌入方式增加捕獲抗體(Ab)的固定效率與穩(wěn)定性。BSA修飾到電極表面用于封閉未特異性結(jié)合位點(diǎn)并減少非特異性吸附。當(dāng)電極在大腸桿菌O157:H7菌液中孵育后，采用HRP標(biāo)記抗體(HRP-Ab)再次特異性結(jié)合電極表面的大腸桿菌，通過(guò)HRP催化檢測(cè)底液中的過(guò)氧化氫(H2O2)和對(duì)苯二酚(HQ)，記錄催化產(chǎn)物對(duì)苯二醌的電化學(xué)信號(hào)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的定量檢測(cè)。

圖2 傳感器的電化學(xué)響應(yīng)圖Fig.2 Typical DPV responses of biosensor

2 試驗(yàn)

2.1 儀器及試劑

SU8010型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡,日立高新技術(shù)公司；FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN型場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡,美國(guó)FEI公司；PANalyticalX’Pert PRO型X射線衍射儀,荷蘭PANalytical公司；Primo R型低溫冷凍離心機(jī),美國(guó)熱電公司；CHI660E型電化學(xué)工作站,上海辰華儀器有限公司；SCILOGEX MX-S型旋渦混合器,美國(guó)賽洛捷克公司。

大腸桿菌O157：H7抗體以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的大腸桿菌O157：H7抗體(HRP標(biāo)記的抗體)購(gòu)自上海般若生物技術(shù)有限公司。大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌、大腸桿菌DH5α和大腸桿菌O149由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供。MWCNTs(長(zhǎng)度10～20 μm, 純度95%以上)購(gòu)于南京先豐納米材料科技有限公司。BDT、HAuCl4·3H2O和HQ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，H2O2、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉均為分析純，購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)。牛奶購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

2.2 MOCPs與MWCNTs-MOCPs的合成

MWCNTs-MOCPs合成步驟如下：將60 μL(1 mg/mL)MWCNT與60 μL NaAuCl4(0.05 mol/L)于超聲條件下加入至1 mL PBS(pH值7.0)中，攪拌2 h，然后加入600 μL 1 mg/mL BDT和4 mg大腸桿菌O157：H7捕獲抗體。將混合物攪拌10 min 后形成嵌有抗體的MWCNTs-MOCPs復(fù)合材料。MOCPs的合成方法除未加入MWCNT外與MWCNTs-MOCPs合成方法一致。最后將所制備的生物復(fù)合物懸浮液離心分離，沉淀物洗滌3次，分散在200 μL水中低溫保存。

2.3 傳感器制備

大腸桿菌采用LB培養(yǎng)基(蛋白胨12 g、酵母提取物6 g和NaCl 7 g)培養(yǎng)24 h，將懸浮液貯存于4℃?zhèn)溆?。大腸桿菌O157：H7的濃度通過(guò)平板計(jì)數(shù)確定。免疫傳感器的構(gòu)建使用典型的免疫夾心步驟。6 μL的MWCNTs-MOCPs孵育修飾于電極表面，室溫下干燥2 h后用10 mmol/L的PBS清洗，然后修飾5%的BSA封閉電極，制得MWCNTs-MOCPs修飾電極。

2.4 免疫分析大腸桿菌O157:H7

所制MWCNTs-MOCPs修飾電極表面滴加10 μL不同濃度大腸桿菌O157：H7的溶液，在37℃下孵育60 min后用PBS小心洗滌。隨后將10 μL的0.5 mg/mL HRP標(biāo)記抗體溶液滴加在電極表面，37℃孵育60 min后經(jīng)PBS小心洗滌3次，將電極浸入到檢測(cè)底液中進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量。電化學(xué)測(cè)量采用傳統(tǒng)三電極體系，Ag/AgCl為參比電極，鉑電極為輔助電極，金電極(直徑3 mm)為工作電極。電化學(xué)分析方法包括差分脈沖伏安法(DPV)和循環(huán)伏安法(CV)均在室溫(20℃)進(jìn)行。DPV掃描范圍-0.2～0.2 V，底液為含3 mmol/L HQ和1.5 mmol/L H2O2的10 mmol/L PBS(pH值7.4)，脈沖高度為50 mV，階梯高度4 mV，頻率15 Hz。CV掃描范圍-0.2～0.6 V，掃描速率為50 mV/s，底液為含5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]的10 mmol/L PBS。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

為檢驗(yàn)該傳感器是否可應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)，采用牛奶進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，樣品除以PBS稀釋外無(wú)其他前處理步驟。均分3份，分別添加6.7×102、6.7×103、6.7×104cfu/mL的大腸桿菌，其余實(shí)驗(yàn)條件保持一致(如2.3、2.4節(jié))。

3 結(jié)果與討論

3.1 MOCPs與MWCNTs-MOCPs的表征

3.1.1 掃描電子顯微鏡(SEM)表征

用SEM表征MOCPs與MWCNTs-MOCPs的微觀形態(tài)和結(jié)構(gòu)。如圖3a所示，發(fā)現(xiàn)了MOCPs的微觀片狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)電極表面修飾MWCNTs-MOCPs后，可以清晰看到MWCNTs包裹在MOCPs中(圖3b)，這充分證明MOCPs與MWCNTs-MOCPs都已經(jīng)制備完成。

圖3 MOCPs與MWCNTs-MOCPs的SEM表征Fig.3 SEM images of MOCPs and MWCNTs-MOCPs

3.1.2 透射電子顯微鏡(TEM)表征

為進(jìn)一步研究MOCPs與MWCNTs-MOCPs的微觀形態(tài)，對(duì)其進(jìn)行了TEM表征，其結(jié)果如圖4所示。MOCPs大小分布均勻，可觀察到大量納米金在聚合物內(nèi)形成(圖4a)。當(dāng)加入MWCNTs時(shí)，MOCPs增加了MWCNTs的管徑厚度，并有大量的納米金和生物聚合物吸附在MWCNTs表面，進(jìn)一步證明了MOCPs與MWCNTs-MOCPs的成功制備。

圖4 MOCPs與MWCNTs-MOCPs的TEM表征Fig.4 TEM images of MOCPs and MWCNTs-MOCPs

3.1.3 X單晶衍射(XRD)表征

為研究MOCPs與MWCNTs-MOCPs的結(jié)晶情況，對(duì)其進(jìn)行了XRD表征，其結(jié)果如圖5所示。圖中2θ表示X射線衍射角度?？梢钥闯鯴RD譜圖峰型較好，有結(jié)晶出現(xiàn)，與金的標(biāo)準(zhǔn)峰相比，MOCPs與MWCNTs-MOCPs都含有金。同時(shí)該表征也進(jìn)一步證明了MOCPs與MWCNTs-MOCPs已成功合成。

圖5 MOCPs與MWCNTs-MOCPs的XRD表征Fig.5 XRD patterns of MOCPs and MWCNTs-MOCPs

圖6 傳感器的CV 和EIS 表征Fig.6 CV and EIS of EIA sensor

3.2 電極組裝的電化學(xué)表征

電極表面的層層組裝是傳感器構(gòu)建的重要步驟，用CV表征了電極的構(gòu)建過(guò)程，如圖6所示。裸金電極(曲線a)出現(xiàn)一對(duì)標(biāo)準(zhǔn)氧化還原峰(0.26 mV和0.18 mV)，分別對(duì)應(yīng)了K3[Fe(CN)6]的特征氧化還原峰，當(dāng)電極修飾了MWCNTs-MOCPs后，氧化還原峰出現(xiàn)微小的降低，可能是由于MWCNTs-MOCPs對(duì)電子傳遞效率的促進(jìn)與抗體對(duì)電子傳遞速率阻礙的雙重作用導(dǎo)致的(曲線b)，隨著大腸桿菌O157:H7的修飾，化學(xué)信號(hào)再次降低，這同時(shí)也證明了大腸桿菌已經(jīng)修飾到電極表面(曲線c)。當(dāng)HRP-Ab修飾后，可以觀察到生物大分子對(duì)電子傳

遞速率的阻礙減小了電化學(xué)信號(hào)(曲線d)。圖6b描繪了修飾電極過(guò)程中相對(duì)應(yīng)的修飾電極交流阻抗(EIS)變化，圖中Z′、-Z″分別表示實(shí)部和虛部。裸金電極的阻抗幾乎為直線(曲線a)。而阻抗(半圓的直徑)隨MWCNTs-MOCPs(曲線b)、大腸桿菌(曲線c)、HRP-Ab(曲線d)逐步修飾在電極表面而增大，結(jié)果與CV一致。上述結(jié)果表明大腸桿菌電化學(xué)免疫傳感器已成功制備。

3.3 大腸桿菌檢測(cè)

采用該生物傳感器測(cè)定一系列不同濃度的大腸桿菌O157:H7。圖7a給出了對(duì)于梯度濃度大腸桿菌O157:H7的電化學(xué)響應(yīng)。發(fā)現(xiàn)在所測(cè)菌體濃度范圍內(nèi)電化學(xué)響應(yīng)隨大腸桿菌濃度增大而提高，當(dāng)菌體濃度大于6.7×106cfu/mL時(shí)，DPV響應(yīng)不再隨大腸桿菌濃度增高而增大。且DPV響應(yīng)與大腸桿菌菌體濃度的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系(圖7b)，關(guān)系式為I=3.672lgCE. coli-4.138，線性相關(guān)系數(shù)為0.997，最低檢測(cè)限為40 cfu/mL。

3.4 傳感器性能

圖7 傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Calibration curves of EIA sensor

同時(shí)采用非目標(biāo)細(xì)菌(如沙門氏菌、大腸桿菌DH5α和大腸桿菌O149)，研究了此電化學(xué)免疫傳感器的特異性。該電化學(xué)免疫傳感器對(duì)大腸桿菌O157:H7的電流響應(yīng)值為21.5 μA，而其他菌體的電流響應(yīng)值均在2.7 μA左右，并未對(duì)檢測(cè)體系產(chǎn)生明顯的干擾作用，這表明該電化學(xué)免疫傳感器對(duì)大腸桿菌O157:H7表現(xiàn)出極好的特異性。同時(shí)，為探討生物傳感器的重現(xiàn)性，5根相同修飾過(guò)程的電極分別用來(lái)測(cè)定6.7×104cfu/mL大腸桿菌O157:H7，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.73%，表明該電化學(xué)免疫傳感器具有很好的重現(xiàn)性。此外還探究了該傳感器的穩(wěn)定性，5根獨(dú)立電極采用相同條件制備，于4℃儲(chǔ)存14 d，檢測(cè)最終信號(hào)約為最初信號(hào)的92%。表明該電化學(xué)免疫傳感器具有很好的穩(wěn)定性。

3.5 實(shí)際樣品分析

為進(jìn)一步考察該傳感器的應(yīng)用潛力，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，探討了牛奶實(shí)際樣品中的檢測(cè)性能。將菌體濃度為6.7×102、6.7×103、6.7×104cfu/mL的大腸桿菌O157:H7添加到3個(gè)牛奶樣品中，樣品除了PBS緩沖液稀釋沒有更多的預(yù)處理。實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果如表1所示。該電化學(xué)免疫傳感器所得的回收率范圍在94.5%～103.3%之間。此外，將經(jīng)典的平板計(jì)數(shù)法與該傳感器的結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，差距小于12.4%。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該電化學(xué)免疫傳感器在實(shí)際應(yīng)用中具有很大的潛力。

表1 實(shí)際樣品分析

4 結(jié)束語(yǔ)

設(shè)計(jì)了一個(gè)基于MWCNTs-MOCPs高效固定抗體的大腸桿菌O157:H7電化學(xué)免疫傳感器。對(duì)MOCPs及MWCNTs-MOCPs進(jìn)行了SEM、TEM、XRD表征，證實(shí)了MOCPs及MWCNTs-MOCPs的成功制備。并將此MWCNTs-MOCPs材料用于抗體的固定基質(zhì)成功修飾在電極表面，制備靈敏的大腸桿菌電化學(xué)傳感器，MWCNTs-MOCPs不僅可以加速電極界面上的電子轉(zhuǎn)移速率，還包埋了大量大腸桿菌O157:H7抗體，提高了抗體修飾效率及穩(wěn)定性。同時(shí)，使用經(jīng)典夾心型免疫方法，實(shí)現(xiàn)了67～6.7×106cfu/mL大腸桿菌的定量測(cè)定。此外，該傳感器也被用于分析大腸桿菌O157:H7實(shí)際樣品，檢測(cè)結(jié)果與平板計(jì)數(shù)法一致。

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Electrochemical Immunosensor Assay (EIA) ofE.coliO157:H7 Based on MOCPs-MWCNTs with Highly Efficient Antibody Immobilization

YANG Hua XU Xiahong GUO Yu’na XIAO Yingping TANG Biao WANG Qiang

(InstituteofQualityandStandardforAgro-products,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310021,China)

Microbiological contamination caused by food-borne diseases has become a major public health problem of the world. A novel electrochemical immunosensor assay (EIA) for high sensitive and specific detection ofEscherichiacoliO157:H7 was developed. A new nanocomposites with multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) embedded inmetal-organic coordination polymers (MOCPs) was successfully prepared as highly efficient matrices of capturing antibody immobilization for sensitive electrochemical biosensing. In the presence of targetE.coliO157:H7, horse radish peroxidase (HRP)-labeled antibody was captured on the electrode surface to form a sandwich-type system via the specific identification. As a result,E.coliO157:H7 detection was realized by outputting a redox current from electro-reduction of hydrogen peroxide reaction catalyzed by HRP. In the assay, the combination of the unique properties of MWCNTs and MOCPs can not only accelerate electron transfer on the electrode interface, but also provide an excellent scaffold for the conjugation of capture antibody. Meanwhile, adopting the MWCNTs-MOCPs materials significantly improved the target capturing efficiency and enhanced the sensitivity of the biosensor. The results revealed that the calibration plot obtained forE.coliO157:H7 was approximately linear from 67 cfu/mL to 6.7×106cfu/mL with the limit of detection of 40 cfu/mL. In addition, the biosensor was successfully applied to quantitative assay ofE.coliO157:H7 in synthetic sample (milk). Hence, the developed electrochemical-based immunosensor might provide a useful and practical tool forE.coliO157:H7 determination and related food safety analysis and clinical diagnosis.

EscherichiacoliO157:H7; metal-organic coordination polymers; multi-walled carbon nanotubes; electrochemical immunosensor

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.06.043

2017-04-20

2017-05-03

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LZ15C170001)

楊華(1972—)，男，高級(jí)畜牧師，主要從事畜產(chǎn)品質(zhì)量安全研究，E-mail： yanghua@mail.zaas.ac.cn

TP212.3； TB383

A

1000-1298(2017)06-0328-06