馬鈴薯淀粉汁水中Patatin的純化及結(jié)構(gòu)研究

孫 瑩,魏冬旭,姚春艷,江連洲

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)旅游與烹飪學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150000;2.黑龍江出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心,黑龍江哈爾濱 150001;3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150000;4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

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馬鈴薯淀粉汁水中Patatin的純化及結(jié)構(gòu)研究

孫 瑩1,魏冬旭2,姚春艷3,江連洲4

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)旅游與烹飪學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150000;2.黑龍江出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心,黑龍江哈爾濱 150001;3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150000;4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

馬鈴薯淀粉汁水經(jīng)分離與純化后得到馬鈴薯糖蛋白Patatin。通過對Patatin純度、結(jié)構(gòu)的測定與分析表明:Patatin純度在90%以上,分子量為40.6 kDa。Patatin是糖和蛋白質(zhì)的復(fù)合物。單糖組成為:鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。Patatin中含有α-糖苷鍵,糖苷類型為吡喃型;糖鏈和肽鏈之間由O-型糖肽鍵連接。Patatin的熱變性溫度為75 ℃。

馬鈴薯淀粉汁水,Patatin,純化,結(jié)構(gòu)

馬鈴薯汁水是馬鈴薯淀粉加工過程中產(chǎn)生的一種副產(chǎn)物,主要成分是馬鈴薯蛋白。馬鈴薯蛋白是一種全蛋白,其賴氨酸和色氨酸均高于谷類作物,營養(yǎng)價值可與雞蛋蛋白相媲美。如果將馬鈴薯汁水直接排放,不僅造成環(huán)境污染,而且還會造成優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)[1]。

Patatin占馬鈴薯塊莖中可溶性蛋白的40%左右[2]。Patatin是馬鈴薯塊莖中主要的貯藏蛋白,與其他貯藏蛋白不同的是Patatin具有酶活性[3-5]。正是由于Patatin在馬鈴薯塊莖中含量較高并且具有酶活性,所以引起了研究者的廣泛興趣。

本研究以馬鈴薯汁水為原料,通過超濾膜分離技術(shù)對汁水進(jìn)行預(yù)處理得到馬鈴薯濃縮蛋白質(zhì),再利用色譜分離技術(shù)對濃縮蛋白進(jìn)行純化,最終得到糖蛋白Patatin。分析了Patatin的純度、單糖組成和熱穩(wěn)定性以及多糖的糖鏈構(gòu)型,以期為進(jìn)一步研究馬鈴薯糖蛋白Patatin結(jié)構(gòu)與活性功能的關(guān)系提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯汁水 內(nèi)蒙古華歐淀粉廠;Con A-Sepharose 4B和Q-Sepharose Fast Flow 美國GE Healthcare公司;三氟乙酸(TFA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)和考馬斯亮藍(lán)G-250 美國Sigma公司;其他試劑為分析純。

PYRIS-1差示掃描量熱儀 英國Perkin Elmer公司;F-4500型熒光分光光度計 日本日立公司;Bruker核磁共振儀 德國Bruker公司;Nexus 470傅立葉變換紅外光譜儀和LCQ Decaxp電噴霧質(zhì)譜 美國Thermo electron公司;Mini Protein Ⅱ電泳儀 美國Bio-Rad公司;GC-2010氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司;Agilent 1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司;AKTA層析系統(tǒng) 美國GE公司;Autoflex Ⅲ飛行時間質(zhì)譜 德國Bruker公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 馬鈴薯濃縮蛋白粉的制備 將收集新鮮的馬鈴薯汁水靜置沉淀,撇去表面的泡沫后用300目和5 μm的濾袋過濾兩次,得到的液體用MWCO 200 kDa超濾膜進(jìn)行過濾,收集膜分離后所得截留液,最后將截留液進(jìn)行干燥得馬鈴薯濃縮蛋白粉,備用[11]。

1.2.2 離子交換柱層析 將超濾截留液干燥后得到的馬鈴薯濃縮蛋白粉進(jìn)行色譜分離。稱取三份200 mg超濾濃縮蛋白粉分別用pH7的5 mL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液溶解,然后在10000 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min,取上清液上離子交換Q-Sepharose Fast Flow(1.6 cm×25 cm)柱,用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(溶解樣品時的pH)平衡,收集離子交換穿透峰,再用平衡液沖洗5個柱體積,然后用含1 mol/L NaCl 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)B液洗脫。100% B液直接洗脫。收集離子交換洗脫液。流速為1.5 mL/min。在280 nm下檢測吸光度。

1.2.3 親和層析 將離子交換洗脫液濃縮后,上Con A-Sepharose 4B(2.6 cm×20 cm)柱。用含1 mol/L NaCl 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)平衡,少量未吸附蛋白穿透,然后用1 mol/L NaCl 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)平衡5個柱體積后,改用含0～100 mmol/Lα-甲基-D-葡萄糖苷和1 mol/L NaCl 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)C液洗脫。流速為1.5 mL/min。在280 nm下檢測吸光度。收集親和層析洗脫液,5000 Da超濾離心管離心10 min,干燥后存于-20 ℃冰箱中,備用。

1.2.4 電泳(SDS-PAGE) 用樣品溶解液(內(nèi)含4% SDS、10%β-巰基乙醇、20%甘油、0.02%溴酚藍(lán)、0.125 mol/L Tris-HCl緩沖液,pH6.8)配制濃度為1 mg/mL蛋白質(zhì)溶液,振蕩混合1 min,100 ℃水浴3 min,備用。參照Park[12]的SDS不連續(xù)電泳方法,分離膠濃度15%,濃縮膠濃度5%,電極緩沖液含0.05 mol/L Tris、0.384 mol/L甘氨酸、0.1% SDS(pH8.3)。電泳采用1.00 mm凝膠板;上樣量為12 μL;開始電泳時電壓為90 V,待樣品進(jìn)入分離膠后改為130 V;電泳結(jié)束后,取出膠片先用固定液固定30 min,再用考馬斯亮藍(lán)R250染色30 min(染色液含有50%的甲醇、6.8%的冰醋酸和1 mg/mL的考馬斯亮藍(lán)),然后用甲醇/冰醋酸脫色液脫至透明(脫色液中含有5%的甲醇和7.5%的冰醋酸)。

1.2.5 凝膠過濾色譜 采用凝膠過濾色譜法分析Patatin的純度。色譜柱:Sephadex G-75(30 cm×1.6 cm);流動相:磷酸緩沖液(0.02 mol/L,pH7.0);流速:0.5 mL/min;檢測波長:280 nm;進(jìn)樣量:2 μL。

1.2.6 液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)對純化組分進(jìn)行定性 參照張貴鋒[13]和高建萍[14]等人的方法。將收集的離子交換洗脫液和親和層析洗脫液經(jīng)過3000 Da和5000 Da的超濾離心管10000 r/min離心10 min。在100 ℃加熱處理10 min后進(jìn)行真空干燥,將干燥粉溶解在200 μL 0.05 mol/L NH4HCO3溶液中(pH8.0),再加入50 μL 1 μg/μL胰蛋白酶溶液(胰蛋白酶溶解在0.05 mol/L NH4HCO3,pH8.0),渦旋混合均勻,37 ℃加熱8 h得到酶解后的產(chǎn)物再用液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)分析。液質(zhì)聯(lián)用分析條件:選用的色譜柱為Zorbax SB C18(150 mm×2.1 mm);流動相 D液含 0.1% TFA的水溶液;流動性E液含0.1% TFA的乙腈;進(jìn)樣量50 μL。梯度設(shè)置0～10 min,10% E;10～70 min,10%～90% E;80～90 min,100% E。通過Turbosequest軟件進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索,從Swiss-Prot網(wǎng)站上下載包括馬鈴薯蛋白中已發(fā)現(xiàn)的全部蛋白質(zhì)氨基酸序列數(shù)據(jù)庫。檢索參數(shù)設(shè)置為:多肽質(zhì)荷比范圍設(shè)為m/z=300～2000;多肽的信號強(qiáng)度為1×105;多肽的分子量計算方式為單一同位素分子量;FASTA數(shù)據(jù)搜索格式;±1.5多肽質(zhì)量準(zhǔn)確度;±1.0碎片離子的質(zhì)量準(zhǔn)確度。陽性結(jié)果:當(dāng)多肽帶電荷數(shù)1時,Xcorr≥1.5,帶電荷數(shù)為2時,Xcorr≥2.0,帶電荷數(shù)為3時,Xcorr≥2.5,DeltaCn≥0.1。綜合考慮目標(biāo)離子色譜峰的信噪比以及二級質(zhì)譜圖b、y離子之間的匹配性和連續(xù)性。

1.2.7 純化樣品分子量測定 取1 μL樣品點(diǎn)靶,室內(nèi)自然風(fēng)吹干后取1 μLα-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)基質(zhì)溶液點(diǎn)靶,自然風(fēng)干。質(zhì)譜質(zhì)量數(shù)利用外標(biāo)法,并用標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物校正。以337 nm脈沖氮激光離子解析電離源,100 次/s激光脈沖次數(shù),20 kV離子加速電壓,m/z 600～4000范圍內(nèi)掃描[14]。

1.2.8 蛋白質(zhì)和碳水化合物含量測定 蛋白質(zhì)含量測定依照Bradford法[15],標(biāo)準(zhǔn)蛋白采用牛血清白蛋白;碳水化合物含量測定依照苯酚-硫酸法測定,標(biāo)準(zhǔn)單糖采用葡萄糖。

1.2.9 氣相色譜分析Patatin單糖組成 取10 mg Patatin置于安培管中,加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸,封管后120 ℃水解6 h。冷卻至室溫,減壓蒸干。加入約10 mg鹽酸羥胺及1 mL無水吡啶,90 ℃反應(yīng)30 min,冷至室溫,加入1 mL無水醋酸酐,90 ℃下反應(yīng)30 min,冷至室溫,再用氯仿萃取3次,每次1 mL,合并氯仿層,減壓抽干,置真空干燥箱減壓干燥24 h[16-17]。各種標(biāo)準(zhǔn)單糖的糖腈乙酰酯衍生物制備方法同上,分別進(jìn)行氣相色譜分析。采用日本島津GC-2010氣相色譜儀,氫火焰離子化檢測器,載氣N2流速為20 mL/min,氫氣流速為40 mL/min,空氣流速為450 mL/min,色譜柱為Rtx-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm),程序升溫,柱初溫180 ℃,恒溫3 min,升溫速率為5 ℃/min,終溫240 ℃,恒溫3 min,進(jìn)樣口溫度為280 ℃,檢測器溫度為250 ℃。

1.2.10 Patatin熱性能 通過示差掃描熱量計(DSC)測定蛋白熱穩(wěn)定性。精確稱量15 mg樣品放入樣品池,放置DSC儀器的樣品支持器上,調(diào)整好儀器,用空盒做對照。實(shí)驗采用的測定溫度范圍為0～200 ℃,加熱速度為10 ℃/min[18-19]。

1.2.11 紅外光譜 稱取干燥的Patatin 1 mg和100 mg KBr固體粉末在瑪瑙研缽中均勻研磨,用壓片機(jī)壓成薄片,用紅外分光光度計在4000～400 cm-1范圍進(jìn)行掃描[20]。

1.2.12 核磁共振 將10 mg Patatin溶解在1 mL D2O中,冷凍干燥交換3次。用0.5 mL D2O溶解后置于核磁管,于250 ℃核磁共振波譜儀測定其1H NMR和13C NMR[21-22]。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 12.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析;采用Origin8.0作圖,每個實(shí)驗重復(fù)三次,結(jié)果用平均數(shù)±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜層析

馬鈴薯濃縮蛋白經(jīng)過Q-Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱后得到兩個峰(見圖1)。收集的離子交換洗脫液(圖1中的洗脫峰),經(jīng)過濃縮后,直接上Con A-Sepharose 4B親和色譜柱,上樣后用緩沖液B平衡,收集穿透液。然后用含1 mol/L NaCl和1 mol/L葡萄糖酸酐20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)C洗脫吸附在介質(zhì)上的組分,收集洗脫液。

圖1 馬鈴薯濃縮蛋白離子交換色譜Fig.1 Ion exchange chromatography of potato concentrated protein

2.2 Patatin純度鑒定

收集的親和層析洗脫液經(jīng)過SDS-PAGE和Sephadex G-75凝膠過濾檢測,以判斷樣品的純度。通過SDS-PAGE分析可知,親和層析洗脫峰組分為單一組分,電泳顯示單一條帶,達(dá)到電泳純(圖2A)。

純品純度檢測一般要用兩種以上的方法檢測,因此選用凝膠過濾進(jìn)行驗證。通過Sephadex G-75凝膠過濾分析發(fā)現(xiàn)譜圖上出現(xiàn)一個細(xì)而尖的峰,通過峰面積估算,該組分的純度在90%以上(圖2B)。

圖2 Patatin的純度Fig.2 Homogeneity assays of purified patatin

2.3 純化樣品的組分鑒定

利用超濾和色譜分離相結(jié)合的方法對馬鈴薯汁水中的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離,通過SDS-PAGE初步判斷出親和層析洗脫峰蛋白質(zhì)主要集中在40 kDa左右。在此基礎(chǔ)上采用HPLC/MS與酶解技術(shù)相結(jié)合的方法對親和層析洗脫峰中的蛋白質(zhì)進(jìn)行識別。

圖3為親和層析洗脫峰中樣品經(jīng)過酶解、HPLC/MS分析的總離子流圖,質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用Turbosequest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索以識別洗脫峰中的組分。

圖3 洗脫峰的紫外色譜(A)和總離子流(B)Fig.3 Total ion chromatograms(TIC)of digested unbound fraction

表1結(jié)果表明,洗脫峰中蛋白質(zhì)主要為Patatin,并且含有多種亞基,分別為Patatin-01、Patatin-04/09、Patatin-3-Kuras 1、Patatin-03和Patatin-2-Kuras 3。Pots等[23]分離出的Patatin 具有兩種亞基,分子量分別為40.5 kDa和41.8 kDa。不同亞基類型的Patatin在氨基酸組成及排列順序方面有輕微差異,但卻具有相同的免疫和色譜性質(zhì),因此,通常將不同亞基類型的Patatin作為均一蛋白來進(jìn)行研究[24]。這一結(jié)果與SDS-PAGE和Sephadex G-75凝膠過濾檢測結(jié)果一致,表明該組分是均一物質(zhì),可進(jìn)一步結(jié)構(gòu)分析。

表1 親和層析洗脫峰組分識別結(jié)果Table 1 Identification of unbound fraction of affinity chromatography

2.4 馬鈴薯糖蛋白Patatin的分子量

通過MALDI-TOF-MS分析馬鈴薯糖蛋白Patatin的精確分子量,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,通過親和層析色譜純化得到的Patatin分子量為40.6 kDa,其多電荷亞基分子量分別為10.1、13.6、20.3 kDa。這個結(jié)果與HPLC-MS分析結(jié)果存在差異。Jorgensen等[25]通過MALDI-TOF-MS檢測純化出的Patatin分子量為41～42 kDa,通過肽指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)Patatin中含有三種亞基,分別為Pat2-K1、Pat3-K1和Pat1-K2,分子量約為40 kDa。同樣,與本文結(jié)果也存在差異。這可能與儀器的精密度有關(guān)系。另外,MALDI-TOF-MS圖中的峰分子量是通過標(biāo)尺手動標(biāo)上,所以存在一定的誤差。

圖4 馬鈴薯糖蛋白Patatin的分子量Fig.4 Molecular weight of potato glycoprotein Patatin

Liu等[26]從馬鈴薯塊莖中提取出的Patatin(45 kDa)分子量與本文報道的Patatin分子量(40.6 kDa)差異很大。這兩種Patatin可能是不同的亞基類型,馬鈴薯的品種以及提取方式不同可以引起亞基組成不同[23]。

2.5 馬鈴薯糖蛋白Patatin的理化性質(zhì)

2.5.1 馬鈴薯糖蛋白Patatin糖、蛋白質(zhì)含量、單糖組成分析 用苯酚-硫酸法測定糖蛋白Patatin中糖的含量約為32%,用Bradford法測定其蛋白質(zhì)含量約為64%,說明Patatin是糖和蛋白的復(fù)合物。

通過氣相色譜法分析Patatin的單糖組成。圖5為標(biāo)準(zhǔn)混合單糖和Patatin氣相色譜圖。在標(biāo)準(zhǔn)混合單糖中,1、2、3、4、5、6分別為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖;在Patatin樣品中1、2、3、4 分別為鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖。由圖5A可知,采用糖腈乙酰酯衍生化方法可以使一種單糖對應(yīng)一種衍生化產(chǎn)物,在本實(shí)驗條件下,可以將混合標(biāo)準(zhǔn)單糖較好的分離。圖5B是用同樣的衍生化方法并在相同的測定條件下得到Patatin水解衍生化產(chǎn)物的氣相色譜圖,從圖5B中可以看出,通過與標(biāo)準(zhǔn)混合單糖的保留時間比較可知,Patatin中可能含有四種單糖,分別為鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。對于Patatin的單糖組成,國內(nèi)沒有相關(guān)報道,國外僅有Racusen等人[2]通過紙層析法測得45 kDa Patatin主要單糖為甘露糖,正是由于甘露糖的出現(xiàn),使Patatin對甘露糖具有高度的親和力,使Patatin能夠吸附到Con A-Sepharose 介質(zhì)上。Tsukagoshi等[27]報道了從Coriolus versicolor中提取的PSK糖蛋白具有抗腫瘤活性,原因可能是它的結(jié)構(gòu)中包括的葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖和半乳糖發(fā)揮作用。研究Patatin中含有的單糖組分可為研究Patatin的生理活性提供理論依據(jù)。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)混合單糖(A)和Patatin(B)氣相色譜Fig.5 Gas chromatography spectrum of standard mixed monosaccharides(A)and patatin(B)

2.5.2 馬鈴薯糖蛋白Patatin的糖肽鍵特征 單糖與蛋白質(zhì)中某一肽段的連接是糖蛋白的重要結(jié)構(gòu)特征。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種連接方式,其中主要有兩類:一類是糖鏈與天冬酰胺連接,稱為N-連接糖肽鍵,另一類是與蘇氨酸和絲氨酸連接,成為O-連接糖肽鍵。β-消去反應(yīng)可以區(qū)分糖蛋白中的O-糖肽鍵和N-糖肽鍵。O-糖肽鍵在堿作用下易發(fā)生斷裂,而N-糖肽鍵相對比較穩(wěn)定。糖蛋白經(jīng)過堿處理后,與O-糖肽鍵連接的蘇氨酸生成α-氨基丁烯酸,絲氨酸生成α-氨基丙烯酸,形成的不飽和氨基酸在240 nm波長處的紫外吸收明顯增強(qiáng),在反應(yīng)體系中迅速加入硼氫化鈉還原劑,α-氨基丙烯酸會被還原成丙氨酸。因此,在β-消去反應(yīng)中,絲氨酸和蘇氨酸的含量減少,而丙氨酸和α-氨基丁酸的含量,減少和增加之間有一定的聯(lián)系[17-18]。

圖6為Patatin經(jīng)過NaOH溶液處理前后的紫外吸收光譜。Patatin經(jīng)過β-消去反應(yīng)后,糖鏈被消去,235 nm處吸光度明顯增加。說明馬鈴薯糖蛋白Patatin糖肽鍵為O-連接糖肽鍵。

圖6 β-消去反應(yīng)前后Patatin的紫外光譜Fig.6 UV spectra of patatin before and after β-eliminate reaction

2.5.3 馬鈴薯糖蛋白Patatin的熱穩(wěn)定性 蛋白質(zhì)在加熱過程中,內(nèi)部氫鍵斷裂,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子伸展,在分子伸展過程中需要吸收熱能,這種現(xiàn)象被稱為熱變性。蛋白質(zhì)的熱變性和可能影響蛋白質(zhì)生理活性的空間構(gòu)象的變化有緊密的關(guān)系。DSC可以反映蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象變化,熱穩(wěn)定性與生理功能之間的關(guān)系及熱變性原因等信息,被廣泛用于蛋白質(zhì)的熱變性研究中[28]。因此,通過測定β-消去反應(yīng)前后糖蛋白Patatin的DSC,可以確定糖鏈對其抗熱變性功能的影響強(qiáng)弱。

糖蛋白Patatin的熱變性最高溫度為74.97 ℃,經(jīng)過β-消去反應(yīng)后,其熱變性最高溫度降低為66.98 ℃(表2)。β-消去反應(yīng)使糖鏈釋放,導(dǎo)致熱變性溫度明顯降低,說明糖鏈對Patatin穩(wěn)定性起到重要作用,并且糖鏈的存在可以提高Patatin的抗變性能力。

表2 Patatin(A)和β-消去反應(yīng)后Patatin(B)的DSC結(jié)果Table 2 The result of DSC on patatin(A) and Patatin treatmented by β-elimination(B)

2.5.4 馬鈴薯糖蛋白Patatin的核磁共振(NMR)分析 Patatin的13C NMR和1H NMR如圖7所示。呋喃型醛糖的C-4和呋喃型酮糖C-5在δ 82.00～84.00 ppm 范圍內(nèi)有信號,這個原則用于區(qū)別呋喃糖和吡喃糖構(gòu)型。在圖7A中,δ 82.00～84.00 ppm內(nèi)沒有信號,說明Patatin為吡喃構(gòu)型。一般來說,吡喃糖的α構(gòu)型在δ 90.00～102.00 ppm有信號,β構(gòu)型在δ 102.00～112.00 ppm有信號,Patatin在101.29 ppm出現(xiàn)信號峰,表明其糖苷鍵構(gòu)型為α-型,進(jìn)一步證明了Patatin糖苷鍵主要類型為α-型吡喃糖[29-30],與紅外圖譜分析結(jié)果一致。

在圖7B中,質(zhì)子信號對應(yīng)不同的糖殘基。δ 5.18、δ 5.09、δ 4.98、δ 4.53 ppm分別對應(yīng)H-1的α-(1→3)甘露糖,α-(1→4)半乳糖,β-(1→4)葡萄糖和α-(1→2)鼠李糖。許多文獻(xiàn)已經(jīng)報道[31],單糖組成和糖苷鍵類型可能與糖蛋白的抗腫瘤活性相關(guān)。

圖7 馬鈴薯糖蛋白Patatin的13C NMR譜(A)和1H NMR譜(B)Fig.7 13C NMR spectra of Patatin(A) and1H NMR spectra of Patatin(B)

3 結(jié)論

通過離子交換和親和層析分離技術(shù)相結(jié)合的工藝技術(shù)對馬鈴薯濃縮蛋白進(jìn)行純化,得到馬鈴薯糖蛋白Patatin。經(jīng)過SDS-PAGE和Sephadex G-75凝膠過濾檢測,親和層析洗脫峰組分的純度在90%以上。MALDI-TOF-MS鑒定該組分是分子量為40.6 kDa的Patatin。Patatin為糖和蛋白質(zhì)的復(fù)合物,其單糖組成為:鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖;Patatin中含有α-糖苷鍵,糖苷類型為吡喃型;Patatin經(jīng)過β-消去反應(yīng)前后的紫外光譜測定表明:糖鏈和肽鏈之間由O-型糖肽鍵連接。Patatin的熱變性溫度為74.97 ℃,經(jīng)過β-消去反應(yīng)后,熱變性溫度為66.98 ℃。

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Study on purification and structure of Patatin from potato starch juice

SUN Ying1,WEI Dong-xu2,YAO Chun-yan3,JIANG Lian-zhou4

(1.College of Tourism and Culinary Science,Harbin University of Commerce,Harbin 150000,China;2.Technical Centre of Heilongjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Harbin 150001,China;3.College of Economics,Harbin University of Commerce,Harbin 150000,China;4.College of food,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Potato glycoprotein(patatin)was obtained by separating and purifying the potato starch juice. The results showed that the purity of patatin was above 90% and the molecular weight was 40.6 kDa. Furthermore,the monosaccharide composition included rhamnose,mannose,glucose and galactose. Moreover,the carbohydrate chain of patatin was connected to protein by O-glycopeptide linkages and denaturation temperature of patatin was 75 ℃.

potato starch juice;Patatin;purification;structure

2016-11-18

孫瑩(1982-)，女，博士，講師，研究方向：植物蛋白質(zhì)的功能性，E-mail:sunying625@163.com。

黑龍江省自然科學(xué)基金項目(C2015067)；哈爾濱商業(yè)大學(xué)博士科研啟動項目(15RW19);哈爾濱商業(yè)大學(xué)青年人才支持項目(2016QN060)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)11-0122-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.015